沙棘果油提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化及其脂肪酸組分測定

丁 健，關(guān) 瑩，阮成江，單金友，包怡紅，吳雨蹊

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.大連民族大學(xué)資源植物研究所，遼寧 大連 116600；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果 研究所，黑龍江 綏棱 152200）

沙棘果油提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化及其脂肪酸組分測定

丁 健1,2,3，關(guān) 瑩3，阮成江2，單金友3，包怡紅1,*，吳雨蹊3

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.大連民族大學(xué)資源植物研究所，遼寧 大連 116600；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院漿果 研究所，黑龍江 綏棱 152200）

利用超聲波輔助索氏提取技術(shù)對沙棘果肉提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，考察果油脂肪酸組分。通過進(jìn)行提取溫度、回流時(shí)間、料液比、超聲時(shí)間4 個(gè)因素的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，結(jié)果表明：沙棘果油的最佳提取條件為料液比1∶70（g/mL）、提取溫度55 ℃、超聲輔助提取30 min、索氏提取回流時(shí)間6 h，沙棘果油提取率為28.14%，其中共檢測出24 種脂肪酸，其中主要包括棕櫚油酸和棕櫚酸，相對含量分別為35.56%和59.37%。因此利用超聲波輔助索氏法提取沙棘果油，可以為醫(yī)藥和工業(yè)生產(chǎn)提供更優(yōu)質(zhì)和豐富的原材料。

沙棘果油；超聲波；索氏提?。粴庀嗌V-飛行時(shí)間質(zhì)譜；脂肪酸

沙棘（Hippophae L.）為胡頹子科沙棘屬植物，多年生落葉灌木或小喬木，適應(yīng)性強(qiáng)，能顯著改善生態(tài)環(huán)境[1]，其果實(shí)中含有豐富的天然活性成分，具有良好的藥用及保健價(jià)值[2-3]。沙棘油是沙棘果實(shí)中的最有價(jià)值的組分之一，對心腦血管、胃腸道、肝臟、皮膚組織等具有保護(hù)及修復(fù)作用，其中多不飽和脂肪酸ω-3和ω-6都是人體不能自身合成的脂肪族，ω-7脂肪酸（尤其棕櫚油酸，C16∶1）具有重要的工業(yè)、營養(yǎng)和醫(yī)藥價(jià)值，是珍稀的天然脂肪酸[4]。

沙棘的含油量與（亞）種、生長環(huán)境、采摘時(shí)期、提取方法等相關(guān)[5-7]，種子含油量約為7%～11%，非種子組織（鮮果肉和果皮）含油量約為1%～6%[8]。另外沙棘果中還含有抗壞血酸（VC）、生育酚、生育三烯酚、類胡蘿卜素等多種生物活性物質(zhì)[9-14]，其中每100 g沙棘果中含VC 800～2 100 mg，是獼猴桃的2～8 倍[15]。目前常用的提取沙棘果油的方法主要有壓榨法、溶劑浸提法、超臨界萃取法等[16]。壓榨法出油率低，非脂溶性活性物質(zhì)浸出不完全。一般溶劑浸提法存在提取時(shí)間長、溫度高等缺點(diǎn)[17]，其中索氏提取沙棘果油得率為13.2%～20.8%[18-19]。超臨界流體萃取法設(shè)備昂貴，且受超臨界流體、壓力和溫度等對物質(zhì)溶解度的局限[20]。超聲波輔助浸提法具有操作簡單、浸提溫度低、提取率高、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[21]，其應(yīng)用在沙棘果渣中仍可獲得7.49%的粗油[19]，另外在沙棘的總黃酮提取中也報(bào)道[22]。

