意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜亞硒酸鈉添加水平

蘇中渠，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，王紅芳，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

意大利蜜蜂工蜂幼蟲飼糧的適宜亞硒酸鈉添加水平

蘇中渠，張衛(wèi)星，郗學(xué)鵬，王紅芳，胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安 271018）

【目的】探索意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）工蜂幼蟲日糧的適宜亞硒酸鈉水平，為意大利蜜蜂工蜂幼蟲發(fā)育階段硒的營養(yǎng)需要提供依據(jù)。【方法】共取1 440只1日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲并平均分為兩批，每批720只，一批用于化蛹率、羽化率的測定，一批用于理化指標和分子指標的測定。兩批幼蟲均按單因素完全隨機設(shè)計分成6組，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗組分別飼喂亞硒酸鈉添加量為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1的日糧，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)24只幼蟲。取3、5、7日齡幼蟲測定體重、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活性，取5日齡幼蟲測定硒磷酸合成酶（selenide water dikinase，SelD）、絲氨酰-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRs）、SECIS-結(jié)合蛋白1（SECIS-binding protein 1，Sbp1）、SECIS-結(jié)合蛋白2（SECIS-binding protein 2，Sbp2）基因表達量；7日齡時統(tǒng)計化蛹率?！窘Y(jié)果】與對照組相比，日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2—0.6 mg·kg-1時顯著提高了幼蟲的T-AOC（P＜0.05），日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2—0.8 mg·kg-1時顯著提高了幼蟲的T-SOD活性（P＜0.05），各試驗組均顯著降低了幼蟲的MDA含量（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.4 mg·kg-1時幼蟲的PO活性顯著高于對照（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.6 mg·kg-1時5日齡幼蟲的SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達水平顯著高于對照（P＜0.05）。日糧添加亞硒酸鈉水平為0.4 mg·kg-1時幼蟲化蛹前體重顯著高于對照（P＜0.05）。與對照組相比，日糧添加亞硒酸鈉水平為0.2 mg·kg-1時，幼蟲化蛹率顯著提高（P＜0.05）。【結(jié)論】人工飼養(yǎng)條件下基礎(chǔ)日糧硒水平為0.21 mg·kg-1時，根據(jù)幼蟲化蛹前體重、化蛹率做擬合曲線得出意大利蜜蜂工蜂幼蟲日糧適宜亞硒酸鈉添加水平為0.24—0.33 mg·kg-1，即意大利蜜蜂工蜂幼蟲的適宜硒水平為0.32—0.36 mg·kg-1。

意大利蜜蜂；工蜂幼蟲；亞硒酸鈉；適宜添加水平

0 引言

【研究意義】在昆蟲生理學(xué)中硒被認為具有重要作用［1］。研究表明硒元素是對生長、發(fā)育、抗癌和免疫都有作用的重要微量元素［2-3］，因此，研究蜜蜂對硒的營養(yǎng)需要量對蜜蜂的健康養(yǎng)殖具有重要意義。【前人研究進展】國內(nèi)外大量研究表明，畜禽及昆蟲日糧添加硒對機體具有有益影響。ROTRUCK等［4］證明硒在細胞抗氧化作用中占據(jù)重要地位；MARTINROMERO等［5］發(fā)現(xiàn)用含硒量10 nmol·L-1—1 μmol·L-1的培養(yǎng)基飼養(yǎng)果蠅，其存活率比對照組提高約一倍，并且日糧添加硒能顯著提高果蠅繁殖能力。同時，有研究認為硒攝入不足會降低鱗翅目幼蟲的免疫力［6］，而酚氧化酶與蜜蜂的免疫密切相關(guān)［7］，可作為蜜蜂免疫的重要指標。另外，在特定時期，硒對蠶幼蟲的生長及生理狀態(tài)均有益［8］。富硒食物飼養(yǎng)的黃粉蟲可抵抗更低的溫度［9］。硒蛋白是硒元素在機體內(nèi)發(fā)揮功能的關(guān)鍵，ALLMANG等［10］描述的真核生物硒代謝通路中絲氨酰-tRNA合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRs）、硒磷酸合成酶（selenide water dikinase，SelD）、SECIS-結(jié)合蛋白2（SECIS-binding protein 2，Sbp2）基因在合成硒蛋白的過程中起重要作用。SerRs的作用是合成tRNASer，tRNASer是合成tRNASec的前體物質(zhì)；SelD是Sec-tRNASec的組成部分；Sbp2是硒蛋白合成過程中的關(guān)鍵蛋白，作用是與硒蛋白mRNA上的SECIS片段以及核糖體結(jié)合，并且其N端被預(yù)測有核定位信號，能穿梭核質(zhì)［11-18］。SECIS-結(jié)合蛋白1（SECIS-binding protein 1，Sbp1）在人類研究中上被認為是抑癌作用的重要載體，但在昆蟲中的作用尚不明確?！颈狙芯壳腥朦c】意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）是國際飼養(yǎng)最廣泛的西方蜜蜂亞種，目前，硒對意大利蜜蜂的營養(yǎng)作用研究較少，其幼蟲對硒的營養(yǎng)需要更是未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究日糧硒水平對意大利蜜蜂幼蟲抗氧化能力、免疫性能、硒蛋白合成相關(guān)基因表達水平、化蛹前體重以及化蛹率的影響，探明意大利蜜蜂工蜂幼蟲日糧亞硒酸鈉的適宜添加水平。

