可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物

鐘文英，王興如，許丹科，李鐘卉，李周敏

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 211198；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093）

可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物

鐘文英1，王興如1，許丹科2,*，李鐘卉2，李周敏2

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院分析化學(xué)教研室，江蘇 南京 211198；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210093）

目的：利用可視化蛋白芯片分析技術(shù)對(duì)牛乳中磺胺類和喹諾酮類抗生素多殘留的同時(shí)檢測(cè)。方法：采用間接競(jìng)爭(zhēng)法反應(yīng)原理，將磺胺類和喹諾酮類藥物的人工抗原以微陣列形式固定于微孔板底部，制備成微孔板生物芯片陣列，并依次與磺胺類和喹諾酮類單克隆抗體、納米銀標(biāo)記羊抗鼠IgG反應(yīng)，最后用納米銀增強(qiáng)法顯色，并采用可視化芯片掃描儀對(duì)微孔板顯色結(jié)果進(jìn)行快速掃描成像，圖像采用芯片分析軟件處理。結(jié)果：本法磺胺嘧啶和恩諾沙星線性范圍為分別為0.3～7.2 ng/mL和0.4～18 ng/mL。空白牛乳中加標(biāo)磺胺嘧啶（0.5、2.0、5.0 ng/mL）和恩諾沙星（0.5、3.0、15.0 ng/mL），結(jié)果牛乳中2 種藥物的加標(biāo)回收率分別為83%～110%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在10%以內(nèi)。結(jié)論：本法能夠用于牛乳樣本中磺胺類和喹諾酮類藥物的殘留的快速初篩。

蛋白質(zhì)芯片；間接競(jìng)爭(zhēng)法；多殘留檢測(cè)；磺胺類藥物；喹諾酮類藥物

為了控制動(dòng)物疾病的發(fā)生，養(yǎng)殖過程中會(huì)有多種藥物同時(shí)或交替使用的情況，這就導(dǎo)致了藥物多殘留的發(fā)生。磺胺類和喹諾酮類藥物均為廣譜抗菌藥，常被用于奶牛養(yǎng)殖業(yè)中。但是過量使用會(huì)導(dǎo)致其在奶牛體內(nèi)蓄積，進(jìn)而殘留在牛乳中，最終會(huì)影響人類的健康?；前奉愃幬锏陌胨テ谳^長(zhǎng)，容易在人體中蓄積而對(duì)人體產(chǎn)生很多危害，如藥物過敏性反應(yīng)、影響造血系統(tǒng)、損傷泌尿系統(tǒng)和耐藥性[1]。喹諾酮類藥物會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)消化道反應(yīng)、過敏反應(yīng)、血液系統(tǒng)造成不良反應(yīng)[2]。因此，很多國家對(duì)磺胺類和喹諾酮類藥物的使用及其在動(dòng)物源性食品中的殘留做了嚴(yán)格的規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部2002年規(guī)定了獸用磺胺類藥物最高殘留限量100 μg/kg，牛、雞、豬、羊、兔等動(dòng)物的肌肉、脂肪、肝、腎食品中達(dá)氟沙星、恩諾沙星等喹諾酮類獸藥最高殘留限量10～1 900 μg/kg[3-4]。

磺胺類和喹諾酮類藥物殘留的分析方法[5-6]主要有免疫法[4]、微生物法[7-8]和色譜法[7,9]等。免疫法中酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定及膠體金試紙條技術(shù)作為一種快速、方便、低成本、高通量的篩選手段，廣泛應(yīng)用于眾多領(lǐng)域，但是ELISA[6,8]只能檢測(cè)單組分殘留，而膠體金試紙條技術(shù)[7]容易出現(xiàn)高的假陽性率或假陰性率。微生物法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、成本低、檢測(cè)快速，但靈敏度不高，特異性差。色譜法然精確，但是存在設(shè)備昂貴、技術(shù)操作復(fù)雜、前處理繁鎖、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)及費(fèi)用高等缺點(diǎn)，決定其不適于大規(guī)模的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。蛋白芯片法具有高通量、檢測(cè)時(shí)間短、特異性高、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)外的研究中被廣泛應(yīng)用于臨床監(jiān)測(cè)、食品監(jiān)測(cè)、病毒監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域[10-23]。

