益氣復(fù)生方對小鼠胃癌脾氣虛證的代謝組學(xué)影響

何娜娜，胡　蘭，陳　音

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊　830011)

?

益氣復(fù)生方對小鼠胃癌脾氣虛證的代謝組學(xué)影響

何娜娜，胡蘭，陳音

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，烏魯木齊830011)

目的探討益氣復(fù)生方對小鼠胃癌脾氣虛證的代謝組學(xué)影響。方法20只健康雄性小鼠，140 d白醋+2-乙基亞硝胺干預(yù)條件下建立胃癌脾氣虛證小鼠模型，取存活的15只小鼠中表型和體質(zhì)量相近的12只，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予40 g/kg體質(zhì)量益氣復(fù)生方灌胃，對照組給予相同質(zhì)量的蒸餾水，均連續(xù)14 d處理。經(jīng)變量重要性投影(VIP)的參數(shù)評價(jià)可能的小鼠血清生物標(biāo)志物，對兩組小鼠血清生物標(biāo)志物進(jìn)行核磁共振(1H-NMR)檢測，觀察兩組小鼠相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)過益氣復(fù)生方的治療后體質(zhì)量、攝食量、活動(dòng)度增加，大便部分成型，毛發(fā)由枯槁恢復(fù)為正常黑棕色，有光澤。對照組小鼠與建模成功時(shí)無明顯變化。經(jīng)變量重要性投影(VIP)的參數(shù)評價(jià)可能的胃癌脾氣虛證小鼠血清生物標(biāo)志物包括3-羥基丁酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、甲硫氨酸、谷氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、甘油三酯、不飽和脂肪酸和膽堿。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清1H-NMR 譜中代謝產(chǎn)物中3-羥基丁酸、甲硫氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺的含量低于對照組(P<0.05)，低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、甘油三酯、不飽和脂肪酸和膽堿的含量則高于對照組(P<0.05)，葡萄糖的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論益氣復(fù)生方對小鼠的胃癌脾氣虛證具有顯著的治療效果，其作用可能是通過調(diào)控能量代謝水平及脂質(zhì)代謝水平的來實(shí)現(xiàn)的。

益氣復(fù)生方；小鼠；代謝組學(xué)；血清

胃癌是發(fā)生率居于第四位的惡性腫瘤疾病，并且胃癌的致死率在所有惡性腫瘤中居于第二位，胃癌已經(jīng)成為威脅人類健康的一個(gè)嚴(yán)重問題[1]。在我國，胃癌也是常見的惡性腫瘤之一，胃癌發(fā)病率居于各種惡性腫瘤的第二位，也是致死率最高的一類惡性腫瘤[1-2]。在我國每年均有近17萬人死于胃癌，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的23.02%,占據(jù)了將近1/4的比例[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全國各大醫(yī)院查出2萬人以上的新增胃癌患者[4]。由此可見，胃癌已經(jīng)成為嚴(yán)重危害我國人民群眾身體健康的疾病。陳靜等[5]研究表明，胃癌前疾病、 癌前病變、 胃癌與脾氣虛有著緊密的聯(lián)系，脾氣虛證貫穿胃癌發(fā)生發(fā)展的始終。長期的臨床觀察表明，益氣復(fù)生方能有效地治療脾氣虛證，在改善胃腸道反應(yīng)方面效果顯著。

代謝組學(xué)(metabonomics)是一種通過對生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量分析來探索生理改變與代謝物含量變化的相關(guān)性，屬于系統(tǒng)生物學(xué)的分支，主要研究小分子物質(zhì)(相對分子質(zhì)量<1 000)。通過檢測一系列樣品的NMR 譜圖，再結(jié)合模式識別方法，可以判斷出生物體的生理狀態(tài)，并找出與之相關(guān)的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)所反映的是人體對外界干擾因素在代謝水平上的應(yīng)答反應(yīng)，與中醫(yī)中的“證”的意義相近，為解釋中醫(yī)中的“證”提供了一種方法。施旭光等[6]開展了補(bǔ)中益氣湯治療慢性淺表性胃炎脾氣虛證的代謝組學(xué)的研究。本研究采用核磁共振技術(shù)檢測胃癌脾氣虛證小鼠血清代謝物的變化，旨在探討胃癌脾氣虛相關(guān)代謝途徑，為益氣復(fù)生方的臨床使用提供科學(xué)的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性小鼠12只,體質(zhì)量(20±2) g，由新疆醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，于普通級動(dòng)物房飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持在30%～40%，12 h/12 h明暗交替環(huán)境下培養(yǎng)，自由飲水，自由進(jìn)食。

