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    稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素工藝條件的研究

    2013-10-18 02:03:56于童童徐麗萍
    關(guān)鍵詞:軟骨素堿液硫酸

    付 瑩,王 鑫,于童童,徐麗萍

    (1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院省高校食品科學與工程重點實驗室,哈爾濱150076;2.華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院,武漢430070)

    硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate,簡稱CS)是一種酸性黏多糖,廣泛存在于哺乳動物的軟骨、喉骨、鼻骨和器官中,主要通過共價鍵與核心蛋白質(zhì)相連,以蛋白聚糖的形式存在.具有多種同分異構(gòu)體,根據(jù)硫酸基在半乳糖上的位置不同主要分為硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素B(CSC)[1].硫酸軟骨素為白色或微黃色粉末,具有吸濕性,易溶于水而成黏度較大的溶液,難溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑.硫酸軟骨素遇熱不穩(wěn)定,具有降血脂、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤及預防關(guān)節(jié)炎等重要生理功能[2-4].作為食品添加劑,硫酸軟骨素可用于食品的乳化、保濕和祛除異味.在化妝品中添加硫酸軟骨素,可調(diào)節(jié)皮膚的細胞代謝,促進營養(yǎng)的吸收,保持皮膚的水分和改善發(fā)質(zhì).因此,從低成本的豬軟骨中提取開發(fā)硫酸軟骨素食品及保健品具有十分廣闊的前景[5-7].

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    豬月牙骨,市售.

    1.2 主要試劑與儀器

    無水乙醇(天津市天博迪化工有限公司);氫氧化鈉(黑龍江阿城化學試劑廠);鹽酸(哈爾濱新達化工廠);氯化鈉(天津市精細化工開發(fā)開發(fā)中心);FZ102機型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司);TDL80-2B型低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);恒溫水浴振蕩器(上海一恒科學儀器有限公司);DK-98-1型電子恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司);ALC-1100.2型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);便攜式pHS-3C型數(shù)字精密pH計(中國上海儀器廠);TU-1900型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)

    1.3 實驗方法

    1.3.1 浸取

    稱取5份3 g豬軟骨,分別置于燒杯中,按照一定的料液比,加入一定體積分數(shù)的NaOH溶液,再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加入NaCl使溶液達到一定濃度,校正pH值為12~13,水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.

    1.3.2 鹽酸鹽解

    采用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)濾液pH值為7~8,升溫至80~90℃,保持20 min,冷卻靜置后過濾,得鹽解液.

    1.3.3 除酸性蛋白

    將鹽解液調(diào)節(jié)pH值為2~3,攪拌10 min,靜置.存放后過濾至澄清,調(diào)節(jié)pH值達到6.5,加2倍去離子水,使溶液的NaCl濃度為1 mol/L.

    1.3.4 沉淀干燥

    上述溶液加入95%的無水乙醇,使乙醇的體積分數(shù)達到50%~60%,存放至清,虹吸除上清液,沉淀抽干,并用無水乙醇洗3~4次,脫水干燥,即得硫酸軟骨素成品[8].

    1.3.5 稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素單因素條件的選擇

    根據(jù)實驗條件和相關(guān)資料確定幾個對硫酸軟骨素得率有影響的因素,即堿液濃度、提取溫度、料液比和Na+濃度對硫酸軟骨素得率的影響.以選定的方法進行單因素實驗,即改變某一條件,固定其他條件,測定硫酸軟骨素得率[9].其結(jié)果也為正交試驗的進行奠定了基礎(chǔ).

    1)堿液濃度單因素試驗

    稱取5份3 g豬軟骨,分別置于燒杯中,按照1∶6的料液比,分別加入1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%的NaOH溶液,再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L,校正pH值為12~13,控溫40℃,水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2-1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

    2)料液比單因素試驗

    稱取5份3 g豬軟骨,分別置于燒杯中,分別按照1∶5,2∶11,1∶6,2∶13,1∶7的料液比,加入2%的NaOH溶液,再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L,校正pH值為12~13,控溫40℃,水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2及1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

