分子印跡傳感器對標(biāo)本中塑化劑直接快速檢測

陶 強，張娟琨，劉英姿，鞠小翠，左娟娟

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

分子印跡傳感器對標(biāo)本中塑化劑直接快速檢測

陶 強，張娟琨，劉英姿，鞠小翠，左娟娟

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

本文構(gòu)建了能夠快速檢測鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）的分子印跡電化學(xué)傳感器.首先利用分子印跡技術(shù)以熱聚合的方法制備了分子印跡聚合物顆粒（MIPs）；然后將優(yōu)化的MIPs與瓊脂糖溶液混勻固定在玻碳電極表面制備成DINP分子印跡電化學(xué)傳感器；傳感器可以特異性結(jié)合模板分子DINP且其電化學(xué)信號與DINP的濃度相關(guān).再利用傳感器檢測樣品中DINP的含量，檢測過程不需要樣本前處理，可以用于現(xiàn)場直接檢測.該方法的線性方程為ΔI=0.03c+ 3.07，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，線性范圍5×10-8～1×10-6，mol/L，檢測限為2.7×10-8，mol/L，在實際樣品中的加標(biāo)回收率為105.3%～115.7%.

鄰苯二甲酸二異壬酯；分子印跡聚合物顆粒；電化學(xué)傳感器；檢測；循環(huán)伏安

鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）是一種無色透明液體，與其他增塑劑相比具有低密度性、低揮發(fā)性和安全系數(shù)高等優(yōu)點，被廣泛作為增塑劑應(yīng)用于食品包裝、電線電纜和玩具鞋材等方面［1］.作為鄰苯二甲酸酯類（PAEs）的重要類型，DINP的毒性已受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注.研究發(fā)現(xiàn)［2-4］DINP對胚胎及成年期睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生影響，使雄激素水平降低.Gray等［5］研究發(fā)現(xiàn)DINP誘導(dǎo)能使生殖畸形的發(fā)生率增加，且會出現(xiàn)改變性分化.

2005年歐盟規(guī)定進口兒童玩具及護理品中DINP濃度不得高于0.1%［6］.2007年美國標(biāo)準規(guī)定兒童用品中DINP的含量不得高于0.1%［7］.我國在2008年就已頒布GB/T 21911—2008《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》［8］，對于食品中PAEs物質(zhì)的測定，含油脂樣品和非油脂樣品的檢出限分別為1.5，mg/kg和0.05，mg/kg.2011年的中國臺灣起云劑事件及2012年大陸酒鬼酒塑化劑事件，再一次引發(fā)了人們對食品安全的擔(dān)憂［9］，準確、快速測定食品中塑化劑的含量成為了當(dāng)前分析檢測領(lǐng)域研究的熱門課題.

目前PAEs的測定方法主要有氣質(zhì)聯(lián)用（GCMS）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）法等.GC-MS法樣品前處理復(fù)雜，檢出限高，易受其他有機物污染［10］，運行成本高，且PAEs在GC-MS色譜柱中有較高殘留，會污染色譜柱與離子源［9］；HPLC法很難將各種塑化劑完全分開，方法特異性不強［11］；GC法測定過程中無法定性，存在假陽性可能［12］；HPLC-MS法使用費用較高，并且較大的儀器本底值也限制樣品中塑化劑的檢測［13］.而DINP分子印跡生物傳感器具有制備過程簡單、造價低廉、靈敏度高的優(yōu)點，可實現(xiàn)對DINP 的特異性檢測.樣品不需要進行前處理，加標(biāo)回收率和樣品測定結(jié)果均在合理范圍內(nèi)，有望在白酒及食品檢測中得到應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 儀器與主要試劑

UV-1800型紫外光譜掃描儀，日本島津公司；SU1510型掃描電子顯微鏡，日本株式會社日立高新技術(shù)那珂事業(yè)所；LK2005A型電化學(xué)工作站，天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司.

鄰苯二甲酸二異壬酯（DINP）、偶氮二異丁腈（AIBN）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）、鄰苯二甲酸丁芐酯（BBP）、鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP），天津希恩思生化科技有限公司；α-甲基丙烯酸（MAA），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；甲基丙烯酸甲酯（MMA），天津市化學(xué)試劑一廠；丙烯酰胺，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；鐵氰化鉀（K3Fe（CN）6），天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心.以上試劑均為分析純.

