梅花PmSOC1-like基因的克隆與表達(dá)分析

李玉舒,楊煒茹,程堂仁,王 佳,張啟翔

(1.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室,北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

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梅花PmSOC1-like基因的克隆與表達(dá)分析

李玉舒1,2,楊煒茹1,程堂仁1,王 佳1,張啟翔1

(1.花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心,城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室,北京林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院,北京 100083;2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,北京 102442)

SOC1/TM3 (Suppressor of overexpression of constans 1/Tomato MADS-box gene 3)是 MADS-box家族一員,它能夠整合多條開(kāi)花途徑的開(kāi)花信號(hào),調(diào)節(jié)植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。為了解梅花成花轉(zhuǎn)變過(guò)程的分子機(jī)理,采用RT-PCR的方法從梅花長(zhǎng)蕊綠萼中克隆到3個(gè)SOC1的同源基因,分別命名為PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3,并采用熒光定量PCR對(duì)3個(gè)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。序列分析表明,3個(gè)基因的編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為645 bp(PmSOC1-1)、654 bp(PmSOC1-2)和660 bp(PmSOC1-3);編碼的氨基酸長(zhǎng)度分別為214，217，219 aa。系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示,PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3分別與擬南芥SOC1/TM3亞家族中的SOC1、AGL42/71/72和AGL14/19聚為一組。實(shí)時(shí)熒光定量分析結(jié)果表明,3個(gè)PmSOC1-like基因均在莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量較高,在花、果實(shí)和種子等生殖器官中表達(dá)量較低;在梅花花芽分化過(guò)程中,3個(gè)PmSOC1-like基因的表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì),推測(cè)PmSOC1-like基因可能在誘導(dǎo)梅花由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中起重要作用。

梅花;PmSOC1-like;基因克隆;表達(dá)分析

開(kāi)花是高等植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要標(biāo)志,由內(nèi)在因子和外在因素共同控制。這一過(guò)程受一系列極其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控。到目前為止,發(fā)現(xiàn)了4條植物開(kāi)花調(diào)控途徑,即光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑[1-3]。此外,周邊的環(huán)境溫度和植物自身的年齡也對(duì)開(kāi)花時(shí)間產(chǎn)生一定的影響。在對(duì)擬南芥等模式植物的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)植物感受到成花信號(hào)后,開(kāi)花時(shí)間調(diào)控途徑即被啟動(dòng),各個(gè)途徑的主效基因開(kāi)始介導(dǎo)開(kāi)花信號(hào)的傳導(dǎo)并作用于下游的花序分生組織特異基因和花器官基因,最終完成營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程。研究表明,MADS-box基因家族在控制開(kāi)花時(shí)間方面起著非常重要的作用[4-7]。其中SOC1(Suppressor of overexpression of constans 1)基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的SOC1/Tomato MADS-box gene 3(TM3)亞家族,它是作用于開(kāi)花時(shí)間調(diào)控路徑的關(guān)鍵整合子,能夠整合來(lái)自光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑的多種開(kāi)花信號(hào)[8-9],促進(jìn)植物的營(yíng)養(yǎng)分生組織向花分生組織轉(zhuǎn)變,進(jìn)而促進(jìn)開(kāi)花。

目前已從矮牽牛(Petuniahybrida)[10]、石斛蘭(Dendrobium)[11]、美洲山楊(Populustremuloides)[12]、葡萄(Vitisvinifera)[13]和紫斑牡丹(Paeoniarockii)[14]等多個(gè)物種中克隆到SOC1的同源基因,該基因的功能也得以進(jìn)一步研究,然而,在木本植物中關(guān)于SOC1同源基因功能的研究卻鮮有報(bào)道。

