對羥基苯甲酸處理對采后柑橘炭疽病的抑制及機(jī)理研究

黃小蘭蓋智星 王日葵,2,3賀明陽,2,3 韓 冷,2,3 周 煉,2,3

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；3. 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712)

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對羥基苯甲酸處理對采后柑橘炭疽病的抑制及機(jī)理研究

黃小蘭1蓋智星1王日葵1,2,3賀明陽1,2,3韓 冷1,2,3周 煉1,2,3

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；3. 國家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712)

采用體外平板接菌試驗(yàn)和體內(nèi)果實(shí)接種試驗(yàn)測定對羥基苯甲酸對采后柑橘炭疽病致病菌(膠孢炭疽菌)的生長抑制作用；觀測經(jīng)對羥基苯甲酸處理后，接種和未接種病原真菌的柑橘果實(shí)中多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性、丙二醛(MDA)含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明：對羥基苯甲酸對采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抑菌活性，濃度越高，對病原菌的抑制作用越強(qiáng)，其EC50為0.056 mg/mL。經(jīng)對羥基苯甲酸處理的柑橘果實(shí)中，PPO、POD、SOD、PAL活性升高，MDA含量下降。并且對羥基苯甲酸誘導(dǎo)的抗性相關(guān)酶在整個(gè)試驗(yàn)過程中維持較高的活性。對羥基苯甲酸處理對采后柑橘炭疽病病原菌有較強(qiáng)的抗菌作用，能提高柑橘果實(shí)相關(guān)抗性酶活性以及抑制膜脂過氧化反應(yīng)，誘導(dǎo)其果實(shí)抗性。對柑橘采后貯藏保鮮具有重要意義。

對羥基苯甲酸；膠孢炭疽菌；柑橘；貯藏保鮮；抑菌活性；抗氧化酶活性

柑橘是中國重要的經(jīng)濟(jì)水果，其年產(chǎn)量世界第一。中國種植柑橘已有4 000多年的歷史，產(chǎn)業(yè)分布范圍廣[1-2]。柑橘的耐貯性較好，但隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對柑橘的需求增多，對柑橘的供應(yīng)周期有更長的要求[3]。而每年因腐爛變質(zhì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，柑橘真菌性病原菌的侵染是使其發(fā)生腐爛變質(zhì)的主要原因之一。柑橘貯藏期間的主要真菌病害有青綠霉病、炭疽病、酸腐病等[4]。

柑橘炭疽病的病原菌主要為膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)[5]?？汕秩靖涕偃~片、幼果以及成熟果實(shí)，其侵染特性為潛伏侵染[6]?？刂铺烤也τ谔岣吒涕佼a(chǎn)量以及采后貯藏保鮮具有重要意義。目前炭疽病的防治有采用拮抗菌或噴灑殺菌劑來抑制、殺滅炭疽菌的生長繁殖[7-8]。然而最主要的方式依然為噴灑化學(xué)殺菌劑，而化學(xué)殺菌劑的藥劑殘留、病菌耐藥性問題也同樣日趨嚴(yán)重[9-10]。因此，尋找安全有效的保鮮方法已成為柑橘貯藏中亟待解決的問題。

柑橘果皮內(nèi)含有香精油、總酚、類黃酮等多種活性成分[11]。如精油中含多種低分子的抗氧化和抗菌物質(zhì)，可作為果蔬保鮮劑使用[12-13]。利用果實(shí)本身含有的抗菌物質(zhì)來作為保鮮成分已成為目前研究的新趨勢。對羥基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid，p-HBA)是一種酚酸類物質(zhì)，柑橘皮內(nèi)本身也含有一定量的對羥基苯甲酸[14-15]。大量研究顯示酚酸類物質(zhì)具有抗菌、抗氧化、抗炎癥以及抗心血管疾病等多種生理功能[16-17]，如p-香豆酸就具有抗癌活性[18]。對羥基苯甲酸具有良好的抑菌性，且副作用較苯甲酸或水楊酸及其衍生物小，在一定濃度范圍內(nèi)對生物體無害[19]。其酯類常作為食品、藥物等的防腐劑， GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定限量標(biāo)準(zhǔn)為0.012 g/kg。研究[20]表明，對羥基苯甲酸在一定濃度下對草莓?；图怄哏牭毒咦用劝l(fā)和菌絲生長均有顯著的抑制作用。Heleno等[21]從靈芝提取物中分離得到對羥基苯甲酸，經(jīng)抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其對多種細(xì)菌和真菌均具有廣譜的抑菌活性。與氨芐青霉素等多種抗菌藥物的作用相當(dāng)。Farhoosh等[22]研究發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸及其衍生物有良好的抗氧化活性，在DPPH自由基清除試驗(yàn)中活性較高。