由于提取方法的不同，油脂中的組分也存在一定的差異，脂肪酸含量是考察油脂品質(zhì)的指標(biāo)之一，有研究學(xué)者檢測出沙棘果肉和種子中共含有35 種脂肪酸[23]，但大多數(shù)學(xué)者主要研究C16和C18脂肪酸的變化[24-26]，果肉主要積累C16∶0（棕櫚酸，39.11%）和C16∶1（棕櫚油酸，26.72%），而種子主要積累C18∶2（亞油酸，33.72%）和C18∶3（亞麻酸，31.81%）[20]。有研究認(rèn)為沙棘果油的生物活性要優(yōu)于沙棘籽油，其非皂化質(zhì)中各類成分108 種，是籽油的2 倍多[27]，而且沙棘果肉中高積累棕櫚油酸的特性在自然界中罕見，其油脂的液相中可富集53%的棕櫚油酸，而沙棘果渣中仍含有15%棕櫚油酸[4,28]，其可減少人體膽固醇含量、增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性、防止心率失常和抑制腫瘤[29]。另外，沙棘果油為深棕色，在常溫條件下其穩(wěn)定性優(yōu)于籽油，但在低溫下常呈固體狀；另外，沙棘果油還含有特殊的芳香氣味，是區(qū)別于籽油的重要特征[27]。

本研究旨在利用超聲波提取省時(shí)及索氏提取率高的特點(diǎn)，對超聲波輔助索氏提取沙棘果油工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳沙棘果油提取工藝條件，采用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（gas chromatography coupled with time-of-flightmass spectrometry，GC-TOF-MS）技術(shù)對沙棘果油中的脂肪酸組分進(jìn)行定性和定量，旨在為高效利用沙棘果油這一生物質(zhì)能源提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果為2014年8月中旬采于黑龍江省沙棘工程技術(shù)中心，用干冰運(yùn)輸，-55 ℃保存；石油醚（30～60 ℃）、氯化鈉、氫氧化鉀（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟化硼-甲醇溶液、脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；甲醇、正己烷（均為色譜純） 美國Honeywell公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Clarus 680 GC和AxION iQT串聯(lián)MS 美國PerkinElmer公司；DB-23氣相色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；FreeZone冷凍干燥機(jī)美國Labconco公司；SB-5200D超聲波儀 寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果油提取工藝流程

沙棘果→分離果肉和種子→液氮研磨果肉→冷凍干燥至質(zhì)量恒定→準(zhǔn)確稱質(zhì)量嚴(yán)密包裝（含水量＜5%）→放入廣口瓶后添加石油醚稱質(zhì)量→超聲波提取后稱質(zhì)量，補(bǔ)足石油醚→全部轉(zhuǎn)入索氏提取管→索氏提取后過濾石油醚→55 ℃旋轉(zhuǎn)回收石油醚40 min→燒瓶室溫條件下（±25 ℃）放置24 h至質(zhì)量恒定→差量法稱質(zhì)量，計(jì)算沙棘果油提取效率，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用最小顯著性差異方法對單因素試驗(yàn)進(jìn)行方差分析。

1.3.2 沙棘果油提取率的計(jì)算

式中：R為沙棘果油提取率/%；m1為沙棘果油和接收瓶的質(zhì)量/g；m2為接收瓶的質(zhì)量/g；m為沙棘果肉干粉質(zhì)量/g。

1.3.3 沙棘果油提取的單因素試驗(yàn)

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，稱取4.0 g沙棘果肉干粉，在超聲功率200 W、超聲頻率40 kHz條件下，石油醚為提取溶劑，在提取溫度45、50、55、60、65 ℃，回流時(shí)間4、6、8、10、12 h，料液比1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g/mL），超聲時(shí)間0、10、20、30、40、50 min，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究這4 個(gè)因素對沙棘果油提取率的影響，均設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3.4 沙棘果油提取的正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，選取回流時(shí)間、超聲時(shí)間、料液比、提取溫度4 個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平，研究其對沙棘果油提取率的影響，重復(fù)2 次。正交試驗(yàn)方案見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

1.3.5 沙棘果油脂肪酸的GC-TOF-MS檢測

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)材料處理

沙棘果油的脂肪酸檢測包括3 份不同提取方法的樣品：Ⅰ. 超聲波輔助索氏提取樣品，即1.3.4節(jié)中最優(yōu)提取工藝（回流時(shí)間6 h、超聲時(shí)間30 min、料液比1∶70、提取溫度55 ℃）獲得的果油；Ⅱ. 超聲波法提取樣品，即超聲30 min，料液比1∶70條件下獲得的果油；Ⅲ. 索氏提取樣品，即回流時(shí)間6 h、料液比1∶70、提取溫度55 ℃條件下獲得的果油。

