低劑量照射誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)形成的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究*

徐 巖 封江彬 陸 雪 李 爽 高 玲 田 梅 蔡恬靜 劉青杰*

低劑量照射誘導(dǎo)人淋巴細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)形成的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究*

徐 巖①封江彬①陸 雪①李 爽①高 玲①田 梅①蔡恬靜①劉青杰①*

目的：探討低劑量60Coγ射線照射誘導(dǎo)人永生化淋巴細(xì)胞AHH-1中P53結(jié)合蛋白1（53BP1）焦點(diǎn)水平與照射劑量之間的關(guān)系。方法：用60Coγ射線照射AHH-1細(xì)胞，照射劑量分別為0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100和200 mGy，吸收劑量率為20 mGy/min，37 ℃修復(fù)30 min后進(jìn)行免疫熒光染色，利用激光共聚焦掃描顯微鏡分析細(xì)胞中53BP1焦點(diǎn)形成情況。結(jié)果：在劑量為0～200 mGy的60Coγ射線照射30 min后，AHH-1細(xì)胞中53BP1焦點(diǎn)在每個(gè)細(xì)胞中的數(shù)目為0～4個(gè)，均符合泊松分布。從50 mGy照射劑量開始53BP1焦點(diǎn)水平顯著性增加，且焦點(diǎn)水平與照射劑量具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，劑量-效應(yīng)曲線為y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236，P＜0.01）。結(jié)論：在低劑量電離輻射作用下，53BP1焦點(diǎn)水平具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

低劑量照射；60Coγ射線；免疫熒光；P53結(jié)合蛋白1

［First-author’s address］ China CDC Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency， National Institute for Radiological Protection， Chinese Center for Disease Control and Prevention， Beijing 100088， China.

P53結(jié)合蛋白1（53BP1）是重要的DNA損傷修復(fù)蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到電離輻射作用時(shí)，53BP1會在DNA雙鏈斷裂處募集，表現(xiàn)為經(jīng)過免疫熒光染色后可在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到發(fā)光的焦點(diǎn)［1］。53BP1可以通過調(diào)節(jié)非同源性末端連接和同源重組修復(fù)兩種主要的雙鏈斷裂修復(fù)途徑的選擇，通過多種組蛋白修飾來結(jié)合損傷的染色質(zhì)，阻斷5′端的末端切除并且促進(jìn)染色質(zhì)的運(yùn)動和聯(lián)會等方式參與到DNA損傷修復(fù)［2］。本研究利用低劑量60Coγ射線照射永生化淋巴細(xì)胞系A(chǔ)HH-1，通過探索53BP1焦點(diǎn)發(fā)生率與受照劑量的關(guān)系，為探討53BP1作為低劑量電離輻射標(biāo)志物提供進(jìn)一步理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

激光共聚焦掃描顯微鏡型號為LSM700（德國，Zeiss公司）；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、4%多聚甲醛以及4`，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，激發(fā)波長：345 nm；發(fā)射波長：455 nm）等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。53BP1兔多克隆抗體購自美國abcam公司；Alexa fluor 594（激發(fā)波長：591 nm；發(fā)射波長：614 nm）驢抗兔IgG購自美國Jackson公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）購自中國金耀生物公司；永生化淋巴細(xì)胞系A(chǔ)HH-1購于北京曼哈頓醫(yī)學(xué)生物技術(shù)公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和照射

AHH-1細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清、105U/L青霉素和質(zhì)量濃度水平為100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃飽和濕度的含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將處于對數(shù)生長期的淋巴細(xì)胞換液，在室溫下用60Coγ射線進(jìn)行照射，吸收劑量分別為0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy，照射源由中國計(jì)量院提供，放射性活度為9.25×1010Bq，吸收劑量率為20 mGy/min，吸收劑量校準(zhǔn)溯源于中國計(jì)量院國家級實(shí)驗(yàn)室，照射野直徑為99.3 mm，源靶距為1.24 m。照射后置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)30 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 免疫熒光染色技術(shù)檢測53BP1焦點(diǎn)形成