對羥基苯甲酸作為果蔬防腐保鮮劑尚未見報(bào)道，因此本研究擬選用低濃度對羥基苯甲酸為試驗(yàn)材料，研究其對柑橘炭疽病病原菌的抑菌活性及其對果實(shí)體內(nèi)相關(guān)抗性酶和抗性物質(zhì)的影響，旨在為柑橘炭疽病的防治和柑橘采后保鮮研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所貯藏課題組保藏；

對羥基苯甲酸：分析純，成都市科龍化工試劑廠；

錦橙：品種為北碚447#錦橙，采于重慶市歇馬鎮(zhèn)果園；

紫外分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限公司；

通用環(huán)境實(shí)驗(yàn)箱：MIR-352H-PC型，松下健康醫(yī)療器械株式公社；

醫(yī)用低溫培養(yǎng)箱：MDF-U4186S型，松下健康醫(yī)療器械株式公社；

臺式高速冷凍離心機(jī)：H1850R型，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柑橘果皮內(nèi)對羥基苯甲酸含量的測定 選擇成熟度相近、外觀整齊、無機(jī)械損傷的錦橙果實(shí)，清洗并用75%酒精消毒，晾干備用。試驗(yàn)組針刺接種10 μL孢子懸浮液，針刺深度為2 mm，針孔直徑為1 mm，對照組接種等量無菌水。28 ℃ 95% RH培養(yǎng)，于不同天數(shù)取樣(0，2，4，7，10 d)，液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱備用。參照文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行。

1.2.2 病原菌及其孢子懸浮液的制備 將膠孢炭疽菌菌種于馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)上，28 ℃培養(yǎng)10 d。用無菌水將膠孢炭疽菌刮下，過濾后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并調(diào)整濃度為1×106mL-1。

1.2.3 對羥基苯甲酸對膠孢炭疽菌體外生長抑制作用的測定 參照Bautista-Banos等[24]的方法，并加以改進(jìn)。分別制成含不同濃度(2，1，0.5，0.25，0.125 mg/mL)對羥基苯甲酸的PDA培養(yǎng)基，以不含藥物作為對照。首先使用打孔器將已培養(yǎng)5 d的菌盤制成菌餅，接于培養(yǎng)基中央，各個(gè)處理重復(fù)3次，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察菌落形態(tài)，并利用十字交叉法測量菌落直徑，直到對照組的菌落即將長滿整個(gè)培養(yǎng)皿。生長抑制率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——生長抑制率，%；

D1——對照組菌落直徑，mm；

D2——處理組菌落直徑，mm；

D——菌餅直徑，mm。

1.2.4 對羥基苯甲酸對膠孢炭疽菌體內(nèi)生長的抑制效果

以0.25 mg/mL對羥基苯甲酸為試驗(yàn)濃度，無菌水為對照。選擇外觀無損傷，大小一致且無病蟲害的果實(shí)，清洗干凈后用75%的酒精擦拭消毒，在果實(shí)的赤道部位切取直徑為5 cm的果片為試驗(yàn)材料。將果片浸泡于溶液中2 min，晾干備用。在果片的中央打一個(gè)寬1 mm×深1 mm的傷口，接入濃度為1×106mL-1的孢子懸浮液10 μL。風(fēng)干后置于鋪有浸濕脫脂棉的消毒鐵盤內(nèi)，用保鮮膜密封，以保持盤內(nèi)濕度。置于28 ℃、RH 95%的培養(yǎng)箱內(nèi)貯藏。3 d后測定果片的發(fā)病率和病斑直徑。每個(gè)處理20個(gè)果片，設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 柑橘抗性酶的誘導(dǎo)及抗性物質(zhì)的測定 選擇試驗(yàn)果清洗、消毒后晾干備用。本試驗(yàn)共分為5個(gè)處理：第一組為自然貯藏的果實(shí)，第二組為只打孔(寬4 mm×深2 mm)的果實(shí)，第三組打孔后接種10 μL濃度為1×106mL-1的孢子懸浮液，第四組打孔后接入20 μL 0.25 mg/mL的對羥基苯甲酸溶液，第五組為打孔后先接入20 μL 0.25 mg/mL的對羥基苯甲酸溶液，再接種10 μL濃度為1×106mL-1的孢子懸浮液。所有果實(shí)晾干后單果包裝，放于28 ℃、RH 95%的保濕培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于處理后第0、1、2、4、6、9天取樣后經(jīng)液氮速凍，置于-80 ℃冰箱保存。測定酶活及MDA含量。測定時(shí)取樣部位為病斑周圍2 cm×2 cm組織。每個(gè)處理10個(gè)果實(shí)，每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 PPO及POD酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[25]。PPO以每分鐘每克樣品吸光度變化(△A410nm)0.01為一個(gè)酶活力單位，POD以每分鐘每克樣品吸光度變化(△A470nm)0.01為一個(gè)酶活力單位，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 SOD酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[26]。以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需的酶量為一個(gè)酶活性單位。