1.3.5.2 甲酯化

沙棘油常采用堿催化法進(jìn)行脂肪酸的甲酯化[19,27,30]。甲酯化方法根據(jù)彭密軍等[30]的方法，并做適宜改進(jìn)。取20 mg沙棘果油于具塞試管中，加入2 mL正己烷和5 mL的1 mol/L KOH-甲醇溶液，振蕩溶解樣品，于60 ℃水浴30 min后，加入10 mL三氟化硼-甲醇溶液，再于60 ℃水浴30 min，冷卻后，加入2 mL飽和氯化鈉和2 mL正己烷，靜置分層后，收集上清液，加入少量無水硫酸鈉干燥，上清液過0.2 μm微孔濾膜后入樣品瓶，-20 ℃冷藏備用。

1.3.5.3 氣相色譜質(zhì)譜條件及數(shù)據(jù)分析

采用DB-23色譜柱，進(jìn)樣口溫度230 ℃，載氣流速1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，分流比20∶1。柱箱升溫程序：50 ℃以15 ℃/min升至200 ℃，保持15 min；以3 ℃/min升溫至215 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min。電子電離源溫度230 ℃，傳輸線溫度245 ℃，檢測電壓1 400 V，溶劑延遲5 min，質(zhì)量掃描范圍45～400 u。根據(jù)37 種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品建立質(zhì)譜庫進(jìn)行樣品的定性，應(yīng)用峰面積歸一法進(jìn)行沙棘果油脂肪酸的相對定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對沙棘果油提取率的影響

圖1 提取溫度對提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield

在料液比1∶50、超聲時(shí)間20 min、回流時(shí)間10 h的條件下，不同提取溫度對提取率的影響見圖1。隨著提取溫度升高，提取率也逐漸升高，30～60 ℃沸程的石油醚隨著溫度升高，在索氏提取設(shè)備中回流速率加快，果油的萃取、滲透速率隨之加快，致使虹吸次數(shù)增多，油脂抽提更接近完全，除60 ℃處理外，65 ℃處理與其他處理均存在顯著性差異，但相對高的溫度更易導(dǎo)致石油醚過沸和損失，因此選擇50～60 ℃為沙棘果油提取溫度范圍。

2.1.2 索氏回流時(shí)間對沙棘果粉提取率的影響

圖2 回流時(shí)間對提取率的影響Fig. 2 Effect of refluxing time on extraction yield

如圖2所示，在提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間20 min、料液比1∶60的條件下，索氏提取回流時(shí)間在4～8 h時(shí)，回流次數(shù)明顯增多，果油提取率升高迅速；在8～12 h，提取率增速趨于平緩，8 h之后提取率差異不顯著。有效物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)溶解到細(xì)胞外，達(dá)到濃度平衡需要一定的時(shí)間，在達(dá)到平衡之前，提取時(shí)間越長，脂溶性物質(zhì)溶出越多，達(dá)平衡后，提取時(shí)間的延長會導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出[31]。從節(jié)省時(shí)間考慮，選擇回流8 h為最優(yōu)提取時(shí)間。

2.1.3 料液比對沙棘果油提取率的影響

圖3 料液比對提取率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to solvent on extraction yield

在提取溫度60 ℃、超聲時(shí)間20 min、回流時(shí)間8 h的條件下，不同料液比對提取率的影響見圖3。隨著溶劑用量的降低，沙棘果油提取率逐漸升高，溶劑用量過高或過低都不能對果粉中的油脂進(jìn)行充分提取。當(dāng)料液比為1∶70時(shí)果油的提取率為27.53%，之后又趨于穩(wěn)定，其與1∶30、1∶50處理存在顯著性差異，但與1∶90處理差異不明顯。這是溶劑的增多，溶解油脂更充分，因此料液比過大提取物的不能充分溶解于溶劑中，提取率低，但料液比過小則溶劑利用率低，造成浪費(fèi)和污染。因此最佳料液比為1∶70（g/mL）。