梅花(PrunusmumeSieb.et Zucc.)是薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)重要的觀(guān)賞花木與果樹(shù),為我國(guó)十大傳統(tǒng)名花之一。培育高產(chǎn)、抗寒、芳香的梅花新品種一直是梅花的主要育種目標(biāo),然而童期是梅花雜交育種的必經(jīng)階段,多年童期一直是縮短梅花有性雜交育種周期最大的制約要素。鑒于SOC1基因在植物成花誘導(dǎo)中的重要作用,本研究克隆了梅花SOC1的同源基因,研究了該基因在梅花中的時(shí)空表達(dá)模式,為以后開(kāi)展梅花分子育種,加速梅花育種進(jìn)程提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)材料為梅花長(zhǎng)蕊綠萼(P.mumeChangrui Lve)。該品種花瓣白色,萼片淡綠色,雄蕊發(fā)達(dá),略短于花瓣,輻射后聚集中心。5年生成年樹(shù)取自鷲峰國(guó)際精品梅園;1月齡幼苗種于溫室中,溫度為16～25 ℃,相對(duì)濕度為60%。以葉片為試材,提取總RNA用于基因克隆;取長(zhǎng)蕊綠萼成年樹(shù)的莖、幼嫩葉片、成熟葉片、葉芽、花芽、完全開(kāi)放花朵萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、種子、幼果(花后45 d)、熟果(花后95 d)和1月齡播種苗的根、莖、葉片等材料進(jìn)行基因的組織特異性表達(dá)分析。以未分化期(S1),花原基形成期(S2),萼片分化期(S3),花瓣分化期(S4),雄蕊分化期(S5),雌蕊分化期(S6),雌蕊伸長(zhǎng)期(S7),胚珠、花藥形成期(S8)8個(gè)花芽分化時(shí)期的花芽為試材,研究其基因在花芽分化過(guò)程中的表達(dá)差異。所有試材液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2 RNA的提取及cDNA合成

采用TRIzol試劑盒(Invitrogen)提取梅花不同組織中的總RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測(cè)RNA質(zhì)量后,以2 μg總RNA為模板,采用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成第一鏈cDNA。操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 基因的克隆

以擬南芥(Arabidopsisthaliana)SOC1蛋白(GenBank ID:AEC10583.1)的氨基酸序列為參考序列,在梅花基因組蛋白庫(kù)中進(jìn)行本地Blast搜索[15](梅花基因組蛋白庫(kù)數(shù)據(jù)的DNA來(lái)源為西藏野生種),將同源性高的3個(gè)序列(PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3)作為候選基因。根據(jù)基因核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引物(表1),以梅花葉片cDNA為模板擴(kuò)增基因的編碼區(qū)(CDS)。PCR反應(yīng)體系為:cDNA 1 μL,Taq酶0.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,1×PCR Buffer 5 μL,25 mmol/L MgCl23 μL,10 mmol/L dNTP 1 μL,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,采用Promega Gel extraction kit DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段,連接到pMD18-T(TaKaRa)載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10,挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)PCR驗(yàn)證后,交由中美泰和生物技術(shù)有限公司測(cè)序。確定序列后,將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)。其中PmSOC1-2和PmSOC1-3的登錄號(hào)分別為KP938964和KP938965,而PmSOC1-1的序列則與登錄號(hào)為JF806632.1的序列完全一致。

1.4 序列的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy提供的ProtParam程序(http://web.expasy.org/protparam/)分析梅花SOC1蛋白的相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn);利用NCBI的Protein Blast進(jìn)行相似蛋白搜索,并下載相似性>50%的蛋白序列;利用DNAMAN 5.2.2軟件對(duì)梅花SOC1蛋白與其他物種SOC1蛋白進(jìn)行比對(duì)分析;利用ClustalX1.83進(jìn)行多序列比對(duì),利用MEGA 5.1軟件采用Neighbor-joining(NJ)算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),Bootstrap值設(shè)為1 000次。

1.5 Southern雜交

采用改進(jìn)的CTAB法提取梅花的基因組DNA[16],用PCR反應(yīng)法制備探針,引物序列見(jiàn)表1。選用BamHⅠ,EcoRⅠ和XhoⅠ(購(gòu)自TaKaRa公司)分別酶切基因組DNA。電泳轉(zhuǎn)膜按分子克隆手冊(cè)進(jìn)行。雜交的具體步驟按DIG DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ試劑盒(購(gòu)自Roche公司)的說(shuō)明進(jìn)行。

1.6 梅花花芽分化時(shí)期的確定

采用石蠟切片的方法確定梅花花芽分化的不同時(shí)期。每隔5～7 d取樣1次,取樣時(shí)取2份外觀(guān)基本一致的樣品,1份用FAA固定液(70%酒精∶福爾馬林∶冰醋酸=90∶5∶5)保存,常規(guī)石蠟切片法制片確定花芽分化時(shí)期;另1份液氮速凍,用于RNA的提取。根據(jù)石蠟切片,梅花花芽分化過(guò)程分為8個(gè)時(shí)期:未分化期(S1),花原基形成期(S2),萼片分化期(S3),花瓣分化期(S4),雄蕊分化期(S5),雌蕊分化期(S6),雌蕊伸長(zhǎng)期(S7),胚珠、花藥形成期(S8)。