本研究建立了一種可同時(shí)檢測(cè)牛乳中磺胺類和喹諾酮類藥物多殘留的可視化蛋白芯片法通過對(duì)抗原質(zhì)量濃度、抗體質(zhì)量濃度、納米銀標(biāo)記羊抗鼠IgG用量等條件的優(yōu)化，考察了方法的檢出限、回收率和線性范圍等，獲得了良好的分析結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺類單克隆抗體、磺胺類人工抗原、磺胺嘧啶對(duì)照品（USP Grade）、喹諾酮類單克隆抗體、喹諾酮類人工抗原、恩諾沙星對(duì)照品（USP Grade）、納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG、納米銀增強(qiáng)顯色液 南京祥中生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

點(diǎn)樣儀 清華大學(xué)自主研制；Q-array2000可視化生物芯片掃描儀、多管渦旋混旋儀、恒溫孔板振蕩儀 南京祥中生物科技有限公司；KQ218型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；單道可調(diào)移液器 蘇州百得實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；微孔板 南京祥中生物科技有限公司；顯色液A、顯色液B 美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的固定與封閉

本實(shí)驗(yàn)所用抗原為磺胺類-牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和喹諾酮類-BSA偶聯(lián)物。用生物芯片點(diǎn)樣儀在96微孔板上根據(jù)需要制備不同規(guī)格的矩陣，分別點(diǎn)不同質(zhì)量濃度的抗原，點(diǎn)樣量為50 nL/點(diǎn)，每樣分別重復(fù)3 個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)樣結(jié)束后，將芯片放于37 ℃恒溫箱里孵育2 h，使人工抗原固定于板底。每孔加入200 μL的芯片封閉液（含1% BSA的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate-buffered saline，PBS）），放于37 ℃恒溫箱里孵育2 h，然后用0.1%的PBST（含Tween-20的PBS）洗3 次，每次10 s，拍干，置于4 ℃待用。

1.3.2 微孔板生物芯片的分析檢測(cè)

制備好的板內(nèi)每孔加入25 μL的磺胺嘧啶和恩諾沙星混合標(biāo)準(zhǔn)品和25 μL的磺胺類和喹諾酮類混合單克隆抗體，放于37 ℃恒溫箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。每孔加入50 μL的納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG，放于37 ℃恒溫箱里孵育30 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。再在每孔加入50 μL的銀增強(qiáng)顯色劑（顯色液A+顯色液B體積比1∶1混合，現(xiàn)配現(xiàn)用），放于37 ℃恒溫箱里孵育15 min，然后用PBST洗3 次，每次10 s，拍干。利用可視化生物芯片掃描儀進(jìn)行掃描，并利用芯片分析軟件進(jìn)行結(jié)果處理分析。

1.3.3 牛乳樣本前處理

取1 mL牛乳，加入6 mL乙酸乙酯，振蕩（2 400 r/min，3 min），然后離心（4 500 r/min，15 min）后吸取上層有機(jī)層3 mL，氮吹。加入1 mL正己烷振蕩（2 200 r/min，5 min），再加入500 μL復(fù)溶液振蕩（2 000 r/min，5 min）。轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，離心（12 000 r/min，10 min），棄去上層有機(jī)相，取下層水相用于實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原抗體質(zhì)量濃度優(yōu)化

采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化。分別固定質(zhì)量濃度為2.8、1.4、0.7、0.35 mg/mL磺胺類的抗原和質(zhì)量濃度為3.6、1.8、0.9 mg/mL喹諾酮抗原，磺胺類單克隆抗體質(zhì)量濃度為800、400、200、100 ng/mL，喹諾酮單克隆抗體的質(zhì)量濃度為1 000、500、250、125 ng/mL。結(jié)果表明，抗原稀釋度增加孔內(nèi)及孔間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均會(huì)變大。低質(zhì)量濃度抗體時(shí)靈敏度高，但是信號(hào)值偏低，會(huì)造成孔內(nèi)CV會(huì)變大。檢測(cè)信號(hào)灰度值隨抗體質(zhì)量濃度增大而增大，但抗體質(zhì)量濃度過高時(shí)，信號(hào)飽和而使競(jìng)爭(zhēng)失去意義，在綜合考慮檢測(cè)精密度和靈敏度的基礎(chǔ)上，最終確定磺胺類抗原質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL，抗體質(zhì)量濃度為400 ng/mL，喹諾酮類抗原質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL，抗體質(zhì)量濃度為500 ng/mL（表1、2）。