1 材料與方法

試驗用意大利蜜蜂蜂群飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗蜂場，試驗用幼蟲的飼養(yǎng)及生理生化指標的測定均于2015年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院完成。

1.1 試驗材料

1 日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲和新鮮蜂王漿取自山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗蜂場。亞硒酸鈉（AR級，貨號1021133）由西亞試劑公司提供。

1.2 試驗設(shè)計與日糧配方

選取蜂王遺傳背景相似、群勢相當?shù)姆淙鹤鳛榻忝猛跞?，在姐妹王群中共? 440只1日齡蜜蜂幼蟲，720只用于化蛹率、羽化率的測定，另外720只用于酶活性測定。試驗幼蟲均按單因素完全隨機設(shè)計分別分成6組。日糧中添加的亞硒酸鈉水平分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)24只。對照組參照VANDENBERG等［19］的配方配制基礎(chǔ)日糧，試驗組在其基礎(chǔ)上添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·kg-1的亞硒酸鈉，幼蟲飼糧組成見表1。

表1 幼蟲日糧配方Table1 Compositions of larval recipe

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗前向巢箱內(nèi)靠近蜂王巢脾的位置放入1張空脾，將蜂王限制在此位置產(chǎn)卵。12—18 h后提出加入的空脾并檢查產(chǎn)卵情況，產(chǎn)卵量符合要求即可提入繼箱進行孵化，卵期一般為3 d。第4天將孵化的1日齡幼蟲用移蟲針移至預(yù)熱好的加入了200 μL飼糧的人工王臺內(nèi)，飼養(yǎng)于溫度34.5℃，相對濕度95%的恒溫培養(yǎng)箱中，每天更換日糧。飼養(yǎng)至第6天末或第7天初的時候，幼蟲開始直立或排便。將其轉(zhuǎn)移至提前放置好滅菌王臺的24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)準備化蛹。蛹期溫度34.5℃，相對濕度為75%。

1.4 測定指標

1.4.1 幼蟲抗氧化酶活性 將取出的3、5、7日齡的幼蟲，按質(zhì)量體積比制備成10%的組織勻漿，4℃離心機2 500 r/min離心10 min，吸取上清。制備1%的組織勻漿，黃嘌呤氧化法測定總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）；10%的組織勻漿用Fe3+還原法測定總抗氧化能力（T-AOC），硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA），試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，使用UV-2450紫外分光光度計測定。

1.4.2 幼蟲酚氧化酶 隨機取5日齡和7日齡的幼蟲，每組5個重復(fù)，用毛細管取其血淋巴共40 μL，加入少許苯基硫脲（防止血淋巴氧化），-80℃保存。測定時取出化凍離心，雙抗體夾心法測定酚氧化酶（PO）水平，試劑盒購自上海郎頓生物技術(shù)有限公司，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度。

1.4.3 5日齡幼蟲SerRs、SelD、Sbp1、Sbp2基因表達水平 隨機取5日齡幼蟲，采用在低溫條件下用全自動樣品快速破碎儀進行組織破碎，使用Total RNA Kit試劑盒（OMEGA，USA）提取蜜蜂總RNA，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Roche，USA）將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存待用。參照FastStart Universal SYBR Green Master（Roche，USA）試劑盒的說明書配置20 μL體系，ABI 7500系統(tǒng)測定目的基因的相對表達量。定量引物的設(shè)計及合成均由上海生工生物有限公司完成，引物信息見表2。

表2 基因引物序列Table2 Sequences of gene primers

1.4.4 幼蟲體重 每組隨機取3、5、7日齡的幼蟲放入已稱重的1.5 mL離心管內(nèi)，電子天平稱重（精確至0.0001 g），計算幼蟲體重，每組5個重復(fù)，之后樣品存于-80℃冰箱，用于后續(xù)指標測定。