表1 引物序列

1.7 基因表達(dá)特性分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)梅花PmSOC1-like基因在不同組織和花芽發(fā)育階段的時(shí)空表達(dá)模式。分別提取樣品的總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的模板。使用Primer3 v0.4.0軟件設(shè)計(jì)PmSOC1-like基因特異引物,以梅花PP2A基因作為內(nèi)參基因[17],引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)在Thermo實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行,采用20 μL體系,即cDNA 1 μL,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)程序采用2步法:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);接下來(lái)步驟是60～95 ℃的溶解曲線(xiàn),升溫0.5 ℃/s。擴(kuò)增產(chǎn)物特異性通過(guò)溶解曲線(xiàn)進(jìn)行確定,試驗(yàn)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。利用PikoReal Software以及Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 梅花PmSOC1-like基因的克隆與序列分析

用特異性引物以梅花葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序后,獲得3個(gè)CDS序列,分別命名為PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3。PmSOC1-1的編碼區(qū)長(zhǎng)度為645 bp,其開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼214個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。PmSOC1-2的編碼區(qū)長(zhǎng)度為654 bp,其ORF編碼217個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。PmSOC1-3的編碼區(qū)長(zhǎng)度為660 bp,其ORF編碼219個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。3個(gè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量分別為24.6，24.91，24.95 kDa;理論等電點(diǎn)分別為9.46，8.68，9.05。

為了了解PmSOC1基因在梅花基因組中的拷貝數(shù)情況,我們還分別利用BamH Ⅰ,EcoR Ⅰ和XhoⅠ 3種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)3個(gè)梅花PmSOC1-like基因進(jìn)行了Southern雜交分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的探針雜交均呈現(xiàn)單一條帶,表明這些同源基因在梅花基因組中均以單拷貝形式存在(圖1)。

2.2 梅花PmSOC1-like蛋白的同源性分析

將梅花PmSOC1-like基因推導(dǎo)的氨基酸序列和其他物種SOC1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PmSOC1-1與擬南芥SOC1蛋白序列的同源性為68%,與薔薇科李屬植物的同源性更高,例如,PmSOC1-1與杏(Prunusarmeniaca)SOC1蛋白的相似性最高,達(dá)98%,與桃(Prunuspersica)SOC1蛋白的相似性為95%。而PmSOC1-2和PmSOC1-3的2個(gè)基因與薔薇科李屬植物SOC1基因的相似性則較低,如PmSOC1-2與杏和桃SOC1蛋白相似性分別為59%和57%;PmSOC1-3與杏和桃SOC1蛋白相似性分別為55%和54%。

圖1 梅花PmSOC1-like基因的Southern雜交分析

PaSOC1.杏; PpSOC1.桃;PsSOC1.李;PySOC1.櫻花;MdSOC1.蘋(píng)果;ScSOC1.麻葉繡線(xiàn)菊;RhSOC1.月季;AtSOC1.擬南芥;CcSOC1.山核桃;CsSOC1.柑橘;VvSOC1.葡萄;PTM.歐洲山楊;ETL.桉樹(shù)。

PaSOC1.Prunusarmeniaca; PpSOC1.Prunuspersica;PsSOC1.Prunussalicina;PySOC1.Prunus×yedoensis;MdSOC1.Malusdomestica;ScSOC1.Spiraeacantoniensis;RhSOC1.Rosahybrida;AtSOC1.Arabidopsisthaliana;CcSOC1.Caryacathayensis;CsSOC1.Citrussinensis;VvSOC1.Vitisvinifera;PTM.Populustremuloides;ETL.Eucalyptusglobulus.

圖2 梅花與其他物種SOC1基因的氨基酸多序列比對(duì)

Fig.2 Alignments of thePmSOC1-like deduced amino acid sequences with other SOC1 proteins from plants

氨基酸比對(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),PmSOC1-like蛋白含有高度保守的MADS結(jié)構(gòu)域、中度保守的K結(jié)構(gòu)域和多變的C-端(圖2),屬于MADS-box基因家族中的Type-Ⅱ型[18],其MADS結(jié)構(gòu)域和K結(jié)構(gòu)域的下游還分別含有非保守的Ⅰ區(qū)和半保守的C區(qū),因此又稱(chēng)其為MIKC基因[19],也稱(chēng)為MEF-2轉(zhuǎn)錄因子。Nakamura等[20]發(fā)現(xiàn)SOC1/TM3亞家族基因在C-端具有1個(gè)保守性很高的基序,即SOC1/MOTIF,這些基序在蛋白復(fù)合物的形成和轉(zhuǎn)錄中起重要的作用[21-22]。比對(duì)發(fā)現(xiàn)在PmSOC1-like基因的C-端也具有這個(gè)SOC1特有的基序(圖2)。因此,將PmSOC1-like基因劃入MADS-box基因家族SOC1/TM3亞家族中,推斷PmSOC1-like是具有生物功能的SOC1基因。