1.2藥材、儀器與試劑益氣復(fù)生方的制備：抓取藥材炒白術(shù)15 g、黃芪20 g、肉豆蔻15 g、黨參20 g、茯苓20 g、八月札15 g等藥物，加8倍量的水,浸漬1 h，武火煮至沸騰，之后使用文火煎煮，過濾，將濾渣收集，再加6倍量的水煎煮30 min，過濾后將濾液合并，濃縮至每毫升藥液含有1 g生藥。Bruker AVANCE Ⅲ500 MHz 全數(shù)字化超導(dǎo)核磁共振儀；氘水(D2O)、疊氮鈉( NaN3)均由美國 Sigma 公司生產(chǎn)。模型構(gòu)造藥物：白醋，2-乙基亞硝胺。

1.3動(dòng)物模型建立與分組8周齡的健康雄性小鼠20只，在相對濕度30%～40%，溫度(22 ±2)℃，參照文獻(xiàn)[7]脾氣虛胃癌病證結(jié)合動(dòng)物模型法，構(gòu)建脾氣虛胃癌證模型。取20只NIH小鼠，進(jìn)行48 h饑餓處理，用白醋(酸度3.5 g/100 mL)對小鼠進(jìn)行灌胃，按照每天15 mL/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理10 d，隨后按照每天10 mL/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理10 d，再以2-乙基亞硝胺對小鼠進(jìn)行灌胃處理，按照每天2.8 mg/kg體質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)處理120 d[7-8]。小鼠普遍出現(xiàn)體質(zhì)量、攝食量和運(yùn)動(dòng)量減小、毛發(fā)枯槁、腹部膨大、大便變溏的現(xiàn)象，顯示造模成功。其中5只小鼠因反應(yīng)較重死亡，取剩余存活的15只小鼠中表型和體質(zhì)量相近的12只，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組小鼠給予40 g/kg體質(zhì)量益氣復(fù)生方灌胃，對照組給予相同質(zhì)量的蒸餾水，均連續(xù)14 d處理。

1.4變量重要性投影(VIP)的參數(shù)評價(jià)自變量的VIP>1，說明自變量對因變量的解釋有重要的作用；VIP=0.5～1，說明自變量對因變量的解釋的重要性不明確，需要增加樣本或根據(jù)別的條件進(jìn)行判斷；VIP<0.5，則說明自變量對因變量的解釋基本沒有意義。以VIP>1 的自變量建立統(tǒng)計(jì)回歸模型，VIP>1和P<0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選胃癌脾虛證的生物標(biāo)記物。

1.5觀察指標(biāo)建模成功后實(shí)驗(yàn)組小鼠給予40 g/kg體質(zhì)量益氣復(fù)生方灌胃，對照組給予相同質(zhì)量的蒸餾水，均連續(xù)14 d處理后對兩組小鼠進(jìn)行心臟取血，收集其血液 0.5～1 mL，收集的血液在4℃靜置60 min凝固，然后進(jìn)行離心(3 500 rpm/min，5 min，4℃)處理。

1.6核磁共振分析使用預(yù)飽和的1D NOESY 脈沖序列壓制水峰，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，采集次數(shù)128次。對于血清樣品用Carr -Purcell -Meibom -Gill脈沖序列來抑制血清中的脂蛋白和蛋白質(zhì)中較寬的共振信號；弛豫延遲時(shí)間為4 s；總的回波時(shí)間為100 ms；譜寬為10 kHz；通過使用線寬為0.3 Hz 的指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行傅立葉變換。脂類、氨基酸類、酮類物質(zhì)、糖類等物質(zhì)均為血清中的代謝物，通過對圖譜進(jìn)行傅立葉變換、相位調(diào)整、基線校正及去偏置等處理，結(jié)合化合物歸屬表及相關(guān)數(shù)據(jù)庫，鑒定實(shí)驗(yàn)所檢測到的代謝物峰譜的歸屬。使用MestReNova 6.1軟件對所獲譜圖進(jìn)行手動(dòng)相位、基線校正等操作，再根據(jù)乳酸的甲基共振雙重峰來定標(biāo)核磁共振譜的化學(xué)位移。

2　結(jié)果

2.1兩組小鼠治療后一般情況比較實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)過益氣復(fù)生方的治療后體質(zhì)量有所回復(fù)，攝食量增加，活動(dòng)度增加，大便部分成型，毛發(fā)由枯槁恢復(fù)正常黑棕色，有光澤。對照組小鼠與建模成功時(shí)無明顯變化。