1.2.8 PAL酶活性的測定 參照文獻(xiàn)[27]。以每小時(shí)每克果皮(鮮重)酶促體系在290 nm波長吸光度增加0.01為一個(gè)酶活力單位。

1.2.9 MDA含量的測定 參照文獻(xiàn)[28]，修改如下：稱取液氮研磨樣品2.0 g。加入30 mL三氯乙酸(5%)，于4 ℃冰箱放置過夜，10 000 r/min離心10 min，收集上清液用于測定。取5 mL上清液，再加入5 mL 2-硫代巴比妥酸(0.5%)。沸水浴20 min后水浴冷卻，再次離心(5 000 r/min，10 min)，以2-硫代巴比妥酸(0.5%)為空白對照測定在532，600，450 nm處的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 對羥基苯甲酸含量在果皮內(nèi)的變化

圖1為柑橘接種膠孢炭疽菌后，經(jīng)HPLC測定果皮內(nèi)對羥基苯甲酸含量的變化。由圖1可知，試驗(yàn)組在接種病原菌后，對羥基苯甲酸含量呈先上升后下降的趨勢。對照組的含量變化不明顯。這可能是對羥基苯甲酸在病原菌侵染過程中作為抗菌物質(zhì)大量合成，以此減輕對植物的傷害。因此推測在植物—病原菌互作過程中，病原菌的侵染誘導(dǎo)了果實(shí)的抗性反應(yīng)，使得相關(guān)抗性物質(zhì)含量升高。

2.2 不同濃度的對羥基苯甲酸對膠孢炭疽菌體外生長的抑制作用

由圖2、3可知，對羥基苯甲酸對柑橘膠孢炭疽菌表現(xiàn)出不同程度的生長抑制作用。隨著對羥基苯甲酸濃度的提高，抑制率逐漸增大，抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí)的抑制作用最強(qiáng)，達(dá)到98.56%。對羥基苯甲酸濃度對數(shù)與病原菌生長抑制率之間為線性關(guān)系，線性方程Y=1.730+1.383X，模型擬合優(yōu)度檢驗(yàn)c2=0.087，P=0.993，表明模型擬合良好。

圖1 不同處理柑橘果皮內(nèi)對羥基苯甲酸含量的變化

圖2 對羥基苯甲酸濃度對柑橘炭疽病菌的抑制作用

Figure 2 Inhibitory effects of different concentrations ofp-Hydroxybenzoic acid onC.gloeosporiodies

圖3 對羥基苯甲酸濃度對膠孢炭疽菌生長的抑制作用

Figure 3 Inhibitory effects of different concentrations ofp-Hydroxybenzoic acid onC.gloeosporiodies

2.3 對羥基苯甲酸對膠孢炭疽菌體內(nèi)生長的抑制效果

由表1可知，當(dāng)對羥基苯甲酸濃度為0.25 mg/mL時(shí)，試驗(yàn)組的病斑直徑為2.18 mm，對照組為3.51 mm，病斑抑制率為38.01%，對羥基苯甲酸明顯抑制了病斑的擴(kuò)展。因此，對羥基苯甲酸對柑橘炭疽病具有一定抑制效果。

表1 對羥基苯甲酸對柑橘炭疽病的抑制效果?