2.3 梅花PmSOC1-like的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解梅花與其他物種SOC1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,選取了MADS家族的不同成員構(gòu)建SOC1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),不同植物的SOC1蛋白可以分為2組,2種單子葉植物(玉米和小麥)單獨(dú)聚為1組;其余雙子葉植物的SOC1蛋白聚為1組。前人研究顯示,擬南芥MADS-box基因家族SOC1/TM3亞家族中包含AGL14、AGL19、AGL20(SOC1)、AGL42、AGL71和AGL72等6個(gè)基因[23]。在本研究中,PmSOC1-1與另外2種李屬植物桃和杏的親緣關(guān)系最近,先聚為1組,然后與擬南芥等其他雙子葉植物SOC1同源基因聚為1組。PmSOC1-2和PmSOC1-3則分別與研究較少的擬南芥SOC1/TM3亞家族中的AGL42/71/72和AGL14/19基因聚為1組。值得注意的是,在桃基因組中存在分別與梅花3個(gè)PmSOC1-like基因相對(duì)應(yīng)的同源基因(圖3),且這些基因在梅花和桃基因組中具有相似的分布模式,都是2個(gè)基因位于同一染色體上,而另1個(gè)基因位于其他染色體上[24-25]。這種相似性表明,SOC1-like基因在梅花和桃中具有保守性。

2.4 梅花PmSOC1基因的表達(dá)模式分析

以梅花PP2A基因?yàn)閮?nèi)參[17],采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析3個(gè)PmSOC1-like基因在梅花不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果如圖4所示,在成年樹(shù)中,3個(gè)PmSOC1-like基因在根、莖、葉、葉芽或花芽等營(yíng)養(yǎng)器官中有較高表達(dá),而在萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、果實(shí)和種子等生殖器官中表達(dá)量很低;在1月齡播種苗中,PmSOC1-1和PmSOC1-3在根、莖和葉中均有表達(dá),而PmSOC1-2則只在根中略有微弱表達(dá)。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中基因的序列號(hào)如下:杏.PaSOC1(AGD88524);梅花.PmSOC1-1(AEQ20229),PmSOC1-2(KP938964),PmSOC1-3(KP938965);李.PsSOC1(AGD88523);櫻花.PySOC1(AEO20233);麻葉繡線(xiàn)菊.ScSOC1(AEO20234);石楠.PseSOC1(AEO20232);蘋(píng)果.MdSOC1(BAI49495);野草莓.FvSOC1(AEO20231);月季.RhSOC1(AEO20230);歐洲山楊.PTM5(AF377868);葡萄.VvSOC1(ACZ26527);巨桉.EgSOC1(XP_010053874);芒果.MiSOC1(ADX97324);擬南芥.AtSOC1(AEC10583),AtAGL42(AED97572),AtAGL71(AED96138),AtAGL72(AED96136),AtAGL14(AEE83062),AtAGL19(AEE84684);小麥.TaSOC1(BAF56968);玉米.ZmSOC1(ACG32892);桃.PpMADS22位于桃染色體scaffold 2:20,600,270…20,606,939,PpMADS60位于桃染色體scaffold 2:28,315,091…28,320,984,PpMADS64位于桃染色體scaffold 5:9,862,429…9,867,768。

The accession number for each protein in phylogenetic tree are as follows:Prunusarmeniaca.PaSOC1(AGD88524);Prunusmume.PmSOC1-1(AEQ20229),PmSOC1-2(KP938964),PmSOC1-3(KP938965);Prunussalicina.PsSOC1(AGD88523);Prunus×yedoensis.PySOC1(AEO20233)；Spiraeacantoniensis.ScSOC1(AEO20234)；Photiniaserratifolia.PseSOC1(AEO20232)；Malusdomestica.MdSOC1(BAI49495)；Fragariavesca.FvSOC1(AEO20231)；Rosahybrid.RhSOC1(AEO20230)；Populustremuloides.PTM5(AF377868)；Vitisvinifera.VvSOC1(ACZ26527)；Eucalyptusgrandis.EgSOC1(XP_010053874)；Mangiferaindica.MiSOC1(ADX97324)；Arabidopsisthaliana.AtSOC1(AEC10583),AtAGL42(AED97572),AtAGL71(AED96138),AtAGL72(AED96136),AtAGL14(AEE83062),AtAGL19(AEE84684)；Triticumaestivum.TaSOC1(BAF56968)；Zeamays.ZmSOC1(ACG32892)；Prunuspersica.PpMADS22 is positioned on the peach genome map on scaffold 2:20,600,270…20,606,939 reverse,PpMADS60 is positioned on the peach genome map on scaffold 2:28,315,091…28,320,984 reverse,and PpMADS64 is positioned on the peach genome map on scaffold 5:9,862,429…9,867,768.