1.4.5 化蛹率 用于測定此指標的幼蟲從第1天飼養(yǎng)至第7天的過程中每天檢查記錄幼蟲的生長狀況，將已死亡個體移出，記錄至全部化蛹為止，根據(jù)存活個體計算幼蟲化蛹率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SAS9.2軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用Duncan氏法，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，數(shù)據(jù)均用“mean±SD”的格式表示。

表3 飼糧亞硒酸鈉添加水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲總抗氧化能力的影響Table3 Effects of diets sodium selenite supplementation on the T-AOC of A. m. ligustica worker larval

表4 飼糧亞硒酸鈉添加水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲總超氧化物歧化酶活力的影響Table4 Effects of diets sodium selenite supplementation on the T-SOD activities of A. m. ligustica worker larval

2 結(jié)果

2.1 飼糧亞硒酸鈉水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲抗氧化能力的影響

2.1.1 對工蜂幼蟲總抗氧化能力的影響 日糧添加0.2—1.0 mg·kg-1亞硒酸鈉對3日齡幼蟲的總抗氧化能力（T-AOC）均有提高的作用（P＜0.05），且隨著添加水平的增加3日齡幼蟲的T-AOC呈上升趨勢，其中添加1.0 mg·kg-1亞硒酸鈉時，3日齡幼蟲的T-AOC最高（P＜0.05），0.8 mg·kg-1添加組次之，0.2、0.4、0.6 mg·kg-1的試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）；5日齡幼蟲的T-AOC隨著亞硒酸鈉添加水平的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，添加0.4 mg·kg-1的試驗組T-AOC顯著高于各試驗組及對照組（P＜0.05），添加0.2和0.6 mg·kg-1的組次之，二者差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于對照組（P＜0.05），0.8和1.0 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05），顯著低于對照組（P＜0.05）（表3）。

2.1.2 對工蜂幼蟲總超氧化物歧化酶活力的影響添加水平為0.2 、0.4 、0.6、0.8 mg·kg-1的試驗組提高了3日齡幼蟲的總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性，顯著高于對照組和添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05），添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。5、7日齡幼蟲與3日齡結(jié)果一致（表4）。

2.1.3 對工蜂幼蟲丙二醛含量的影響 日糧亞硒酸鈉水平顯著地影響了3、5、7日齡幼蟲的丙二醛（MDA）含量（P＜0.05）。3日齡幼蟲對照組MDA含量顯著高于各試驗組（P＜0.05），添加水平為0.4、0.6、0.8 mg·kg-1的試驗組MDA含量差異不顯著（P＞0.05），顯著低于硒添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05），0.2 mg·kg-1的試驗組與添加水平為0.4、0.6 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05），顯著高于添加水平為0.8 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05）；5日齡幼蟲對照組MDA含量顯著高于各試驗組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.4、0.6 mg·kg-1的試驗組MDA含量顯著低于添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05），3個添加水平間差異不顯著（P＞0.05），添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗組MDA含量顯著低于添加水平為0.8 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05）；7日齡幼蟲對照組MDA含量顯著地高于各試驗組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.4 mg·kg-1的試驗組MDA含量顯著低于添加水平為0.8、1.0 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05），與添加水平為0.6 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05）（表5）。

表5 飼糧亞硒酸鈉添加水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲丙二醛含量的影響Table5 Effects of diets sodium selenite supplementation on the MDA content of A. m. ligustica worker larval

2.2 飼糧亞硒酸鈉水平對5、7日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲免疫能力的影響

日糧亞硒酸鈉水平顯著地影響了5、7日齡幼蟲的酚氧化酶（PO）活性（P＜0.05）。幼蟲生長至5日齡時，添加水平為0.6 mg·kg-1的試驗組PO活性最高，1.0 mg·kg-1的試驗組PO活性最低，添加水平為0.8 mg·kg-1的組顯著低于0.2和0.4 mg·kg-1組（P＜0.05），但與對照組差異不顯著（P＞0.05）；7日齡幼蟲添加水平為0.4 mg·kg-1的組PO活性顯著高于其余各組（P＜0.05），添加水平0.2和0.6 mg·kg-1的組顯著高于0.8 mg·kg-1的組（P＜0.05），但與對照差異不顯著（P＞0.05），1.0 mg·kg-1的組PO活性最低（表6）。