2.2兩組小鼠血清的1H-NMR代謝物譜分析變量重要性投影(VIP)的參數(shù)評價(jià)可能的胃癌脾氣虛證小鼠血清生物標(biāo)志物包括3-羥基丁酸、低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、甲硫氨酸、谷氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、甘油三酯、不飽和脂肪酸和膽堿。實(shí)驗(yàn)組小鼠血清1H-NMR 譜中代謝產(chǎn)物中3-羥基丁酸、甲硫氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺的含量低于對照組(P<0.05)，低密度脂蛋白/極低密度脂蛋白、谷氨酸、甘油三酯、不飽和脂肪酸和膽堿的含量則高于對照組(P<0.05)，葡萄糖的含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

圖1　小鼠血清1H-NMR圖

代謝產(chǎn)物1H-NMRVIP對照組實(shí)驗(yàn)組3-羥基丁酸1.17(d)6.02926.84±216.09128.99±26.23*VLDL0.88(m)5.30152.91±24.56301.75±75.78*甲硫氨酸2.13(s)2.02128.99±26.23100.06±9.82*谷氨酸2.03(m)1.5322.68±3.4141.03±4.48*纈氨酸1.03(d)1.1847.24±6.0923.61±4.41*谷氨酰胺2.45(m)1.1143.77±3.7525.61±1.42*葡萄糖5.14(d)1.2849.46±11.3575.19±19.06甘油三酯4.37(m)1.073.55±1.7510.50±1.80*不飽和脂肪酸5.13(m)1.7236.4±4.8165.34±12.55*膽堿3.22(s)1.4373.04±11.5599.62±6.21*

注：VLDL，極低密度脂蛋白。與對照組比較，*P<0.05。s，單峰；d，雙重峰；t，三重峰；m，多重峰。

3　討論

益氣復(fù)生方由黨參、肉豆蔻、沙棘、黃芪、苦豆子、八月札等組成。白術(shù)、豆蔻有健脾燥濕、醒脾開胃的功效；黨參、黃芪具有“益胃氣”的功效，可以強(qiáng)健胃脾，大補(bǔ)元?dú)?；配合補(bǔ)益藥，從而實(shí)現(xiàn)健脾益氣、復(fù)生中氣之效[9]。長期的臨床經(jīng)驗(yàn)證明益氣復(fù)生方對于胃癌脾氣虛證具有良好的治療效果，可以有效提高胃癌患者的生存質(zhì)量[10-11]。本研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過益氣復(fù)生方治療后的小鼠與未經(jīng)治療的小鼠血清代謝水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但是益氣復(fù)生方治療胃癌脾氣虛證的代謝機(jī)理并不清楚。本研究通過建立胃癌脾氣虛證的小鼠模型，采用核磁共振技術(shù)(NMR)的代謝組學(xué)方法探索了益氣復(fù)生方治療小鼠胃癌脾氣虛證的代謝途徑及治療過程中相關(guān)生物標(biāo)志物的變化。

本研究表明胃癌脾氣虛過程中，機(jī)體能量代謝水平降低，對照組胃癌脾氣虛小鼠血清中的葡萄糖水平較低，經(jīng)過益氣復(fù)生方治療后的實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中的葡萄糖水平提高；在脂質(zhì)代謝方面，3-羥基丁酸水平在血清中的含量有所降低，而不飽和脂肪酸、甘油三酯、VLDL等代謝物含量上升，體內(nèi)脂質(zhì)代謝恢復(fù)正常。在氨的運(yùn)輸、存儲(chǔ)過程中谷氨酰胺發(fā)揮著重要的作用。谷氨酰胺水平在一定程度的降低意味著氨代謝的改變。在體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)過程中，膽堿是一種發(fā)揮重要作用的物質(zhì)，其水平的升高意味著體內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的加強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過益氣復(fù)生方的治療之后，甲硫氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺代謝物的水平降低，谷氨酸代謝物的水平升高，表明益氣復(fù)生方治療對于小鼠體內(nèi)的氨基酸代謝也有著重要的影響。胃癌脾氣虛證患者在糖類、氨基酸和脂類代謝等代謝上存在紊亂狀況。本研究表明益氣復(fù)生方對于胃癌脾氣虛證造成的代謝紊亂的調(diào)控回復(fù)主要體現(xiàn)在能量代謝水平和脂類代謝水平上。

綜上所述，益氣復(fù)生方對于小鼠胃癌脾氣虛證的治療作用，可能通過糖類脂類氨基酸類等各種小分子物質(zhì)發(fā)揮作用，然而通過調(diào)控能量代謝水平及脂質(zhì)代謝水平的途徑是最具可能性的。本研究在小鼠血清中發(fā)現(xiàn)的10種相關(guān)生物標(biāo)志物為發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)提供了新的可能。

[1]Cervantes A,Roda D,Tarazona N,et al.Current questions for the treatment of advanced gastric cancer[J].Cancer Treat Rev,2013,39(1):60-67.