? 同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖4 對羥基苯甲酸對柑橘炭疽病的抑制效果

2.4 不同處理對柑橘果實(shí)相關(guān)抗性酶活性的影響

PPO為多酚氧化酶，能催化醌類物質(zhì)和木質(zhì)素的形成，在植物體內(nèi)構(gòu)成保護(hù)性屏障，阻擋病菌的侵害。圖5中可看出試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸)的PPO活性先上升后趨于穩(wěn)定，且其酶活性在后期高于對照組。CK3組的酶活性高于CK1自然組，說明果實(shí)受病原菌侵染后會產(chǎn)生抗性反應(yīng)，引起PPO活性的提高。試驗(yàn)組(孔+對羥基苯甲酸+菌)的PPO活性在第2天達(dá)到峰值后便下降，這可能有兩方面原因：① 對羥基苯甲酸抑制病原菌的生長，使得病原菌無法誘導(dǎo)果實(shí)抗性；② 對羥基苯甲酸參與提高果實(shí)抗性的部分減弱，從而導(dǎo)致了酶活性的降低。綜上所述，對羥基苯甲酸具有誘導(dǎo)果實(shí)PPO活性以及抑制病原菌生長的作用。

POD為過氧化物酶，能夠催化過氧化氫的分解，防治過氧化氫對植物造成傷害。由圖6可知，CK1、CK2、試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸)果實(shí)的酶活性均呈先上升后下降的趨勢，但試驗(yàn)組始終高于對照組。其酶活性在第4天達(dá)到峰值54.17 U/(g·min)。并且在貯藏前期試驗(yàn)組(孔+對羥基苯甲酸+菌)的酶活性均高于CK2和CK3，從第6天開始下降。試驗(yàn)結(jié)果表明：在果實(shí)表面接種病原菌和打孔都能使PPO活性升高，當(dāng)添加對羥基苯甲酸后，果實(shí)的PPO活性更高。因此可以得出對羥基苯甲酸具有誘導(dǎo)果實(shí)POD活性升高的作用。

SOD是重要的保護(hù)酶，它能夠清除超氧陰離子自由基，保護(hù)果實(shí)免于傷害。圖7中CK1的酶活性在前期基本不變，CK2的酶活性波動較大，試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸)SOD活性在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)波動較小，第4天達(dá)到峰值，但酶活性平均值高于對照，且下降速度較慢。圖7中CK3的酶活性先急劇下降再上升，與試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸+菌)基本相似，但試驗(yàn)組酶活性高于CK3組?？赡苁峭庠刺砑訉αu基苯甲酸能觸發(fā)果實(shí)內(nèi)SOD酶合成，清除果實(shí)因機(jī)械損傷和病菌侵染產(chǎn)生的自由基等物質(zhì)，使得果實(shí)維持生理狀態(tài)。由此說明當(dāng)有病原菌侵染柑橘果實(shí)時(shí)，用對羥基苯甲酸處理果實(shí)可以適當(dāng)提高果實(shí)SOD活性。

圖5 不同處理下柑橘果實(shí)多酚氧化酶(PPO)活性的變化

圖6 不同處理下柑橘果實(shí)過氧化物酶(POD)活性的變化

PAL是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，能夠催化生成黃酮體、生物堿、木質(zhì)素等與抗性相關(guān)的苯丙烷類物質(zhì)。圖8中試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸)酶活性呈先上升后下降的趨勢，在第4天達(dá)到峰值。對照組CK2酶活性波動范圍較大，可能是打孔對果實(shí)造成物理傷害使得酶活性發(fā)生變化。圖8中第1天試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸+菌)的酶活性最高，說明對羥基苯甲酸的加入促進(jìn)了PAL活性的升高，第2～4天時(shí)，CK3組酶活性上升，試驗(yàn)組酶活性下降，這與圖5中PPO活性在后期的變化相似。但在第6天后，由于果實(shí)衰老加速和藥物的作用，PAL活性又開始升高。因此可推測對羥基苯甲酸同樣具有誘導(dǎo)PAL活性升高以及抑制病原菌生長的作用。

圖7 不同處理下柑橘果實(shí)超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化

Figure 7 Changes of Superoxide Dismutase (SOD) activity with different treatment in citrus