表6 飼糧亞硒酸鈉添加水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲酚氧化酶活性的影響Table6 Effects of diets sodium selenite supplementation on the PO activity of A. m. ligustica worker larval

2.3 飼糧亞硒酸鈉水平對5日齡意大利蜜蜂工蜂幼蟲SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達水平的影響

隨著亞硒酸鈉添加水平的增加，對5日齡幼蟲SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達量有顯著影響（P＜0.05）。各試驗組的SelD基因與對照組表達量差異顯著（P＜0.05），添加量為0.2 mg·kg-1的組顯著低于其余試驗組（P＜0.05），其余各組間差異不顯著（P＞0.05）；各試驗組Sbp2基因總體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，1.0 mg·kg-1的組顯著高于除0.6 mg·kg-1的其余試驗組（P＜0.05），0.6 mg·kg-1的試驗組顯著高于對照組（P＜0.05），與0.4 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05），對照組與0.2、0.4和0.8 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05）；0.6 mg·kg-1的試驗組SerRs基因顯著高于除0.4和1.0 mg·kg-1的其余各試驗組（P＜0.05），除0.4 mg·kg-1以外其余各試驗組與對照差異不顯著（P＞0.05）；0.6 mg·kg-1的試驗組Sbp1基因顯著高于其余試驗組（P＜0.05），對照組與0.8和1.0 mg·kg-1的試驗組差異不顯著（P＞0.05），顯著低于0.2和0.4 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05）（圖1）。

2.4 飼糧亞硒酸鈉水平對意大利蜜蜂工蜂幼蟲體重的影響

幼蟲飼糧亞硒酸鈉水平對3、5、7日齡幼蟲體重有顯著影響（P＜0.05）。亞硒酸鈉添加水平為0.2 mg·kg-1的試驗組3日齡幼蟲體重顯著高于添加1.0 mg·kg-1試驗組（P＜0.05），對照組與各試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。幼蟲生長至5日齡后，隨著添加水平的提高，幼蟲體重呈現(xiàn)出先上升后下降的總體趨勢，0.2 mg·kg-1的試驗組體重顯著高于對照組和其余各試驗組（P＜0.05），0.4 mg·kg-1的試驗組與對照組差異不顯著（P＞0.05），其余各試驗組顯著低于對照（P＜0.05）。幼蟲飼糧亞硒酸鈉水平對7日齡幼蟲體重影響顯著（P＜0.05），添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗組體重顯著高于空白組和其他試驗組（P＜0.05），添加水平為0.2、0.6 mg·kg-1的試驗組對照組體重與差異不顯著（P＞0.05），顯著高于添加水平為0.8 mg·kg-1試驗組（P＜0.05），添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組體重最低（圖2）。

2.5 飼糧亞硒酸鈉水平對意大利蜜蜂工蜂化蛹率的影響

幼蟲飼糧亞硒酸鈉水平對化蛹率有顯著的影響（P＜0.05）。硒添加水平為0.2 mg·kg-1的試驗組顯著高于對照組（P＜0.05）。對照組與亞硒酸鈉添加水平為0.4 mg·kg-1的試驗組化蛹率差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于添加水平為0.6和0.8 mg·kg-1的試驗組（P＜0.05），硒添加水平為1.0 mg·kg-1的試驗組不能成功化蛹（圖3）。

圖1 5日齡幼蟲SelD、SerRs、Sbp1、Sbp2基因表達水平Fig. 1 SelD， SerRs， Sbp1， Sbp2 genes expression levels of 5-day-old larvae

圖2 不同日齡幼蟲體重Fig. 2 The body weight of different days larvae

圖3 幼蟲化蛹率Fig. 3 The pupation rate of larvae

3 討論

3.1 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對幼蟲抗氧化性的影響

機體抗氧化能力的強弱與健康程度有著密切的聯(lián)系，而硒可以影響動物機體的抗氧化能力。T-AOC可反映機體總抗氧化能力的強弱；T-SOD可消除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷；MDA反映機體脂質(zhì)過氧化物含量。硒是硒蛋白谷胱甘肽過氧化酶（glutathione-peroxidase，GSH-PX）活性中心的重要組成部分，缺硒會導(dǎo)致GSH-PX活性降低及合成受阻，本試驗沒能測定出蜜蜂幼蟲體內(nèi)的GSH-PX，原因可能是蜜蜂幼蟲體內(nèi)GSH-PX含量較低，不在所用試劑盒（南京建成）測定范圍內(nèi)。本試驗結(jié)果與張艷艷等［20］所測的結(jié)果一致，動物缺硒會使機體合成抗氧化酶的能力下降，從而使機體脂質(zhì)過氧化增強，導(dǎo)致自由基水平和MDA含量升高［21］。隨著硒含量的添加，機體MDA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，這是因為機體添加適量硒后抗氧化性逐漸增強，清除氧自由基的能力提升，MDA含量下降；而當硒過量后，硒取代蛋白質(zhì)內(nèi)的硫元素，對機體產(chǎn)生毒性作用，降低機體抗氧化性，MDA含量上升。