[2]Kanat O,O′Neil BH.Metastatic gastric cancertreatment:a little slow but worthy progress[J].Med Oncol,2013,30(1):1-10.

[3]鄒文斌,李兆申.中國胃癌發(fā)病率及死亡率研究進(jìn)展[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2014,34(4):408-415.

[4]張靜.中藥對癌癥患者惡病質(zhì)狀態(tài)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2000,20(11):871.

[5]陳靜,趙愛光,曹妮達(dá),等.胃癌前疾病、癌前病變、胃癌與脾氣虛證的研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013,31(7):65-68.

[6]施旭光,鄒忠杰,吳美音,等.補(bǔ)中益氣湯治療慢性淺表性胃炎脾氣虛證的代謝組學(xué)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014,31(4):504-509.

[7]張宏,林代華,余成浩,等.脾氣虛胃癌病證結(jié)合動(dòng)物模型的建立[J].四川動(dòng)物，2007,26(3):13-15.

[8]彭成,羅亮.過食酸味所致脾氣虛機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究[J].山東中醫(yī)學(xué)院報(bào),1989,13(6):13-14.

[9]韓靚.益氣復(fù)生方通過ERK/MAPK通路抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué),2012.

[10]任小娟,王昕宇,陸明,等.益氣復(fù)生方對荷瘤小鼠血清D-乳酸影響的實(shí)驗(yàn)研究 [J].新疆中醫(yī)藥，2012,30(6):7-8.

[11]鄧皖利,呂書勤,任小娟,等.益氣復(fù)生方對胃癌原位移植瘤小鼠腸黏膜屏障的影響[J].世界華人消化雜志,2013,21(11):951-956.

(本文編輯周芳)

Effect of Yiqifusheng recipe on metabonomics of spleen-qi deficiency Syndrome in mice with gastric cancer

HE Nana,HU Lan,CHEN Yin

(Department of Tumor,Affiliated Traditional Hospital Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)

ObjectiveTo explore the metabonomic effects of Yiqifusheng recipe on spleen-qi deficiency syndrome of mice with gastric cancer.Methods20 healthy male mice were used to establish the model of spleen-qi deficiency syndrome and gastric cancer processed with white vinegar and 2-ethyl-N-nitrosamines for 140 days.12 mice with similar phenotype and body mass were selected from survival groups (15 mice),then randomly divided into control and experimental groups,six mice per group.The mice in experimental group were given 40 g/kg Yiqifusheng recipe,and mice in the control group were received the same quantity of distilled water for 14 days.Possible serum biomarkers were evaluated by variable importance projection (VIP) parameters,and the serum biomarkers of mice were detected by hydrogen proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) in two mice groups,and the changes of metabolites related to the serum biomarkers were observed.ResultsThe mice in the experimental group were treated with Yiqi Huansheng Recipe.The body weight,food intake and activity of the mice were increased,the stool was partially formed and the hair was returned from normal to dark brown.While,there was no significant changes in the mince of control group.The serum biomarkers of mice with spleen-qi deficiency syndrome and gastric cancer mice evaluated by VIP were 3-hydroxybutyric acid,LDL/VLDL,methionine,glutamic acid,valine,glutamine,glucose,triglycerides,unsaturated fatty acids and choline.1H-NMR spectra of mice serum metabolites showed that:the content of 3-hydroxybutyric acid ,methionine,valine,glutamine in the experimental group were lower than those in the control group (P<0.05),however,the content of LDL/VLDL,glutamic acid,triglycerides,unsaturated fatty acids and choline were higher in the experimental group than those in the control group (P<0.05).The content of glucose had no significant effect on mice serum metabolites (P>0.05) in the1H-NMR spectrum.ConclusionYiqifusheng have a significant therapeutic effect on mice spleen deficiency syndrome and gastric cancer.its regulatory mechanism may be through the regulation of energy metabolism and lipid metabolism.

Yi-Qi-Fu-Sheng Recipe; Mice; Metabonomics; Serum

新疆維吾爾自治區(qū)青年自然科學(xué)基金(2012211B36)

何娜娜(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)腫瘤內(nèi)科。

陳音，女，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向，中醫(yī)腫瘤內(nèi)科，E-mail：15199019689 chenying713@163.com。

R735.2

A

1009-5551(2016)11-1432-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.11.021

2016-04-23]