圖3 梅花PmSOC1-like與其他物種SOC1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Fig.3 Phylogenetic evolutionary analysis of PmSOC1-like and SOC1 proteins

圖4 PmSOC1-like基因在不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PmSOC1-like基因在梅花開(kāi)花轉(zhuǎn)變中是否與擬南芥中的AtSOC1基因一樣扮演相同的重要角色,筆者用石蠟切片的方法確定了梅花花芽分化過(guò)程中的8個(gè)時(shí)期,并檢測(cè)了3個(gè)基因在每個(gè)分化時(shí)期的表達(dá)情況(圖5)。在整個(gè)花芽分化過(guò)程中,3個(gè)PmSOC1-like基因的表達(dá)水平整體都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在花芽未分化期(S1)表達(dá)量最高,一旦花芽被誘導(dǎo)分化表達(dá)量即開(kāi)始下降,其中PmSOC1-2在3個(gè)基因中下降最為明顯(圖5)。

3 討論

開(kāi)花是植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的過(guò)渡,比較梅花等多年生木本植物與擬南芥等草本植物開(kāi)花過(guò)程,發(fā)現(xiàn)最大的差異在于木本植物實(shí)生苗具備開(kāi)花能力之前通常需要經(jīng)歷一段很長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期(童期)。了解木本植物的開(kāi)花轉(zhuǎn)變過(guò)程對(duì)縮短童期、加速品種改良進(jìn)程具有十分重要的意義。SOC1是MADS-box基因家族中控制開(kāi)花時(shí)間的基因,廣泛存在于單子葉植物和雙子葉植物中[26]。目前，在其他物種中鑒定到的SOC1同源基因在擬南芥中的過(guò)表達(dá)都一致地表現(xiàn)出了早花表型[27-30]。近期研究還發(fā)現(xiàn),SOC1參與了冷響應(yīng)信號(hào)和開(kāi)花調(diào)節(jié)之間的反饋回路。SOC1蛋白可與抗寒基因CBF的啟動(dòng)子直接結(jié)合以抑制CBF表達(dá),從而促進(jìn)開(kāi)花;而CBF的過(guò)表達(dá)可以增加FLC的轉(zhuǎn)錄水平,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)春化途徑中FLC的下游靶基因SOC1的負(fù)調(diào)控,以延遲開(kāi)花[31]。這說(shuō)明在冷響應(yīng)信號(hào)和開(kāi)花調(diào)節(jié)之間存在著1個(gè)反饋回路,以適應(yīng)不斷變化的外界環(huán)境。

A.梅花不同花芽分化時(shí)期的石蠟切片圖；B.PmSOC1-like基因在梅花不同花芽分化時(shí)期的表達(dá)情況。S1.未分化期；S2.花原基形成期；S3.萼片分化期；S4.花瓣分化期；S5.雄蕊分化期；S6.雌蕊分化期；S7.雌蕊伸長(zhǎng)期；S8.胚珠、花藥形成期。

A.Images of paraffin sections of floral bud at different developmental stages；B.Relative expression ofPmSOC1-like genes in the floral bud at different developmental stages.S1.Pre-differentiation stage;S2.Flower primordium differentiation stage;S3.Sepal differentiation stage;S4.Petal differentiation stage;S5.Stamen differentiation stage;S6.Pistil differentiation stage;S7.Pistil elongation stage;S8.Ovule and anther formation stage.