本研究表明，日糧添加硒可以提高意大利蜜蜂幼蟲的總抗氧化能力以及SOD活力，同時降低了機體的MDA含量，這說明日糧添加硒可能影響到了其GSH-PX的活性與合成。

3.2 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對幼蟲免疫性能的影響

PO是昆蟲體內(nèi)重要的酶，其生成的活性物質(zhì)是微生物細胞破壞作用的重要部分［22-24］，且其在昆蟲的體液和細胞免疫中具有重要作用，該酶主要參與昆蟲的表皮硬化、微生物黑化包被［25］以及傷口的愈合過程。

王寶維等［26］發(fā)現(xiàn)硒可以促進鵝免疫器官的生長，增強機體免疫；林玉才等［27］的研究指出硒缺乏會導(dǎo)致雛雞免疫器官發(fā)育不良，機體免疫功能下降。硒攝入不足對鱗翅目幼蟲具有抑制免疫的作用，可以提升機體感染微生物的概率，而微生物感染與昆蟲體內(nèi)的PO活性密切相關(guān)［5］。本研究表明，日糧添加適量硒可以顯著提高意大利蜜蜂幼蟲的酚氧化酶活性，說明硒可以增強幼蟲免疫能力，保證機體的健康生長。

3.3 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對幼蟲SerRs、SelD、Sbp1、Sbp2基因表達水平的影響

本研究表明，隨著硒水平的升高，SerRs水平也升高，0.6 mg·kg-1的時候表達量達到最高；而SelD基因表達量也是隨著硒水平的增大升高，0.4 mg·kg-1表達量最高；Sbp2的表達量隨著硒添加量的增加一直在升高，添加1.0 mg·kg-1的組有最高表達量，說明蜜蜂合成硒蛋白所用通路可能與古生菌、哺乳動物的硒代謝通路有相似之處，均會用到絲氨酸的tRNA作為Sec-tRNASec的前體物質(zhì)，且SelD與Sbp2均參與了意大利蜜蜂工蜂幼蟲體內(nèi)硒蛋白的合成。Sbp1隨著硒添加水平的增加也在增加，在0.6 mg·kg-1時達到最大值，但其對意大利蜜蜂工蜂幼蟲的作用目前尚不明了，試驗結(jié)果與果蠅上類似［5］。

3.4 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對幼蟲體重的影響

黎觀紅等［28］發(fā)現(xiàn)日糧硒添加水平為0.10—0.50 mg·kg-1時可以顯著提高泰和烏骨雞的日增重及降低料重比；王寶維等［26］發(fā)現(xiàn)日糧添加硒源可以提高鵝各階段的體增重；CANTOR等［29］研究表明日糧添加硒代蛋氨酸或亞硒酸鈉可提高4周齡火雞的體重和采食量，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系；張艷艷等［20］的研究發(fā)現(xiàn)2—3月齡的生長肉兔日糧內(nèi)添加0.15 mg·kg-1的硒后可增加其平均日增重。

幼蟲階段是蜜蜂生長發(fā)育過程中的重要階段，而幼蟲體重可直觀地反映出幼蟲的生長發(fā)育速度。本研究表明，添加適量的亞硒酸鈉可以促進幼蟲的生長，但當添加量高于0.4 mg·kg-1后幼蟲體重顯著降低，說明硒在蜜蜂體內(nèi)存在劑量效應(yīng)。添加0.6 mg·kg-1亞硒酸鈉的試驗組5日齡幼蟲體重與對照差異顯著，而7日齡差異不顯著的原因可能是因為硒對昆蟲的毒性有延遲發(fā)育的作用，如煙芽夜蛾（Heliothis virescens）［30］和蛆癥異蚤蠅（Megaselia scalaris）［31］，至第7天此組可能才完成正常發(fā)育。