2.1.4 超聲時(shí)間對沙棘果油提取率的影響

圖4 超聲時(shí)間對提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonication time on extraction yield

如圖4所示，隨著超聲時(shí)間的延長，提取率先迅速提高，后逐漸趨于平緩。在料液比1∶70、提取溫度60 ℃、回流時(shí)間8 h的條件下，超聲輔助提取10～30 min時(shí)，提取率迅速上升，之后緩慢上升，50 min左右趨于平緩，30、40、50 min處理與10、20 min處理差異顯著，但30～50 ℃處理之間無差異顯著性。利用超聲波技術(shù)將果粉中的油脂迅速溶出到提取溶劑中，超聲30 min后，提取溶液體系的滲透壓趨于平衡，導(dǎo)致提取率也趨于穩(wěn)定，因此選取最佳超聲時(shí)間為30 min。

2.2 沙棘果油提取條件的正交試驗(yàn)優(yōu)化

由于回流8 h與10 h的沙棘果油提取率差異不顯著，為了節(jié)省提取時(shí)間，設(shè)置4、6、8 h回流時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2、3所示，影響沙棘果油提取率的各因素主次順序?yàn)镃＞D＞B＞A。因素C的P＜0.01，且極差R值大于其他三因素，說明料液比對指標(biāo)影響最大；因素D的P＜0.05，即提取溫度對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著；因素A、B對結(jié)果有一定影響。各主次指標(biāo)最高水平，組成較優(yōu)工藝條件為A2B3C2D2，即回流時(shí)間6 h、超聲時(shí)間30 min、料液比1∶70、提取溫度55 ℃為最佳提取工藝組合。

表2 正交試驗(yàn)提取優(yōu)化結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results foroptimization of extraction process

表 3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experimental results

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在索氏提取回流時(shí)間6 h、超聲時(shí)間30 min、料液比1∶70、提取溫度55 ℃條件下，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，沙棘果油提取率分別為28.10%、28.19%和28.12%，平均提取率為28.14%，因此確定A2B3C2D2為最佳提取方案。

2.4 沙棘果油脂肪酸的GC-TOF-MS檢測結(jié)果

利用DB-23極性色譜柱將37 種脂肪酸甲酯物質(zhì)完全分離（圖5A），應(yīng)用超聲波索氏提取法（圖5B）、超聲波提取法（圖5C）和索氏提取法（圖5D）的沙棘果油分別均檢測出24 種脂肪酸甲酯（表4），其中棕櫚酸（C16∶0）和棕櫚油酸（C16∶1）是沙棘果油的主要脂肪酸，超聲波索氏提取法、超聲波提取法和索氏提取法的棕櫚酸的相對含量分別為59.37%、64.28%和70.66%，棕櫚油酸的相對含量分別為35.56%、30.76%和26.91%。陳笑瑩等[32]研究表明應(yīng)用索氏提取法可檢測到21.66%的棕櫚油酸，而超聲波提取法僅檢測到18.41%的棕櫚油酸。棕櫚酸具有增加人體膽固醇和中性脂肪，防止血管變脆、腦出血等作用，而棕櫚油酸有降低無宜膽固醇，提高有益膽固醇比例的功效，有預(yù)防動(dòng)脈硬化的作用。可以看出超聲波輔助索氏提取法中的棕櫚油酸與棕櫚酸的相對比例最高，其對人體健康更加有益[17]。另外超聲波輔助索氏提取法的單不飽和脂肪酸相對含量最高，明顯高于其他2 種方法。

圖5 脂肪酸甲酯色譜圖Fig.5 Chromatograms of fatty acid methyl esters

表4 沙棘果油主要脂肪酸組成與相對含量Table 4 Fatty acid components and relative contents of sea buckthornfruit oil