圖5PmSOC1-like基因在花芽分化時(shí)期的表達(dá)分析

Fig.5 Expression analyses ofPmSOC1-like genes duringP.mumefloral bud differentiation

本試驗(yàn)從梅花中成功分離得到了3個(gè)成花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的PmSOC1-like基因。序列同源性分析表明這些基因?qū)儆贛ADS-box基因家族中的SOC1/TM3亞家族。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示,PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3分別與擬南芥的SOC1、AGL42/71/72和AGL14/19聚為一組。有研究表明,擬南芥SOC1/TM3亞家族中的AGL42、AGL71和AGL72 3個(gè)基因是由于SOC1基因在進(jìn)化過(guò)程中的基因復(fù)制產(chǎn)生的[32]。因此,筆者推測(cè)梅花3個(gè)PmSOC1-like基因具有相同的祖先起源,但在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了分化,并最終在開(kāi)花和營(yíng)養(yǎng)器官發(fā)育中發(fā)揮著不同的作用。此外,與擬南芥中存在3個(gè)基因(AGL42/71/72)不同的是,在梅花和桃的基因組中都只有1個(gè)相應(yīng)的同源基因(梅花:PmSOC1-2,桃:PpMADS60)。而且,AGL42、AGL71和AGL72在控制擬南芥開(kāi)花中的功能被證明是冗余的[31]。因此,擬南芥SOC1/TM3亞家族中由于基因復(fù)制產(chǎn)生的基因多樣性可能是在擬南芥與李屬植物分化后發(fā)生的。

對(duì)PmSOC1-like基因進(jìn)行不同組織部位的表達(dá)分析表明,3個(gè)基因均在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)較高,而在生殖器官中表達(dá)量很低。此外,相對(duì)于1月齡幼苗,PmSOC1-1和PmSOC1-2在成年樹(shù)葉片和莖中的表達(dá)量更高,這與擬南芥AtSOC1的表達(dá)一致。在擬南芥中,AtSOC1的表達(dá)量隨著植株的生長(zhǎng)而不斷提高,尤其在成熟葉片中的表達(dá)量最高[9,33-35]。PmSOC1-1和PmSOC1-2基因在梅花成年樹(shù)和幼苗中的不同表達(dá)水平可能反映植物的成熟度。在對(duì)梅花花芽分化過(guò)程中PmSOC1-like基因的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn),PmSOC1-like基因的表達(dá)水平整體都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在擬南芥中,SOC1基因是調(diào)控植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的重要基因[36]。由此推測(cè)，PmSOC1-like基因在誘導(dǎo)梅花由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著重要作用。

近幾年的研究顯示,在其他一些木本植物中,SOC1同源基因存在不同的表達(dá)模式。如美洲山楊(Populustremuloides)的SOC1同源基因PTM5在維管組織中有特異表達(dá),暗示該基因可能與美洲山楊木材的形成有關(guān)[12];紫斑牡丹PrSOC1在花芽中的表達(dá)量最高,在根、莖、葉中表達(dá)量略低[23]。月季RhSOC1則在頂芽中的表達(dá)量最高[37]。這些研究結(jié)果表明，SOC1在不同物種之間的表達(dá)存在一定的差異,推測(cè)SOC1基因在植物開(kāi)花轉(zhuǎn)變的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有多種功能。

作為1個(gè)集成多個(gè)開(kāi)花信號(hào)的整合子,SOC1已經(jīng)被深入研究了十幾年。盡管人們對(duì)模式植物擬南芥AtSOC1已經(jīng)有了比較深入的了解,但是對(duì)木本植物中SOC1同源基因的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。目前,國(guó)家花卉工程技術(shù)中心得到了3條梅花PmSOC1-like基因,并對(duì)其進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)模式分析,為進(jìn)一步深入研究SOC1基因在梅花開(kāi)花過(guò)程中的功能奠定了理論基礎(chǔ)。但是,梅花SOC1與其他MADS-box開(kāi)花相關(guān)基因、蛋白的作用關(guān)系還有待進(jìn)一步探討研究;梅花SOC1基因的上游調(diào)控序列和下游調(diào)控區(qū)域也有待進(jìn)一步深入研究。這會(huì)為從整體上揭示梅花的開(kāi)花之謎奠定理論基礎(chǔ)依據(jù),為今后研究SOC1在梅花其他生命活動(dòng)中的可能作用提供技術(shù)支撐。

[1] Fornara F,de Montaigu A,Coupland G.SnapShot:control of flowering inArabidopsis[J].Cell,2010,141(3):550,550.e1-2.

[2] Simpson G G,Dean C.Arabidopsis,the rosetta stone of flowering time?[J].Science,2002,296(5566):285-289.

[3] Srikanth A,Schmid M.Regulation of flowering time:all roads lead to Rome[J].Cellular and Molecular Life Sciences,2011,68(12):2013-2037.

[4] Distelfeld A,Li C,Dubcovsky J.Regulation of flowering in temperate cereals[J].Current Opinion in Plant Biology,2009,12(2):178-184.