3.5 飼糧內(nèi)的亞硒酸鈉水平對幼蟲化蛹率的影響

昆蟲需要硒這種微量營養(yǎng)素來完善其多樣的生活史參數(shù)［5］?；悸屎陀鸹首鳛槔ハx變態(tài)發(fā)育的過程，是直接反應(yīng)幼蟲發(fā)育狀況的重要指標。本研究表明，添加適量的亞硒酸鈉可在一定程度上提高幼蟲的化蛹率，而硒添加量高于0.4 mg·kg-1的試驗組化蛹率顯著降低，甚至不能化蛹，這與HLADUN等［32］的結(jié)果有相似之處，原因是當日糧硒過量后，硒可以取代像半胱氨酸和胱氨酸這類含硫氨基酸內(nèi)的硫并影響蛋白質(zhì)折疊，從而擾亂細胞代謝并導(dǎo)致畸形，導(dǎo)致個體發(fā)育受到影響。

4 結(jié)論

人工飼養(yǎng)基礎(chǔ)日糧硒水平為0.21 mg·kg-1條件下，幼蟲飼糧硒水平的不同可影響幼蟲抗氧化性、免疫性能、硒蛋白合成相關(guān)基因表達量化蛹率、化蛹前體重、化蛹率，且以亞硒酸鈉為硒源時，通過對幼蟲化蛹前體重、化蛹率做擬合曲線，得出亞硒酸鈉適宜添加水平為0.24—0.33 mg·kg-1，亦即硒的適宜添加水平為0.32—0.36 mg·kg-1。

［1］ GOLUBKINA N， SHESHNITSAN S， KAPITALCHUK M. Ecological importance of insects in selenium biogenic cycling. International Journal of Ecology， 2014， 2014: Article ID 835636.

［2］ BECK M A， JEAN H， LEVANDER O A. Host nutritional status: the neglected virulence factor. TRENDS in Microbiology， 2004， 12（9）: 417-423.

［3］ ELLIS D R， SALT D E. Plants， selenium and human health. Current Opinion in Plant Biology， 2003， 6（3）: 273-279.

［4］ ROTRUCK J T， POPE A L， GANTHER H E， SWANSON A B，HAFEMAN D G， HOEKSTRA W G. Selenium: biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science， 1973， 179（4073）: 588-590.

［5］ MARTIN-ROMERO F J， KRYUKOV G V， LOBANOV A V，CARLSON B A， LEE B J， GLADYSHEV V N， HATFIELD D L. Selenium metabolism in Drosophila: selenoproteins， selenoprotein mRNA expression， fertility， and mortality. The Journal of Biological Chemistry， 2001， 276（32）: 29798-29804.

［6］ POPHAM H J R， SHELBY K S， POPHAM T W. Effect of dietaryselenium supplementation on resistance to baculovirus infection. Biological Control， 2005， 32（3）: 419-426.

［7］ LAUGHTON A M， BOOTS M， SIVA-JOTHY M T. The ontogeny of immunity in the honey bee， Apis mellifera L. following an immune challenge. Journal of Insect Physiology， 2011， 57（7）: 1023-1032.

［8］ VIJAYA A， RAO B， SMITHA S. Effects of selenium on the physiology of heart beat， oxygen consumption and growth in silkworm Bombyx mori L. American-Eurasian Journal of Toxicological Sciences，2010， 2（4）: 215-219.

［9］ AUDAS A， HOGAN G R， RAZNIAK H. Incubation temperature as a modifying factor on survival of Tenebrio molitor reared in selenium-containing media. Journal of Toxicology & Environmental Health， 1995， 44（1）: 115-122.

［10］ ALLMANG C， WURTH L， KROL A. The selenium to selenoprotein pathway in eukaryotes: More molecular partners than anticipated. Biochimica et Biophysica Acta General Subjects， 2009， 1790（11）: 1415-1423.

［11］ COPELAND P R， DRISCOLL D M. Purification， redox sensitivity，and RNA binding properties of SECIS-binding protein 2， a protein involved in selenoprotein biosynthesis. The Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（36）: 25447-25454.

［12］ COPELAND P R， FLETCHER J E， CARLSON B A， HATFIELD D L，DRISCOLL D M. A novel RNA binding protein， SBP2， is required for the translation of mammalian selenoprotein mRNAs. The EMBO Journal， 2000， 19（2）: 306-314.

［13］ LESCURE A， ALLMANG C， YAMADA K， CARBON P， KROL A. cDNA cloning， expression pattern and RNA binding analysis of human selenocysteine insertion sequence （SECIS） binding protein 2. Gene， 2002， 291（1/2）: 279-285.

［14］ COPELAND P R， STEPANIK V A， DRISCOLL D M. Insight into mammalian selenocysteine insertion: domain structure and ribosome binding properties of Sec insertion sequence binding protein 2. Molecular & Cellular Biology， 2001， 21（5）: 1491-1498.