表1 磺胺類抗原抗體篩選Table 1 Screening of sulfonamides antigen and antibody

表2 喹諾酮類抗原抗體篩選Table 2 Screening of quinolones antigen and antibody

2.2 納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG工作濃度的優(yōu)化

篩選濃度為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400的納米銀標(biāo)記的羊抗鼠IgG。納米銀標(biāo)記羊抗鼠IgG的量在這個(gè)體系中不是決定性的因素，但濃度過小會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)偏弱，增大了系統(tǒng)的誤差。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定納米銀標(biāo)記羊抗鼠IgG選1∶100稀釋度，可以得到較為滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3 納米銀催化顯色劑顯色時(shí)間的優(yōu)化

將銀增強(qiáng)顯色劑A液與B液按照體積比1∶1混合，每孔加入50 μL，分別顯色10、15、20 min。顯色過程中隨顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，0～10 min內(nèi)信號(hào)值變化很小，10～15 min信號(hào)值緩慢增加，15 min以后信號(hào)值明顯增加，且孔板中溶液的顏色不斷加深，造成背景值也明顯的增加，信噪比降低。顯色10 min時(shí)，雖然背景信號(hào)值很低，信噪比較高，但是點(diǎn)陣的信號(hào)值偏低，綜合考慮，選擇信噪比較高的15 min為最佳顯色時(shí)間。

2.4 磺胺類和喹諾酮類特異性實(shí)驗(yàn)

用間接競(jìng)爭(zhēng)法分別測(cè)定抗磺胺類單克隆抗體與磺胺類藥物、抗喹諾酮類單克隆抗體與喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)性，計(jì)算交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率/%=（50%抑制磺胺嘧啶（恩諾沙星）的質(zhì)量濃度/50%抑制磺胺（喹諾酮）類似物的質(zhì)量濃度）×100

結(jié)果表明抗磺胺類抗體與9種磺胺類藥物、抗喹諾酮類抗體與8種喹諾酮類藥物的交叉反應(yīng)率都達(dá)50%以上（表3）。

表3 抗磺胺類和喹諾酮類抗單克隆抗體的交叉反應(yīng)率Table 3 Cross-reactivity of monoclonal antibodies against sulfonamidesand quinolones

2.5 磺胺類和喹諾酮類抗原抗體的特異性反應(yīng)

通過將磺胺類抗體與喹諾酮抗原和不同質(zhì)量濃度（0、1、18、40 ng/mL）恩諾沙星做交叉反應(yīng)，以及喹諾酮類抗體與磺胺類抗原和不同質(zhì)量濃度磺胺嘧啶（0、1.8、7.2、20 ng/mL）的交叉反應(yīng)。結(jié)果如表4和5所示，磺胺類和喹諾酮類抗原抗體之間具有特異性反應(yīng)，相互之間基本無交叉反應(yīng)。

表4 磺胺類抗原抗體的特異性反應(yīng)Table 4 Specificity of antibody against sulfonamides antigen

表5 喹諾酮類抗原抗體的特異性反應(yīng)Table 5 Specificity of antibody against quinolones antigen

2.6 磺胺類和喹諾酮類二合一標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

探索磺胺類和喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)曲線采用間接競(jìng)爭(zhēng)法。每個(gè)抗原質(zhì)量濃度點(diǎn)印3 個(gè)平行微陣列點(diǎn)，信號(hào)值取其平均值。在一定范圍內(nèi)，隨著競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照品質(zhì)量濃度的增大，固定的人工抗原結(jié)合的抗體會(huì)越來越少，與其相結(jié)合的納米銀標(biāo)記羊抗鼠IgG的量也將隨之減少，因而檢測(cè)到的灰度值信號(hào)就越低，超過這個(gè)范圍，檢測(cè)灰度值不隨競(jìng)爭(zhēng)對(duì)照品的增大而變化。磺胺嘧啶對(duì)照品（0、0.3、0.9、1.8、3.6、7.2 ng/mL）與恩諾沙星對(duì)照品（0、0.4、1.0、2.4、6.0、18.0 ng/mL）混合溶液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)，圖1a為同時(shí)檢測(cè)磺胺類和喹諾酮類蛋白芯片競(jìng)爭(zhēng)抑制的掃描圖。采用Origin軟件對(duì)信號(hào)值與質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（lgC）作競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，如圖1b所示，磺胺類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.3～7.2 ng/mL，喹諾酮類藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為0.4～18 ng/mL。