[5] Greenup A,Peacock W J,Dennis E S,et al.The molecular biology of seasonal flowering-responses inArabidopsisand the cereals[J].Annals of Botany,2009,103(8):1165-1172.

[6] Trevaskis B,Hemming M N,Dennis E S,et al.The molecular basis of vernalization-induced flowering in cereals[J].Trends in Plant Science,2007,12(8):352-357.

[7] 胡麗芳,金志強(qiáng),徐碧玉.MADS-box基因?qū)ǖ陌l(fā)育及開(kāi)花早晚的影響[J].生命科學(xué)研究,2004,8(4):7-12.

[8] Moon J,Suh S S,Lee H,et al.TheSOC1 MADS-box gene integrates vernalization and gibberellin signals for flowering inArabidopsis[J].The Plant Journal,2003,35(4):613-623.

[9] Samach A,Onouchi H,Gold S E,et al.Distinct roles ofCONSTANStarget genes in reproductive development ofArabidopsis[J].Science,2000,288(5471):1613-1616.

[10] Ferrario S,Busscher J,Franken J,et al.Ectopic expression of the petunia MADS box geneUNSHAVENaccelerates flowering and confers leaf-like characteristics to floral organs in a dominant-negative manner[J].The Plant Cell,2004,16(6):1490-1505.

[11] Ding L,Wang Y,Yu H.Overexpression ofDOSOC1,an ortholog ofArabidopsisSOC1,promotes flowering in theOrchiddendrobiumChao Parya Smile[J].Plant and Cell Physiology,2013,54(4):595-608.

[12] Cseke L J,Zheng J,Podila G K.Characterization ofPTM5 in aspen trees:a MADS-box gene expressed during woody vascular development[J].Gene,2003,318(1):55-67.

[13] Sreekantan L,Thomas M R.VvFTandVvMADS8,the grapevine homologues of the floral integratorsFTandSOC1,have unique expression patterns in grapevine and hasten flowering inArabidopsis[J].Functional Plant Biology,2006,33(12):1129-1139.

[14] 劉傳嬌,王順利,薛璟祺,等.張秀新牡丹開(kāi)花調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因PrSOC1的克隆與表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(11):2259-2267.

[15] Zhang Q X,Chen W B,Sun L D,et al.The genome ofPrunusmume[J].Nature Commun,2012,3(4):187-190.

[16] Porebski S,Bailey L G,Baum B R.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J].Plant Mol Biol Rep,1997,15(1):8-15.

[17] Wang T,Hao R J,Pan H T,et al.Selection of suitable reference genes for quantitative Real-time polymerase chain reaction inPrunusmumeduring flowering stages and under different abiotic stress conditions[J].Journal of the American Society for Horticultural Science,2014,139(2):113-122.

[18] Alvarez-Buylla E R,Pelaz S,Liljegren S J,et al.An ancestral MADS-box gene duplication occurred before the divergence of plants and animals[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(10):5328-5333.

[19] Kaufmann K,Melzer R,Thei en G.MIKC-type MADS-domain proteins:structural modularity,protein interactions and network evolution in land plants[J].Gene,2005,347(2):183-198.

[20] Nakamura T,Song I J,Fukuda T,et al.Characterization ofTrcMADS1 gene ofTrilliumcamtschatcense(Trilliaceae) reveals functional evolution of theSOC1/TM3-like gene family[J].Journal of Plant Research,2005,118(3):229-234.

[21] Honma T,Goto K.Complexes of MADS-box proteins are sufficient to convert leaves into floral organs[J].Nature,2001,409(6819):525-529.

[22] Kramer E M,Irish V F.Evolution of genetic mechanisms controlling petal development[J].Nature,1999,399(6732):144-148.

[23] Becker A,Theiβen G.The major clades of MADS-box genes and their role in the development and evolution of flowering plants[J].Mol Phylogen Evol,2003,29:464-489.

[24] Wells C E,Vendramin E,Tarodo S J,et al.A genome-wide analysis of MADS-box genes in peach (Prunuspersica(L.) Batsch)[J].BMC Plant Biol,2015,15:41.

[25] Xu Z D,Zhang Q X,Sun L D,et al.Genome-wide identification,characterisation and expression analysis of the MADS-box gene family inPrunusmume[J].Mol Genet Genomics,2014,289:903-920.

[26] Smaczniak C,Immink R G,Angenent G C,et al.Developmental and evolutionary diversity of plant MADS-domain factors:insights from recent studies[J].Development,2012,139(17):3081-3098.