圖8 不同處理下柑橘果實(shí)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化

2.5 不同處理對柑橘果實(shí)MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，通過MDA可了解膜脂過氧化程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。圖9試驗(yàn)組中MDA含量與對照組MDA含量均呈先下降后上升再下降的趨勢，但試驗(yàn)組(打孔+對羥基苯甲酸，打孔+對羥基苯甲酸+菌)含量分別低于CK2、CK3對照組，原因可能是對羥基苯甲酸能抑制果實(shí)內(nèi)MDA的合成，減小膜脂過氧化程度，從而使果實(shí)的生理傷害較小。表明對羥基苯甲酸能降低果實(shí)膜脂過氧化程度，提高果實(shí)抗性。

圖9 不同處理下柑橘果實(shí)丙二醛(MDA)含量的變化

3 結(jié)論與討論

對羥基苯甲酸常用作食品添加劑和抗菌物質(zhì)使用，在一定濃度范圍內(nèi)對生物體無害。本試驗(yàn)采用低濃度對羥基苯甲酸為材料，確保了其環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。在體外試驗(yàn)中，對羥基苯甲酸能較強(qiáng)地抑制膠孢炭疽菌的生長繁殖，且濃度越高，抑制效果越好。濃度為2 mg/mL時(shí)的抑制作用達(dá)到98.56%，基本完全抑制了膠孢炭疽菌的生長。在體內(nèi)試驗(yàn)中，測試的濃度為0.25 mg/mL，果實(shí)的病斑抑制率為38.01%。這與酚酸具有較強(qiáng)抗菌性的結(jié)果相吻合。經(jīng)對羥基苯甲酸處理的柑橘果實(shí)，其抗性相關(guān)酶(PPO、POD、SOD、PAL)活性上升，MDA含量下降。說明對羥基苯甲酸具有誘導(dǎo)果實(shí)抗性升高的作用。綜上所述，對羥基苯甲酸具有抑制膠孢炭疽菌生長和誘導(dǎo)果實(shí)抗性的作用。對柑橘采后保鮮具有重要意義。

前人研究[29]表明，在植物—病原菌互作過程中，植物可通過生成相關(guān)抗病物質(zhì)包括木質(zhì)素等以抵抗外界病菌侵染。因此利用外源的添加物如酚酸、酯類等化合物來提高植物抗性成為目前研究的熱點(diǎn)，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，使用對羥基苯甲酸作為外源添加物，證實(shí)了其對柑橘果實(shí)相關(guān)抗性酶具有誘導(dǎo)作用，能減少膜脂過氧化程度。但其內(nèi)在機(jī)制還有待研究，需要運(yùn)用其他一些生物學(xué)方法。

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Mechanism and inhibitory effect of p-hydroxybenzoic acid on anthracnose in postharvest citrus

HUANG Xiao-lan1GEZhi-xing1WANGRi-kui1,2,3HEMing-yang1,2,3HANLeng1,2,3ZHOULian1,2,3

(1.CitrusResearchInstitute,SouthwestUniversity,Chongqing400712,China;2.CitrusResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Chongqing400712,China;2.NationalCitrusEngineeringResearchCenter,Chongqing400712,China)

To explore the antifungal activity and potential mechanism ofp-Hydroxybenzoic acid againstColletotrichumgloeosporioidesin postharvest Citrus. The addition ofp-HBA in-vitro and in-vivo was conducted to test the inhibitory effect. Dynamic changes of peroxidase (POD), polyphenoloxidase(PPO), Superoxide Dismutase (SOD), Ammonia-lyase (PAL)activity and the content of Malondialdehyde(MDA) with different treatment was studied in postharvest citrus.p-HBA displayed strong antifungal activity toC.gloeosporioides，when the concentration was higher, the effect was increased. The value ofEC50is 0.056 mg/mL. The activities of PPO, POD, SOD and PAL were increased when inoculated withp-HBA andC.gloeosporioides, while the content of MDA was decreased.p-Hydroxybenzoic acid has a strong antimicrobial activity, which can induce the increase of defending enzyme’s activity and decrease the peroxidation of membrane lipid, The significance obviously is there for citrus fresh-keeping.

p-hydroxybenzoic acid;Colletotrichumgloeosporioides; postharvest citrus; storage and fresh-keeping; antifungal activity; antioxidase activity

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(編號：201203034)；重慶市科技支撐示范工程項(xiàng)目(編號：cstc2014fazktjcsf80007)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(編號：XDJK2013C014)

黃小蘭，女，西南大學(xué)在讀碩士研究生。

王日葵(1962—)，男，西南大學(xué)柑桔研究所副研究員。

E-mail：ewrk@163.com

2016—01—20