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    不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)大鼠原代間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較分析

    2016-11-16 11:51:16龔金秋王水蓮
    中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘 2016年7期
    關(guān)鍵詞:農(nóng)業(yè)大學(xué)脂質(zhì)體睪丸

    朱 玲 陳 強(qiáng) 龔金秋 曾 杰 胡 男 王水蓮

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長(zhǎng)沙 410128)

    不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)大鼠原代間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較分析

    朱 玲陳 強(qiáng)龔金秋曾 杰胡 男王水蓮

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué),湖南長(zhǎng)沙410128)

    目的:為了比較不同轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率,本實(shí)驗(yàn)以大白鼠原代細(xì)胞為模型比較了兩種不同轉(zhuǎn)染試劑的效果。方法: 以pEGFP為報(bào)告基因,用兩種轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞,用熒光顯微鏡觀察,分析兩種轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果:在質(zhì)粒為0.75μg和lipofectamine3000為0.75μl情況下,lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率最高(P<0.05),lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX。結(jié)論:與lipofectamine LTX相比,lipofectamine3000具有轉(zhuǎn)染效率高、劑量低和操作方便的優(yōu)點(diǎn)。

    大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染EGFP

    睪丸間質(zhì)細(xì)胞成群分布在曲細(xì)精管的疏松結(jié)締組織中。從青春期開(kāi)始,睪丸間質(zhì)細(xì)胞受垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的黃體生成素作用下能合成并分泌雄性激素。外源基因?qū)爰?xì)胞常用轉(zhuǎn)染的方法中應(yīng)用較多的包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、磷酸鈣轉(zhuǎn)染法和點(diǎn)穿孔法等。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染對(duì)于儀器試劑操作要求低,是針對(duì)一般細(xì)胞轉(zhuǎn)染應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)染方法。本研究以間質(zhì)細(xì)胞為模型,用二種不同轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染,分析轉(zhuǎn)染效率,可為研究間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1試劑與動(dòng)物

    含GFP基因的PEGFP-N1質(zhì)粒(由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供),opti-MEM、lipofectamine LTX和lipofectamine 3000試劑,膠原酶Ⅳ、DMEM高糖和四季青血清,3β-HSD染色液(實(shí)驗(yàn)室保存)。

    實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:8周齡雄性SD大白鼠(湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司)

    1.2方法

    1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與處理

    將大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分組,即lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染組(添加質(zhì)粒和lipofectamine LTX,用A表示)、lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染組(添加質(zhì)粒和lipofectamine 3000,用B表示)。A組依質(zhì)粒劑量與轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine LTX劑量分為A1組(0.8 μg:1 μl)、A2組(0.8 μg:2 μl)、A3組(0.8μg:3 μl)、A4組(1.0 μg:1 μl)、A5組(1.0 μg:2 μl)、A6組(1.0 μg:3 μl)、A7組(1.2 μg:1 μl)、A1組(1.2 μg:2 μl)、A1組(1.2 μg:3 μl),B組依質(zhì)粒劑量轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000劑量分為B1組(0.5 μg:0.75 μl)、B2組(0.75 μg:0.75 μl)、B3組(1.0 μg:0.75 μl)、B4組(0.5 μg:1.5 μl)、B5組(0.75μg:1.5 μl)、B6組(1.0 μg:1.5 μl)。

    1.2.2間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化與效率的比較

    (1)間質(zhì)細(xì)胞提取傳代

    依照膠原酶濃度差異法[3]提取間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),間質(zhì)細(xì)胞傳代2次,胰酶消化后以2×105個(gè)/孔的密度接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)轉(zhuǎn)染備用。

    (2)試劑轉(zhuǎn)染

    Lipofectamine LTX試劑不同劑量的質(zhì)粒溶解到50 μlopti-MEM中,加入1 uLlipofectamine Plus,各組不同劑量的lipofectamine LTX試劑溶解50 μlopti-MEM中,室溫靜置5 min,將兩種溶液混合,室溫靜置25 min,加入到含有500 μl無(wú)血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔板中,6 h后用含有血清培養(yǎng)基換液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置熒光顯微鏡照相并分析。同時(shí),用lipofectamine 3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,各組質(zhì)粒溶解到25 μlopti-MEM溶液中,加入1 μl P 3000,各組不同劑量lipofectamine 3000溶解于25 uLopti-MEM中,將兩種溶液混合,室溫靜置5 min,加入到500 μl含有血清和雙抗的培養(yǎng)基的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,48 h后用倒置熒光顯微鏡照相與并分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1lipofectamine LTX與lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞條件的優(yōu)化