[27] Fu J X,Qi S,Yang L W,et al.Characterization of chrysanthemumClSOC1-1 andClSOC1-2,homologous genes ofSOC1[J].Plant Molecular Biology Reporter,2013,32(3):740-749.

[28] Nakano Y,Kawashima H,Kinoshita T,et al.Characterization ofFLC,SOC1 andFThomologs inEustomagrandiflorum:effects of vernalization and post-vernalization conditions on flowering and gene expression[J].Physiologia Plantarum,2011,141(4):383-393.

[29] Sreekantan L,Thomas M R.VvFTandVvMADS8,the grapevine homologues of the floral integratorsFTandSOC1,have unique expression patterns in grapevine and hasten flowering inArabidopsis[J].Functional Plant Biology,2006,33(12):1129-1139.

[30] Tan F C,Swain S M.Functional characterization ofAP3,SOC1 andWUShomologues from citrus(Citrussinensis)[J].Physiologia plantarum,2007,131(3):481-495.

[31] Seo E,Lee H,Jeon J,et al.Crosstalk between cold response and flowering inArabidopsisis mediated through the flowering-time geneSOC1 and its upstream negative regulatorFLC[J].The Plant Cell,2009,21(10):3185-3197.

[32] Dorca-Fornell C,Gregis V,Grandi V,et al.TheArabidopsisSOC1-like genesAGL42,AGL71 andAGL72 promote flowering in the shoot apical and axillary meristems[J].The Plant Journal,2011,67(6):1006-1017.

[33] Borner R,Kampmann G,Chandler J,et al.A MADS domain gene involved in the transition to flowering inArabidopsis[J].The Plant Journal,2000,24(5):591-599.

[34] Lee H,Shu S S,Park E,et al.TheAGAMOUS-LIKE20 MADS domain protein integrates floral inductive pathways inArabidopsis[J].Genes and Development,2000,14(18):2366-2376.

[35] Wang J W,Czech B,Weigel D.miR156-regulated SPL transcription factors define an endogenous flowering pathway inArabidopsisthaliana[J].Cell,2009,138(4):738-749.

[36] Liu C,Zhou J,Bracha-Drori K,et al.Specification ofArabidopsisfloral meristem identity by repression of flowering time genes[J].Development,2007,134(10):1901-1910.

[37] 李晶晶.薔薇科植物TFL1和SOC1基因的克隆及表達(dá)分析[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

Molecular Cloning and Expression Analysis of Flowering-regulating Transcription FactorPmSOC1-like Gene inPrunusmume

LI Yushu1,2,YANG Weiru1,CHENG Tangren1,WANG Jia1,ZHANG Qixiang1

(1.Beijing Key laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation and Molecular Breeding,National Engineering Research Center for Floriculture,Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment,Landscape Architecture School,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.Beijing Vocational College of Agriculture,Beijing 102442,China)

The MADS-box geneSOC1/TM3 (Suppressor of overexpression of constans 1/Tomato MADS-box gene 3) integrates multiple flowering signals to regulate the transition from vegetative to reproductive development in plants. To better understand the molecular regulation of flower development inPrunusmume,three putative orthologs ofSOC1,includingPmSOC1-1,PmSOC1-2,andPmSOC1-3,were isolated.The expression patterns ofPmSOC1-1,PmSOC1-2 andPmSOC1-3 were determined by Real-time RT-PCR.EachPmSOC1-like gene has a single long open reading frame(ORF) encoding a putative protein of 214,217 and 219 amino acids respectively.Phylogenetic analysis suggested thatPmSOC1-1,PmSOC1-2,andPmSOC1-3 genes might be orthologous ofArabidopsisSOC1,AGL42/71/72,andAGL14/19,respectively.By Real-time quantitative RT-PCR experiment,threePmSOC1-like genes were mainly expressed in vegetative organs and expressed at low level in reproductive organs such as flowers,fruit,seed and so on.The expression of the threePmSOC1-like genes showed a decreasing trend.Above results suggest that thePmSOC1-like gene plays an important role in the transition from the vegetative growth to the reproductive growth phase.

Prunusmume;PmSOC1-like;Gene cloning;Expression analysis

2016-05-13

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102607)；北京市共建項(xiàng)目專(zhuān)項(xiàng)

李玉舒(1982-),女,黑龍江伊春人,講師,在讀博士,主要從事園林植物栽培與應(yīng)用研究。

張啟翔(1956-),男,湖北黃岡人,教授,博士,博士生導(dǎo)師,主要從事花卉資源與育種研究。

S685.17

A

1000-7091(2016)05-0078-08

10.7668/hbnxb.2016.05.012