1.2 傳感器的制備

使用熱聚合法制備DINP分子印跡聚合物顆粒.向50，mL錐形瓶中加入0.5，mmol DINP、1.5，mmol MAA和10，mL乙腈溶劑，放置在搖床上預(yù)作用6，h.再加入15，mmol的交聯(lián)劑（EGDMA）和20，mg的AIBN，充分混勻后通入氮氣除氧10，min，真空密封轉(zhuǎn)移至60，℃恒溫水浴鍋中熱聚合24，h.得到白色塊狀聚合物，干燥研碎后通過0.28，mm分樣篩，得到大小均一的固體顆粒.再用甲醇-乙酸溶液（體積比為9∶1）超聲清洗制備的顆粒至完全洗凈，然后用甲醇洗去多余乙酸，再用雙蒸水洗去多余甲醇，干燥至質(zhì)量恒定，待用.非分子印跡聚合物顆粒（NIPs）以同樣方法制備，只是不加入模板分子DINP.

取20，mg MIPs加入到1，mL、2%的瓊脂糖溶液中，制得20，mg/mL的MIPs溶液.然后均勻涂布3，μL MIPs溶液于玻碳電極表面（玻碳電極打磨好且經(jīng)過活化），待干燥后電極表面即形成一層MIPs膜.

1.3 電化學(xué)檢測

將制備好的傳感器MIPs膜放入5，mmol/L鐵氰化鉀的PBS溶液（含0.1，mol/L KCl，pH 7.0）中通過循環(huán)伏安法來檢測目標(biāo)分子DINP的標(biāo)準曲線.DINP的檢測濃度為50～1，000，nmol/L，每個濃度的吸附時間為5，min，循環(huán)電位為-0.1～0.6，V，每次掃描循環(huán)3次，記錄MIPs膜吸附DINP前后對應(yīng)氧化峰的電流變化（ΔI），并作出ΔI與對應(yīng)DINP濃度的關(guān)系曲線.

1.4 功能單體的選擇及優(yōu)化

配制0.01，mmol/L DINP溶液、0.04，mmol/L MAA、MMA和丙烯酰胺溶液（結(jié)合前）以及相同濃度DINP和各功能單體的混合溶液（結(jié)合后）各10，mL，分別進行全波長掃描.結(jié)合前為理論值，即DINP與各功能單體掃描后的加和；結(jié)合后為實測值，是DINP與各功能單體相互作用后的實際測量值.

準確稱量5份不同比例MAA制備的MIPs各10，mg，分別放入對應(yīng)標(biāo)記為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的盛有6，mL的DINP-乙腈溶液的5支試管中，其中DINP濃度均為0.02，mmol/L.再將試管放入恒溫振蕩器中振蕩吸附12，h.然后將吸附后的溶液轉(zhuǎn)移至離心管中離心，紫外光譜掃描上清液，按照式（1）計算對應(yīng)的MIPs顆粒對DINP的吸附量.

式中：Q為DINP的平衡吸附量，mg/g；c0為DINP初始濃度，mmol/L；c為平衡吸附后上清液中DINP的濃度，mmol/L；V為溶液體積，mL；M為DINP相對分子質(zhì)量；m為MIPs的質(zhì)量，mg.

1.5 交聯(lián)劑的優(yōu)化

準確稱量6份不同比例EGDMA的MIPs各10，mg，分別放入對應(yīng)標(biāo)記A、B、C、D、E、F的6支試管中，DINP∶MAA∶EGDMA的物質(zhì)的量比：A為1∶3∶15，B為1∶3∶20，C為1∶3∶25，D為1∶3∶30，E為1∶3∶35，F(xiàn)為1∶3∶40，操作與1.5中相同.

1.6 掃描電子顯微鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡掃描MIPs以觀察MIPs的形貌特征，對比洗脫前后MIPs的形狀.

1.7 實際樣品分析驗證

取市場上某品牌白酒，通過電化學(xué)測定，未檢測出DINP.然后加入DINP配制成100、200、300，nmol/L的溶液各25，mL，標(biāo)號為A、B、C.用制備好的傳感器吸附DINP后，進行空白樣加標(biāo)回收實驗驗證.