    本研究結(jié)果表明lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑中A5組轉(zhuǎn)染效率最高,高于A6組和A8組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著(P<0.05),A2組高于A3組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著(P<0.05),A7組高于A9組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著(P<0.05),其他組別相比差異不顯著(P>0.05)(表1)。lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑中B2組轉(zhuǎn)染效率最高,高于B3組和B5組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著(P<0.05),B1組高于B4組轉(zhuǎn)染效率且差異顯著(P<0.05)(表2)。

    表1 不同劑量pEGFP和lipofectamineLTX轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞后48 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(%)

    表2 不同劑量pEGFP和lipofectamine3000轉(zhuǎn)染睪丸間質(zhì)細(xì)胞后48 h的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率(%)

    綜上可知lipofectamine LTX在質(zhì)粒1.0 ug,lipofectamine LTX 2 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高lipofectamine 3000在質(zhì)粒0.75 μg,lipofectamine3000 0.75 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。

    2.2lipofectamine 3000與Lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率

    圖1和圖2分別是lipofectamine 3000和lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染后的照片,圖1的轉(zhuǎn)染效率高于圖2的轉(zhuǎn)染效率。對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)染lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑比lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染效率高且差異顯著(P<0.05)(表3)。

    圖1 (40×)lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞

    圖2 (40×)lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞

    3 討論

    本研究是應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法比較轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率,結(jié)果中發(fā)現(xiàn),ipofectamine3000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒0.75 μg和轉(zhuǎn)染試劑0.75 μl時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高。但當(dāng)DNA加入過(guò)量時(shí),轉(zhuǎn)染效率反而下降,結(jié)果與文章報(bào)道一致。這可能是因?yàn)檫^(guò)量的質(zhì)粒DNA可以形成一個(gè)類聚集體會(huì)產(chǎn)生額外的阻力,從而影響轉(zhuǎn)染水平,也可能是過(guò)量DNA會(huì)降低與帶負(fù)電荷的物質(zhì)相互競(jìng)爭(zhēng)交換從LPP中解離出來(lái)的效率。

    轉(zhuǎn)染間質(zhì)細(xì)胞時(shí)lipofectamine3000試劑在操作過(guò)程中不需要必須使用無(wú)血清培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中可以含有血清、雙抗等,在轉(zhuǎn)染6 h后無(wú)需再次換液直到48 h于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察,因此操作較其他轉(zhuǎn)染試劑方便快捷,并且在轉(zhuǎn)染效率方面要高于lipofectamine LTX。雙抗對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)非常關(guān)鍵,有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng),降低細(xì)胞污染概率。對(duì)于轉(zhuǎn)染試劑的使用量增加轉(zhuǎn)染效率反而降低的原因是由于轉(zhuǎn)染試劑本身具有毒性,伴隨轉(zhuǎn)染試劑試劑量增加毒性也會(huì)增加。本試驗(yàn)中l(wèi)ipofectamine 3000的試劑和質(zhì)粒使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他轉(zhuǎn)染試劑的使用量,可減少陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)于細(xì)胞的毒性作用。lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染后細(xì)胞狀態(tài)會(huì)良好,傳代后細(xì)胞死亡少,細(xì)胞狀態(tài)良好。蔣靜思等研究表明,lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率明顯高于lipofectamine 2000,本實(shí)驗(yàn)中l(wèi)ipofectamine 3000轉(zhuǎn)染效率高于lipofectamine LTX轉(zhuǎn)染效率且差異性顯著。因此,在使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法中l(wèi)ipofectamine 3000是更加適合轉(zhuǎn)染大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的試劑。

    陳強(qiáng)(1990-),男,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

    朱琳(1994-),女,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)本科生,研究方向?yàn)榕R床獸醫(yī)學(xué)。

    王水蓮,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)教授。

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