    3)Na+濃度單因素試驗

    稱取5份3 g豬軟骨,分別置于燒杯中,按照1∶6的料液比,加入2%,的NaOH溶液,再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積分加NaCl使?jié)舛确謩e達到2、2.5、3、3.5、4 mol/L,校正pH值為12~13,控溫40℃,水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2及1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

    4)提取溫度單因素試驗

    稱取5份3g豬軟骨,分別置于燒杯中,按照1∶6的料液比,加入2%的NaOH溶液,再根據(jù)總?cè)芤旱捏w積加NaCl使?jié)舛冗_到3.5 mol/L,校正pH值為12~13,分別控溫25、30、35、40、45℃,水浴振蕩24 h(溫度恒定)后過濾備用.按照1.3.2~1.3.4法進行鹽酸鹽解、除酸性蛋白、沉淀干燥等試驗得成品.

    1.3.6 硫酸軟骨素最佳工藝條件的選擇

    根據(jù)單因素實驗的結(jié)果與分析,選擇影響稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素的四個主要因素分別為:堿液體積分數(shù)(A)、料液比(B)、Na+濃度(C)和提取溫度(D),采用正交設(shè)計表L9(34)安排正交實驗.因素水平表見表1.

    表1 正交實驗的因素和水平

    1.3.7 定性定量分析實驗

    1)硫酸軟骨素得率的計算其中:m為提取的硫酸軟骨粗品的質(zhì)量,g;M為豬軟骨原料的質(zhì)量,g.

    2)紫外可見光譜檢測

    取一定體積硫酸軟骨素標準或樣品溶液,置于10 mL具塞試管中,準確加入蒸餾水使溶液體積至1.00 mL,置于冰水浴中冷卻,然后分別加入6 mL濃硫酸,其間注意避免出現(xiàn)沸騰現(xiàn)象,蓋塞振蕩均勻后置于沸水中加熱20 min,取出放于冰水浴中冷卻.向水解后的溶液中加入0.20 mL咔唑溶液,搖勻后置于沸水中加熱15 min,顯色,取出迅速置于冰水浴中冷卻至室溫.采用無醛乙醇作空白溶液,用TU-1900型雙光束紫外分光光度計在400~600 nm波長范圍內(nèi)掃描確定硫酸軟骨素最大吸收波長.樣品溶液采用此方法測定最大吸收波長與標準品對照.

    2 結(jié)果與討論

    2.1 稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素單因素結(jié)果與分析

    選取影響稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素效果的主要因素:堿液體積分數(shù)、料液比、Na+濃度、提取溫度,分別進行單因素實驗,以硫酸軟骨素得率為指標,確定各因素對硫酸軟骨素得率的影響,為正交試驗提供依據(jù).

    2.1.1 堿液體積分數(shù)單因素實驗結(jié)果與分析

    實驗結(jié)果顯示,隨著堿液體積分數(shù)的上升硫酸軟骨素的得率先逐漸升高然后逐漸下降.在堿體積分數(shù)為2%時Cs得率最高,隨著堿液體積分數(shù)大于2%時,硫酸軟骨素的釋出率逐漸降低,這可能是由于隨著堿液體積分數(shù)的增大,處于糖鏈還原端的糖基在堿性條件下,逐漸生成間糖酸和異糖酸而脫落降解,是Cs得率降低.因此,選定堿液體積分數(shù)為2%為最佳.見圖1.

    圖1 堿液體積分數(shù)對硫酸軟骨素得率的影響

    2.1.2 料液比單因素實驗結(jié)果與分析

    實驗結(jié)果顯示,隨著料液比的提高硫酸軟骨素的得率先大幅上升然后逐漸下降.在料液比為1∶6時得率達到最高,但當料液比高于1∶6時,硫酸軟骨素的得率逐漸下降,故最佳料液比為1∶6左右.由于實驗是以3 g豬軟骨為原料的,如果料液比過小,溶劑量就相應(yīng)很少,導致溶液稠度較高,不利于多糖的浸出;所以在一定范圍內(nèi),增大料液比可以使得原料與堿液充分發(fā)生反應(yīng),降解更徹底,進而提高得率,但過高的料液比會使得堿液體積分數(shù)下降,從而也不利于硫酸軟骨素的浸提.見圖2.