2 結(jié)果與討論

2.1 等溫吸附曲線結(jié)果

配制5～20，μmol/L的DINP乙腈溶液，恒溫培養(yǎng)箱中29，℃振蕩吸附，分別用10，mg MIPs與NIPs平衡吸附，等溫吸附曲線如圖1所示.隨著DINP濃度的不斷增大，NIPs在10，μmol/L時的吸附量逐漸接近飽和，而MIPs的吸附量仍然繼續(xù)增大，同時MIPs對DINP的吸附量明顯大于NIPs.MIPs對DINP的最大吸附量2.29，mg/g是對應(yīng)NIPs最大吸附量0.50，mg/g的4.58倍.結(jié)果表明MIPs與DINP的結(jié)合能力更強，能對DINP特異性吸附.

圖1 MIPs和NIPs對DINP的等溫吸附曲線Fig. 1 Adsorption isotherm of MIPs and NIPs for DINP

2.2 電化學(xué)檢測

2.2.1 電化學(xué)分子印跡膜的選擇性

配制10～100，μmol/L的DINP及干擾物溶液，分別用修飾膜印跡電極進行檢測，檢測液為1，mmol/L鐵氰化鉀溶液，峰電流變化值與對應(yīng)濃度關(guān)系如圖2所示.由圖2可知：DEHP有一定的電流變化，而DMP和BBP只具有微弱的電流響應(yīng)，說明DMP和BBP與DINP的結(jié)構(gòu)差別較大，電化學(xué)響應(yīng)信號微弱，而DEHP與DINP的結(jié)構(gòu)較相似，使得DEHP能夠被吸附到印跡分子的孔穴上，引起一定的電化學(xué)信號變化；但并未對DINP形成顯著干擾，說明印跡膜電極與DINP之間的作用除了與其互補的官能團決定外，MIPs上的孔穴結(jié)構(gòu)也對二者的結(jié)合能力有較大影響，本研究制備的MIPs能夠?qū)INP進行特異性檢測.

圖2 不同物質(zhì)在分子印跡膜電極上的相對峰電流變化Fig. 2Peak current changes of MIP sensor vs concentration of different substances

2.2.2 電化學(xué)檢測標(biāo)準曲線繪制結(jié)果

制備好的印跡聚合膜對11組DINP溶液進行檢測，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同DINP濃度下的循環(huán)伏安圖以及DINP濃度與峰電流差的關(guān)系Fig. 3Cyclic voltammetry curves of different concentrations of DINP and relationship between DINP concentration and current peak difference

圖3（a）中a—k表示11組DINP濃度為50～1，000，nmol/L時對應(yīng)的循環(huán)伏安曲線.隨著DINP濃度的增大，MIPs膜中顆粒的印跡空穴越來越多的被DINP占據(jù)，電流I降低，即ΔI越來越大（圖3（b））. ΔI（單位為μA）與DINP的濃度（c，單位為nmol/L）在5×10-8～1×10-6，mol/L成良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI=0.03c+3.07（R2=0.998），檢測限為2.7× 10-8，mol/L.

2.3 功能單體的選擇及優(yōu)化

溶液中若只有互不產(chǎn)生影響的物質(zhì)存在，則該溶液的吸光度等于這些物質(zhì)吸光度的加和.模板分子與不同功能單體之間的相互作用力的強弱可以由功能單體和模板分子相互作用的理論吸光度和實際吸光度的差值大小來判斷，差值越大則說明該功能單體與模板分子的相互作用就越強［14］.DINP與各功能單體結(jié)合前后紫外吸收光譜如圖4所示.

圖4 DINP、3種單體及其混合物紫外吸收光譜圖Fig. 4 UV absorption spectra of DINP，three monomers and the mixtures of each monomer with DINP

圖4中DINP與MAA作用前后差值最大即與MAA的相互作用力最強，即結(jié)合能力最強.則以MAA為功能單體最適合制備MIPs.

得到不同比例MAA的MIPs對乙腈溶液中DINP的吸附結(jié)果如圖5所示.

圖5 不同比例功能單體的MIPs對DINP的吸附量Fig. 5Adsorption of different ratios of templatemonomer MIPs in DINP solution

圖5中DINP與MAA的物質(zhì)的量比為1∶1時MIPs的吸附量最小，物質(zhì)的量比為1∶3時吸附量最大，說明DINP與MAA的最佳物質(zhì)的量比為1∶3.