3 結(jié) 論

索氏提取法是經(jīng)典的油脂提取方法，在其方法上的改進(jìn)可有效提高油脂利用率和改善脂肪酸比例，相關(guān)研究指出利用超聲波法提取植物性油脂不僅可以提高有效成分的提取率，避免主要生物成分的生理活性的損耗，而且可以增加其在油脂中的含量[33]。通過超聲波輔助索氏提取法對沙棘果油的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出料液比對沙棘果油提取率的影響最大，優(yōu)化得到沙棘果油最佳提取條件：在超聲功率200 W、超聲頻率40 kHz、回流時(shí)間6 h、超聲時(shí)間30 min、料液比1∶70（g/mL）、提取溫度55 ℃條件下，沙棘果油的提取率可達(dá)28.14%，應(yīng)用堿催化法在沙棘果油中檢測到24 種脂肪酸，棕櫚油酸含量為35.56%，該方法的提取率明顯高于有機(jī)溶劑萃取法（4.1%～8.9%），而棕櫚油酸含量（31.4%～36.8%）相近[34]，另外超聲波輔助索氏提取法的果油提取率還明顯高于一些新技術(shù)方法，如分子蒸餾法（19.3%）、復(fù)合酶解法（4.95%）和超臨界CO2萃取法（5.82%），而檢測到的棕櫚油酸含量相似[35-38]。由此可見，應(yīng)用超聲波輔助索氏提取法可以高效利用沙棘果油，應(yīng)用GC-TOF-MS方法不僅檢測出高含量的棕櫚油酸和棕櫚酸，它們在化妝品、醫(yī)藥保健品和工業(yè)用品生產(chǎn)中具有重要作用，而且檢測到微量的DHA（C22∶6），其是神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞生長及維持的重要元素。在當(dāng)今能源逐漸匱乏，優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)資料短缺的形式下，高效利用生物質(zhì)能源越發(fā)成為研究熱點(diǎn)，利用超聲波輔助索氏提取沙棘果油，可低成本、高時(shí)效的為生產(chǎn)和開發(fā)提供優(yōu)質(zhì)原材料，并為高效利用和生產(chǎn)高品質(zhì)沙棘果油提供技術(shù)參考。

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Optimization by Orthogonal Array Design of Sea Buckthorn Fruit Oil Extraction and Determination of Fatty Acid Composition

DING Jian1,2,3, GUAN Ying3, RUAN Chengjiang2, SHAN Jinyou3, BAO Yihong1,*, WU Yuxi3
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2. Institute of Plant Resources, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China; 3. Institute of Berries, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Suiling 152200, China)

The ultrasound-assisted Soxhl et extraction of sea buckthorn oil from dry pulp was optimized by orthogonal array design, and the fatty acid composition and contents of sea buckthorn pulp oil were determined by gas chromatography (GC) coupled with time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS). Using combination of single-factor and orthogonal experiments, the optimal conditions for sea buckthorn fruit oil extraction were as follows: solid/solvent ratio, 1:70 (g/mL); ultrasonicassisted extraction time, 30 min; extraction temperature, 55 ℃; and Soxhlet reflux extraction time, 6 h. Under the optimized conditions, the yield of sea buckthorn oil from dry pulp was 28.14%. Twenty-four fat ty acids were detected from the oil, and the main fatty acids palmitoleic and palmitic acid were 35.56% and 59.37%, respectively, which are widely used in chemical, health products and cosmetics. Therefore the sea buckthorn fruit oil extracted by the ultrasound-assisted Soxhlet extraction method can provide a high-quality, abundant raw material for medicine and industrial production.

sea buckthorn pulp oil; ultrasonic; Soxhlet extraction; gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry (GC-TOF-MS); fatty acids

10.7506/spkx1002-6630-201602003

S663.9

A

1002-6630（2016）02-0013-06

丁健, 關(guān)瑩, 阮成江, 等. 沙棘果油提取工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化及其脂肪酸組分測定[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(2): 13-18. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201602003. http://www.spkx.net.cn

DING Jian, GUAN Ying, RUAN Chengjiang, et al. Optimization by orthogonal array design of sea buckthorn frui t oil extraction and determination of fatty acid composition[J]. Food Science, 2016, 37(2): 13-18. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201602003. http://www.spkx.net.cn

2015-06-02

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31570681）

丁?。?983—），男，助理研究員，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锘钚猿煞掷门c分子育種。

E-mail：mervyntin2901@aliyun.com

*通信作者：包怡紅（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物活性成分生物轉(zhuǎn)化和食品生物技術(shù)。

E-mail：baoyihong@163.com