將AHH-1細(xì)胞用1×PBS室溫下洗5 min×3遍，4%多聚甲醛溶液于室溫下固定15 min，1×PBS洗5 min×3遍。0.2%的TritonX-100室溫下破膜15 min，1×PBS洗5min×3遍。37 ℃環(huán)境下用3%BSA封閉30 min，1×PBS洗5 min×3遍。加入53BP1兔多克隆抗體（用1%BSA按照1∶100稀釋），4 ℃孵育過夜。第2 d取出，1×PBS洗5 min×3遍。加入熒光二抗37 ℃孵育1 h，1×PBS洗5 min×3遍。加入50 μl 1×PBS，將細(xì)胞打勻，滴在玻片上，室溫下自然晾干，用DAPI AF封片10 min后上機(jī)觀察53BP1焦點(diǎn)數(shù)并做記錄（Pinhole=54 μm，Digital gain=1）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組53BP1焦點(diǎn)的分布采用單樣本K-S檢驗(yàn)，P＞0.05為符合泊松分布。各組間53BP1焦點(diǎn)發(fā)生率的差異用U檢驗(yàn)，53BP1焦點(diǎn)發(fā)生率的劑量-效應(yīng)曲線用一元線性回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光技術(shù)觀測53BP1焦點(diǎn)形成

用免疫熒光技術(shù)觀察AHH-1細(xì)胞，在0 mGy、10 mGy、25 mGy、50 mGy、100 mGy和200 mGy6個(gè)劑量水平各觀察1000個(gè)細(xì)胞，分析53BP1的焦點(diǎn)發(fā)生水平（焦點(diǎn)數(shù)/細(xì)胞），可觀察到永生化淋巴細(xì)胞AHH-1受低劑量電離輻射作用30 min后，包括對照組在內(nèi)的各劑量水平照射組均可見53BP1焦點(diǎn)形成，為0～4個(gè)焦點(diǎn)/細(xì)胞（如圖1所示）。

圖1 60Co γ射線照射AHH-1細(xì)胞中53BP1焦點(diǎn)形態(tài)圖(×1000)

經(jīng)K-S檢驗(yàn)各受照劑量組漸進(jìn)顯著性均＞0.05，表明53BP1焦點(diǎn)在細(xì)胞內(nèi)分布符合泊松分布。形成的焦點(diǎn)數(shù)目除10 mGy照射組有所減少，其余組隨吸收劑量的增加而升高；各照射組與未照射組比較，在50 mGy以上各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（U=3.349，U=4.061，U=5.966；P＜0.01），見表1。

2.2 低劑量照射誘導(dǎo)的53BP1焦點(diǎn)水平的劑量-效應(yīng)曲線60Coγ射線照射AHH-1細(xì)胞后30 min，在0～200 mGy吸收劑量范圍內(nèi)53BP1焦點(diǎn)水平（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）隨劑量的增加呈上升趨勢，且具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。采用一元回歸線性分析擬合曲線如下：y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2，（R2=0.9236，P＜0.01）。其中y代表53BP1焦點(diǎn)形成水平，x代表吸收劑量，如圖2所示。

圖2 不同劑量60Co γ射線照射AHH-1細(xì)胞53BP1焦點(diǎn)形成水平劑量-效應(yīng)曲線圖

表1 不同劑量60Coγ射線照射AHH-1細(xì)胞培養(yǎng)30 min后53BP1焦點(diǎn)形成分布

3 討論

目前，核能在世界范圍內(nèi)的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域利用越來越普遍。X射線計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)在診斷中的應(yīng)用、核醫(yī)學(xué)PET/CT應(yīng)用飛速的發(fā)展以及腫瘤放射治療等均可導(dǎo)致醫(yī)療照射和職業(yè)照射等。這些情況下，除放射治療外，照射多為低劑量輻射，因而尋求高效、快捷簡便而準(zhǔn)確的低劑量電離輻射劑量估算方法具有十分重要的價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞受到電離輻射照射后，組蛋白H2AX在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3kinase，PI3K）家族成員毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、ATM和Rad3相關(guān)蛋白（ATM and Rad3 related protein，ATR）及DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PK）等的作用下，距離C端較近的絲氨酸139位在1～3 min內(nèi)發(fā)生磷酸化形成γH2AX，并在30 min內(nèi)都可以保持較高的表達(dá)水平［3］。在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)早期，組蛋白H2AX的磷酸化（γH2AX）是最早發(fā)生的分子事件之一，在數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)毫戈瑞（mGy）照射后即可觀察到γH2AX焦點(diǎn)形成［4-5］。而γH2AX則可以在DNA損傷位點(diǎn)募集53BP1參與DNA損傷修復(fù)，表現(xiàn)為經(jīng)過免疫熒光染色處理后可見發(fā)光的焦點(diǎn)，也使得53BP1具有成為低劑量輻射生物標(biāo)志物的潛力［1，6］。