2.4 交聯(lián)劑的優(yōu)化

交聯(lián)劑優(yōu)化吸附結(jié)果如圖6所示.當(dāng)DINP∶MAA∶EGDMA的物質(zhì)的量比為1∶3∶30時吸附量最大，即DINP與EGDMA的物質(zhì)的量比為1∶30時MIPs對DINP的吸附量最強，即1∶30為最佳物質(zhì)的量比.

圖6 不同比例交聯(lián)劑的MIPs對DINP的吸附量Fig. 6Adsorption of different ratios of crosslinker MIPs in DINP solution

2.5 MIPs顆粒洗脫前后的形貌特征比較

洗脫前的MIPs表面比較粗糙，形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不規(guī)則；而洗脫后的MIPs存在交錯的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，相比于洗脫前孔結(jié)構(gòu)變得更多更緊密，并且相互貫穿聯(lián)通，具有一定的層次結(jié)構(gòu)（圖7）.這是因為模板分子與功能單體預(yù)聚合形成穩(wěn)定的預(yù)聚合物，模板分子周圍的聚合物鏈進行有序的排列，洗脫掉模板分子后留下分布均勻、形狀相對規(guī)整、能與模板分子互補的印跡孔穴和通道，這種孔穴和通道結(jié)構(gòu)能夠提高MIPs對印跡分子的結(jié)合速度，增加MIPs對印跡分子的特異性識別能力.

圖7 MIPs洗脫前和洗脫后的掃描電鏡圖Fig. 7 Scanning electron microscopy image of MIPs uneluted and eluted

2.6 實際樣品分析結(jié)果

循環(huán)伏安法掃描后通過方程計算得到加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表1，回收率為105.3%～115.7%，平行實驗間的相對標(biāo)準偏差（RSD）為0.4%～1.2%，均小于5%，說明本方法有較高的準確性.

表1 白酒中DINP的加標(biāo)回收率（n=5）Tab. 1 Recovery of DINP in white spirit sample（n=5）

3 結(jié) 論

本研究成功制備了MIPs，用于特異性檢測DINP.通過電化學(xué)循環(huán)伏安法檢測，線性檢測范圍為5×10-8～1×10-6，mol/L，檢測限為2.7×10-8mol/L，同時對實際樣品進行了加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)回收率為105.3%～115.7%，平行實驗間相對標(biāo)準偏差（RSD）為0.4%～1.2%實驗過程有較高的準確性.

本研究方法能夠快速檢測白酒中DINP的含量，不需要進行樣本前處理，可應(yīng)用于現(xiàn)場檢測；并且具備專一性強、檢測成本低、操作簡單、檢測時間短等優(yōu)點，能夠為食品安全監(jiān)督提供一種快速、準確、靈敏的檢測方法.同時，本方法制備的MIPs對DINP也有較強的吸附能力，對于白酒及食品生產(chǎn)過程中塑化劑的吸附去除也有較為理想的應(yīng)用前景.

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責(zé)任編輯：郎婧

Quick Detection of DINP in Samples by Molecular Imprinted Sensor

TAO Qiang，ZHANG Juankun，LIU Yingzi，JU Xiaocui，ZUO Juanjuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

An electrochemical sensor based on molecularly imprinted sensor for quick detection of DINP was developed in this research.Firstly，imprinted polymer particles（MIPs）were prepared through thermal polymerization.Then，MIPs and agarose were mixed in proportion.The electrochemical sensor for DINP was fixed by the mixture on a glassy carbon electrode.The sensor can be combined with the template molecule DINP and its electrochemical signals are influenced by DINP concentration.Thus，it could be used to detect DINP levels in samples，and DINP concentration was quickly detected in wine samples without sample pretreatment.The linear equation in this study was ΔI=0.03c+3.07，the correlation coefficient is R2=0.998，the linear range was 5×10-8-1×10-6，mol/L，the sensitivity limit was 2.7×10-8，mol/L，and the recovery rate was 105.3%-115.7%.

diisononyl phthalate；molecularly imprinted polymer particles；electrochemical sensor；detection；cyclic voltammetry

TQ212.3

A

1672-6510（2016）05-0014-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150179

2015-10-26；

2016-03-03

國際合作項目（14RCCFSF00140）

陶 強（1990—），男，河南人，碩士研究生；通信作者：張娟琨，教授，zhangjk@tust.edu.cn.