［15］ KINZY S A， CABAN K， COPELAND P R. Characterization of the SECIS binding protein 2 complex required for the co-translational insertion of selenocysteine in mammals. Nucleic Acids Research， 2005，33（16）: 5172-5180.

［16］ CABAN K， KINZY S A， COPELAND P R. The L7Ae RNA binding motif is a multifunctional domain required for the ribosome-dependent Sec incorporation activity of Sec insertion sequence binding protein 2. Molecular & Cellular Biology， 2007， 27（18）: 6350-6360.

［17］ BUBENIK J L， DRISCOLL D M. Altered RNA binding activity underlies abnormal thyroid hormone metabolism linked to a mutation in selenocysteine insertion sequence-binding protein 2. The Journal of Biological Chemistry， 2007， 282（48）: 34653-34662.

［18］ DONOVAN J， CABAN K， RANAWEERA R， GONZALEZ-FLORES J N， COPELAND P R. A novel protein domain induces high affinity selenocysteine insertion sequence binding and elongation factor recruitment. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（50）: 35129-35139.

［19］ VANDENBERG J D， SHIMANUKI H. Technique for rearing worker honeybees in the laboratory. Journal of Apicultural Research， 1987，26（2）: 90-97.

［20］ 張艷艷， 李福昌. 日糧不同硒水平對2～3月齡肉兔生長性能、抗氧化指標和肉質(zhì)的影響. 動物營養(yǎng)學(xué)報， 2010， 22（1）: 82-87.

ZHANG Y Y， LI F C. Effects of different dietary selenium levels on growth performance， antioxidant indices and meat quality of meat rabbits from 2 to 3 months of age. Journal of Animal Nutrition， 2010，22（1）: 82-87. （in Chinese）

［21］ 高銘宇， 楊鷹， 袁莉， 劉欣， 楊保收， 金久善， 陳越. 硒和鋅相互作用及對肉用雞胰腺抗氧化功能的影響.中國獸醫(yī)科技， 2001， 31（4）: 23-26.

GAO M Y， YANG Y， YUAN L， LIU X， YANG B S， JIN J S， CHEN Y. Interaction between selenium and zinc and the effect on pancreas antioxidant function of broiler. Chinese Journal of Veterinary Science and Technology， 2001， 31（4）: 23-26. （in Chinese）

［22］ ZHAO P， LI J， WANG Y， JIANG H. Broad-spectrum antimicrobial activity of the reactive compounds generated in vitro by Manduca sexta phenoloxidase. Insect Biochemistry & Molecular Biology， 2007，37（9）: 952-959.

［23］ KAN H， KIM C H， KWON H M， PARK J W， ROH K B， LEE H，PARK B J， ZHANG R， ZHANG J， S?DERH?LL K， HA N C， LEE B L. Molecular control of phenoloxidase-induced melanin synthesis in an insect. The Journal of Biological Chemistry， 2008， 283（37）: 25316-25323.

［24］ CERENIUS L， BABU R， S?DERH?LL K， JIRAVANICHPAISAL P. In vitro effects on bacterial growth of phenoloxidase reaction products. Journal of Invertebrate Pathology， 2010， 103（1）: 21-23.

［25］ HUANG L H， CHRISTENSEN B M， CHEN C C. Molecular cloning of a second prophenoloxidase cDNA from the mosquito Armigeres subalbatus: prophenoloxidase expression in blood-fed and microfilariae-inoculated mosquitoes. Insect Molecular Biology， 2001，10（1）: 87-95.

［26］ 王寶維， 王娜， 葛文華， 岳斌， 張名愛， 史雪萍. 不同硒源對鵝早期生產(chǎn)性能、屠宰性能、肉品質(zhì)、肌肉常規(guī)養(yǎng)分、免疫與抗氧化功能的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（14）: 3016-3026.

WANG B W， WANG N， GE W H， YUE B， ZHANG M A， SHI X P. Effects of different selenium sources on production performance，slaughter performance， meat quality， immune and antioxidant in the early goose. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（14）: 3016-3026. （in Chinese）

［27］ 林玉才， 楊顆粒， 武瑞. 硒缺乏對雛雞免疫器官生長發(fā)育的影響.黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2010（9）: 115-116.