53BP1也是重要的DNA雙鏈損傷標(biāo)志物之一，其基因位于染色體15q15-21，有11 kb和6.6 kb兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其可參與到DNA損傷修復(fù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以保護(hù)基因組穩(wěn)定性［7］。Lamkowski等［8］用60Coγ射線照射小豬后發(fā)現(xiàn)53BP1焦點(diǎn)形成水平有劑量-效應(yīng)關(guān)系。Horn等［9］將53BP1、γH2AX同淋巴細(xì)胞亞群中含半胱氨酸的天門冬氨酸蛋白水解酶激活情況結(jié)合共同估算電離輻射受照劑量。這些結(jié)果均表明53BP1表達(dá)水平有望成為與劑量相關(guān)的新型輻射生物標(biāo)志物。

本研究利用免疫熒光染色技術(shù)，通過觀察AHH-1細(xì)胞受到低劑量60Coγ射線照射后53PB1的焦點(diǎn)形成水平，試圖初步探討在低劑量電離輻射水平照射，即0～200 mGy之間且吸收劑量率＜20 mGy/min的條件下，53BP1焦點(diǎn)形成水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系，以期為尋找低劑量相關(guān)輻射生物標(biāo)志物提供科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果顯示，53BP1在照射后30 min焦點(diǎn)形成在50～200 mGy劑量范圍內(nèi)呈增加趨勢，且存在較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。50 mGy劑量以下并未見明顯變化，可能是因?yàn)?3BP1表達(dá)過低，也可能是因?yàn)殡S著DNA損傷的修復(fù)53BP1逐漸消失［10］。本研究將照射后細(xì)胞修復(fù)時(shí)間定為30 min，是鑒于53BP1的表達(dá)在受照后30 min處于最高水平，30 min后表達(dá)水平迅速下降［10］。

4 結(jié)語

人淋巴細(xì)胞53BP1蛋白焦點(diǎn)形成水平在低水平電離輻射作用下具有較好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，其可用作檢測低水平電離輻射所致的DNA雙鏈損傷，53BP1有望成為一種快捷高效的與低劑量相關(guān)輻射生物標(biāo)志物。

［1］Huyen Y，Zgheib O，Ditullio RA Jr，et al. Methylated Iysine 79 of histone H3targets 53BP1 to DNA double-strand breaks［J］.Nature，2004，432（7015）：406-411.

［2］Michal Zimmermann，Titia de Langeemail.53BP1：pro choice in DNA repair［J］.Trends Cell Biol，2014，24（2）：108-117.

［3］An J，Huang YC，Xu QZ，et al.DNA-PKcs plays a dominant role in the regulation of H2AX phosphorylation in response to DNA damage and cell cycle progression［J］.BMC Mol Biol，2010，11：18.

［4］Jeggo PA，L?brich M.Artemis links ATM to double strand break rejoining［J］.Cell Cycle，2005，4（3）：359-362.

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Research on dose-response of 53BP1 foci level in human lymphoblastoid cells induced by low dose irradiation

XU Yan， FENG Jiang-bin， LU Xue， et al// China Medical Equipment，2016，13（4）：106-108.

Objective： To investigate the dose- response relationship between the levels of 53BP1 foci in the lymphocyte cells AHH-1 and the absorbed doses of low dose irradiation. Methods：Lymphocyte cells AHH-1 were exposed to different absorbed dose levels of60Co γ-rays （0， 10， 25，50， 100 and 200 mGy at the absorbed dose-rate of 20 mGy/min）. Immunofluorescence analysis was carried out 30 min after irradiation and the formation of 53BP1 foci （foci/per cell） was analyzed using laser scanning confocal fluorescence microscope. Results： Within the dose range of 0-200 mGy， the levels of 53BP1 foci were conformed to the Poisson distribution. The levels of 53BP1 were enhanced when the dose level was above 50 mGy， and the dose-response curve was well fitted as y=（0.03×10-2）x+2.32×10-2（R2=0.9236， P＜0.01）. Conclusion： There is a good dose-response relationship between the levels of 53BP1 foci and the low doses， and hence it could be applicable as a biomarker of low dose radiation.

Low dose irradiation；60Co γ-rays； Immunofluorescence； 53BP1

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.04.033

1672-8270（2016）04-0106-03

R144.1

A

2015-05-10

國家自然科學(xué)基金（81573081）“人外周血淋巴細(xì)胞核質(zhì)橋作為快速輻射生物劑量計(jì)的研究”；國家自然科學(xué)基金（81172593）“GDF15和PIG3基因表達(dá)變化作為快速輻射生物劑量計(jì)的研究”

①中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國CDC重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100088

*通訊作者：qjliu@nirp.cn

徐巖，男，（1989- ），碩士研究生。中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所 輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國CDC重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，從事輻射損傷生物標(biāo)志物研究工作。