    圖2 料液比對硫酸軟骨素得率的影響

    2.1.3 Na+濃度單因素實驗結(jié)果與分析

    實驗結(jié)果顯示,隨著Na+濃度的升高Cs的得率先大幅上升保持一段平穩(wěn)后又大幅下降.Na+濃度在3 mol/L時硫酸軟骨素的得率達到最大.故最佳Na+濃度為3 mol/L左右.高濃度的鹽可使游離出的蛋白質(zhì)沉淀完全,鹽濃度不能過低,否則產(chǎn)品的澄清度就會下降,蛋白質(zhì)清楚不完全,導致硫酸軟骨素的得率減少.但過高濃度的鹽不僅會造成浪費,而且也會降低硫酸軟骨素的得率.見圖3.

    圖3 Na+濃度對硫酸軟骨素得率的影響

    2.1.4 提取溫度單因素實驗結(jié)果與分析

    實驗結(jié)果顯示,浸取時溫度越高,膠原蛋白溶漲的速率越快,硫酸軟骨素就越容易解離出來.在提取溫度為40℃時,硫酸軟骨素的得率達到最高點,振蕩溫度繼續(xù)升高時,硫酸軟骨素的得率就逐漸下降,如果提取溫度大于50℃,溶液變?yōu)槌燃t色,說明硫酸軟骨素分解,嚴重影響最終得率.故最佳浸取提取溫度為40℃左右.見圖4.

    圖4 提取溫度對硫酸軟骨素得率的影響

    2.2 稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素最佳條件結(jié)果與分析

    通過正交實驗確定最佳提取方法,考察指標為硫酸軟骨素得率(%),其實驗結(jié)果見表2.

    表2 正交實驗的結(jié)果表

    2.3 直觀分析

    為了探索更好的實驗條件的取值方向,以各因素的水平為橫坐標,均值K為縱坐標繪制因素與水平直觀圖,結(jié)果見圖5.

    圖5 直觀分析圖

    通過比較正交試驗表中各因素的極差值(R),由圖5可以看出,影響硫酸軟骨素得率因素順序為A>D>B>C,最佳提取條件為A3B2C1D1,即2.5%NaOH溶液,料液比1∶6,Na+濃度2.5 mol/L,提取溫度35℃.

    2.4 方差分析

    對正交試驗做方差分析,分析出對實驗影響顯著的因素有哪幾項,其結(jié)果見表3.由表3可知,其中的堿液體積分數(shù)影響效果顯著.

    表3 方差分析表

    由表3的方差分析可知,各因素對稀堿-濃鹽法對硫酸軟骨素得率影響的大小順序為A>D>B>C,即堿液體積分數(shù)>提取溫度>料液比>Na+濃度,最佳的因素水平組合為A3B2C1D1,即2.5%NaOH溶液,料液比1∶6,Na+濃度2.5 mol/L,提取溫度35℃.經(jīng)驗證試驗得稀堿-濃鹽法提取硫酸軟骨素的得率為14.54%.

    2.5 定性試驗結(jié)果與分析

    如圖6.硫酸軟骨素標準溶液在400~600 nm波長范圍掃描可見硫酸軟骨素溶液在526 nm有最大吸收峰.樣品與標準品出峰位置一致,證明提取物質(zhì)為硫酸軟骨素.

    圖6 硫酸軟骨素標品與樣品紫外掃描圖譜

    3 結(jié)語

    采用稀堿-濃鹽法提取豬軟骨中的硫酸軟骨素,考察不同因素(即堿液體積分數(shù)、料液比,提取溫度、Na+濃度)對其提取效果的影響,采用正交試驗確定最佳提取工藝并通過紫外光譜法對其進行檢測,得出以下結(jié)論:硫酸軟骨素的最佳提取工藝條件為:2.5%NaOH溶液,料液比1∶6,Na+濃度2.5 mol/L,提取溫度35℃.經(jīng)驗證試驗,硫酸軟骨素的得率為14.54%,由方差分析證明,堿液體積分數(shù)對硫酸軟骨素的得率影響效果顯著.通過紫外光譜法檢測,結(jié)果表明提取出物質(zhì)與硫酸軟骨素標準品峰形位置一致,進一步證明從豬軟骨提出的物質(zhì)是硫酸軟骨素.

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