圖1 同時(shí)檢測(cè)磺胺類和喹諾酮類蛋白芯片競(jìng)爭(zhēng)抑制掃描（a）和競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線（bb）Fig.1 Protein chip scanning images (a) and standard curves of competitive inhibition for simultaneous detection of sulfonamides and quinolones (b)

2.7 牛乳加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 磺胺類和喹諾酮類的加標(biāo)回收率Table 6 Recoveries of sulfonamides and quinolones spiked into blank milk

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，精確量取1 mL空白牛乳樣本，分別添加磺胺嘧啶（0.50、2.00、5.00 ng/mL）和恩諾沙星（0.50、3.00、15.00 ng/mL）的對(duì)照品，每個(gè)樣本測(cè)3 次。按照1.3.3節(jié)的方法處理后，質(zhì)量濃度范圍內(nèi)添加，磺胺類的回收率在85%～110%之間，喹諾酮類的回收率在83%～98%之間，CV均在10%以內(nèi)，可以滿足磺胺類和喹諾酮類殘留限量的要求（表6）。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)牛乳中磺胺類和喹諾酮類藥物的多殘留，該方法具有測(cè)定時(shí)間短、靈敏度高及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。養(yǎng)殖過程中多種獸藥同時(shí)或交替使用而造成的藥物多殘留對(duì)檢測(cè)提出了很大挑戰(zhàn)，因而開發(fā)能提高檢測(cè)效率、降低檢測(cè)的成本和避免漏檢的藥物多殘留分析方法具有重要意義，對(duì)于安全開發(fā)能同時(shí)檢測(cè)多種藥物殘留[24-25]的快速靈敏的方法更具有實(shí)際意義。

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Simultaneous Determination of Multiresidues of Sulfonamides and Quinolones in Milk with Visual Protein Chip

ZHONG Wenying1, WANG Xingru1, XU Danke2,*, LI Zhonghui2, LI Zhoumin2
(1. Department of Analytical Chemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. State Key Laboratory of Analytical Chemistry for Life Science, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Purpose: To develop a protein microarray method for the simultaneous detection of multiresidues of two veterinary drugs, sulfonamides and quinolones, in milk with a visual protein chip. Methods: A 96-well microplate was used as solid support, on which artificial antigens of sulfonamides and quinolones were immobilized, respectively. After immobilization, a mixture of antibodies to two analytes and either standard solutions containing the analytes or samples were added to the array reaction area. Silver nanoparticles (AgNPs)-labeled goat anti-mouse IgG were used as an indicator and nanosilver enhancement technique was applied to amplify the detection signals, producing black image on array spots visible with naked eyes. The signals were detected with a visual scanner; therefore the analyte residues could detected quantitatively. Results: The linear ranges for sulfonamides and quinolones were 0.3–7.2 ng/mL and 0.4–18 ng/mL respectively. The recovery rates were in the range of 83% to 110% for milk samples at spiked levels of 0.5/0.5, 2.0/3.0, and 5.0/15.0 ng/mL with coefficient of variation (CV) values ＜ 10%. Conclusions: These results indicate that the protein microarray method is suitable for the routine screening of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk.

protein chip; indirect competition; multiresidue detection; sulfonamides; quinolones

10.7506/spkx1002-6630-201602034

O657

A

1002-6630（2016）02-0193-05

鐘文英, 王興如, 許丹科, 等. 可視化蛋白芯片法同時(shí)檢測(cè)牛乳中殘留的磺胺類和喹諾酮類藥物[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 193-197. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Wenying, WANG Xingru, XU Danke, et al. Simultaneous determination of multiresidues of sulfonamides and quinolones in milk with visual protein chip[J]. Food Science, 2016, 37(2): 193-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602034. http://www.spkx.net.cn

2015-03-16

江蘇研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（KYZZ-0184）

鐘文英（1968—），女，教授，博士，研究方向?yàn)閮x器分析。E-mail：wyzhong@cpu.edu.cn

*通信作者：許丹科（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)樯镄酒?。E-mail：xudanke@nju.edu.cn