LIN Y C， YANG K L， WU R. Effect of lacking selenium on chickens of the immunologic organs’ growing. Heilongjiang Journal of Animal Science and Veterinary Medicine， 2010（9）: 115-116. （in Chinese）

［28］ 黎觀紅， 徐海燕， 許蘭姣， 瞿明仁， 游金明， 易中華， 潘珂. 日糧硒添加水平對泰和烏骨雞生產(chǎn)性能及組織黑色素含量的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 44（13）: 2777-2786.

LI G H， XU H Y， XU L J， QU M R， YOU J M， YI Z H， PAN K. Effects of dietary selenium supplementation on growth performance and melanin content in tissues of Taihe silky fowls. Scientia Agricultura Sinica， 2011， 44（13）: 2777-2786. （in Chinese）

［29］ CANTOR A H， MOOREHEAD P D， MUSSER M A. Comparative effects of sodium selenite and selenomethionine upon nutritional muscular dystrophy， selenium-dependent glutathione peroxidase， and tissue selenium concentrations of turkey poults. Poultry Science， 1982，61: 478-484.

［30］ POPHAM H J R， SHELBY K S. Effect of inorganic and organic forms of selenium supplementation on development of larval Heliothis virescens. Entomologia Experimentalis et Applicata， 2007，125（2）: 171-178.

［31］ JENSEN P D， RIVAS M D， TRUMBLE J T. Developmental responses of a terrestrial insect detritivore， Megaselia scalaris （Loew） to four selenium species. Ecotoxicology， 2005， 14（3）: 313-322.

［32］ HLADUN K R， KAFTANOGLU O， PARKER D R， TRAN K D，TRUMBLE J T. Effects of selenium on development， survival， and accumulation in the honeybee （Apis mellifera L.）. Environmental Toxicology & Chemistry， 2013， 32（11）: 2584-2592.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Appropriate Level of Sodium Selenite for Apis mellifera ligustica Worker Bee Larvae Feed

SU Zhong-qu， ZHANG Wei-xing， CHI Xue-peng， WANG Hong-fang， XU Bao-hua
（College of Animal Science and Technology， Shandong Agricultural University， Taian 271018， Shandong）

【Objective】The objective of this study is to find an appropriate level of sodium selenite which added in the food of Apis mellifera ligustica worker larvae， and to provide a theoretical basis for the nutritional needs of Se.【Method】A total of 1 440 one-day old larvae were randomly allotted into 2 batches， each batch involve 720 larvae， one of the batch was used to measure the pupation rate and eclosion rate， the other was used to measure enzyme activity and molecular index. Two batches were all randomly divided into 6 groups， the control group was fed basic diet and the treatment groups were fed different diets with sodium selenite at the levels of 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， and 1.0 mg·kg-1， respectively. Each group had 5 repetitions and involved 24 larvae in each. The 3-， 5-and 7-day-old larvae were used to measure larvae weight， T-AOC （total antioxidant capacity）， T-SOD （total superoxide dismutase），MDA （malondialdehyde）， and PO （phenoloxidase）. The gene expression of SelD， SerRs， Sbp1 and Sbp2 were measured by using 5-day-old larvae. The pupation rate was calculated at 7-day-old.【Result】Compared with the control group， when the added levels of sodium selenite were 0.2-0.6 mg·kg-1， the T-AOC was significantly increased （P＜0.05）， when the added levels of sodium selenite were 0.2-0.8 mg·kg-1， the activity of T-SOD was significantly increased （P＜0.05） and the MDA content of all the treatment groups was significantly decreased （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.4 mg·kg-1， the activity of PO was significantly increased （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.6 mg·kg-1， the gene expression levels of SelD， SerRs， Sbp1and Sbp2 was significantly higher than the control in 5-day-old larvae （P＜0.05）. When the added level of sodium selenite was 0.4 mg·kg-1， the weight before pupation was significantly higher than the control （P＜0.05）. Compared with the control group， when the added level of sodium selenite was 0.2 mg·kg-1， the pupation rate were significantly increased （P＜0.05）. 【Conclusion】Under artificial condition， when the selenium level of basic diet was 0.21 mg·kg-1， the appropriate level of sodium selenite which added in the food of A. m. ligustica worker larvae was 0.24-0.33 mg·kg-1by the fitting curve which involve the weight before pupation and the pupation rate， and it means that the appropriate level of selenium which added in the food of A. m. ligustica worker larvae is 0.32-0.36 mg·kg-1.

Apis mellifera ligustica； worker bee larvae； sodium selenite； appropriate level

2016-04-21；接受日期：2016-07-01

國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（CARS-45）、山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目

聯(lián)系方式：蘇中渠，E-mail：15705484470@163.com。通信作者胥保華，E-mail：bhxu@sdau.edu.cn