微生物多糖膠質(zhì)高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定

鄭梅霞，朱育菁，劉 波，*，潘志針，陳梅春，張連寶，2，黃素芳

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005）

微生物多糖膠質(zhì)高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定

鄭梅霞1，朱育菁1，劉 波1，*，潘志針1，陳梅春1，張連寶1，2，黃素芳1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所，福建 福州 350003；2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005）

通過觀察多糖膠質(zhì)性狀及以多糖膠質(zhì)產(chǎn)量為指標(biāo)進行初篩，從22 株可產(chǎn)多糖膠質(zhì)的菌株中篩選獲得一株多糖膠質(zhì)的高產(chǎn)菌，多糖膠質(zhì)產(chǎn)量為8.65 g/L；通過16S rDNA序列的同源性分析鑒定為地毯草黃單胞菌（Xanthomonas axonopodis）FJAT-10151。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗、革蘭氏染色法鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌株，菌落較小、圓形、淡黃色、表面光滑且濕潤、微隆、邊緣整齊、不透明、具有遷移性。通過水提醇 沉法從其發(fā)酵液中提取多糖膠質(zhì)，利用苯酚-硫酸法、咔唑法、考馬斯亮藍法測定多糖膠質(zhì)中中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)的含量，分別為36.81%、8.90%、15.27%。所產(chǎn)的粗多糖膠質(zhì)經(jīng)Sevag法除蛋白，通過完全酸水解、糖腈乙酸酯衍生化以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）研究分析表明，該多糖膠質(zhì)的單糖組分含葡萄糖和甘露糖，物質(zhì)的量比為1∶1.12。通過紅外光譜、紫外光譜、GC-MS等手段初步鑒定該多糖膠質(zhì)為黃原膠。通過黏度及質(zhì)構(gòu)剖面分析法（texture prof ile analysis，TPA）對該多糖膠質(zhì)的凝膠特性進行研究，1 g/100 mL多糖膠質(zhì)溶液在60 r/min條件下的黏度為408 mPa·s。TPA測試結(jié)果表明，與購買的結(jié)冷膠、黃原膠相比，本研究得到的黃原膠硬度小，彈性和黏著性較好，膠黏性和咀嚼性最好。研究表明該株地毯草黃單胞菌具有較大的潛在應(yīng)用價值。

地毯草黃單胞菌；黃原膠；膠黏性

鄭梅霞， 朱育菁， 劉波， 等. 微生物多糖膠質(zhì)高產(chǎn)菌株的篩選與鑒定［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（15）: 171-178. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201615029. http://www.spkx.net.cn

ZHENG Meixia， ZHU Yujing， LIU Bo， et al. Screening and identification of bacteria for enhanced production of polysaccharide gum［J］. Food Science， 2016， 37（15）: 171-178. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201615029. http://www.spkx.net.cn

多糖是以單糖為基本組成單位，按一定方式重復(fù)排列而成的聚合物。用于食品加工的多糖俗稱為膠質(zhì)，即多糖膠質(zhì)。多糖膠質(zhì)可來源于微生物、動物、植物［1］。微生物胞外多糖是指微生物在生長代謝活動中分泌到細胞壁外的多糖或多糖混合物。與其他多糖膠質(zhì)相比，微生物多糖膠質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，這也使其擁有更加特殊的性質(zhì)，具有黏著性、穩(wěn)定性、乳化性和凝膠性等特點，在食品、化工、醫(yī)療等多個領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域可作為食品添加劑、凝結(jié)劑、保鮮劑等［2］；在醫(yī)藥領(lǐng)域［3］，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的引入，多糖在抗凝血、延緩衰老、抗癌防癌、疾病免疫等方面的功能也逐漸被揭示出來［4-5］，Shiomi等［6］發(fā)現(xiàn)乳酸菌胞外多糖具有抗腫瘤活性，Maity等［7］發(fā)現(xiàn)黃原膠在藥物釋放方面的應(yīng)用；在環(huán)境污水處理中多糖也起到了重要作用，可螯合污水中的重金屬離子［8］，作為重金屬離子吸附劑［9］；另外多糖作為生物活性物質(zhì)［10］也被開發(fā)應(yīng)用。微生物多糖膠質(zhì)主要包括黃原膠（xanthan gum）、結(jié)冷膠（gellan gum）、威蘭膠（Welan gum）、熱凝多糖（curdlan）等?？僧a(chǎn)多糖膠質(zhì)的微生物菌屬有Sphingomonas、Agrobacterium、Xanthomonas等。Hou等［11］從農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）篩選到一株菌株可產(chǎn)胞外多糖，該胞外多糖是由葡萄糖、半乳糖和甘露糖構(gòu)成；Yu等［12］研究發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌屬在限氮的情況下可產(chǎn)由直鏈無分枝β-（1，3）-D-葡聚糖構(gòu)成的熱凝多糖；Zhang Jun［13］、Harding［14］等研究發(fā)現(xiàn)少動鞘脂單胞菌產(chǎn)結(jié)冷膠，該結(jié)冷膠是由鼠李糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成；Kaur等［15］研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)堿桿菌屬可產(chǎn)胞外多糖威蘭膠，該威蘭膠是由L-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖和D-葡萄糖醛酸構(gòu)成；Pollock［16］、Wibberg［17］等研究發(fā)現(xiàn)野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）可產(chǎn)黃原膠，該黃原膠是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙?；捅針?gòu)成。黃原膠成為重要的穩(wěn)定劑、懸浮劑、乳化劑、增稠劑、黏合劑及具高附加值、高質(zhì)量的加工原料［18］，黃原膠的生產(chǎn)菌是野油菜黃單胞菌（亦名甘藍黑腐病黃單胞桿菌）［19］，另外研究發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜黃單胞桿菌、美人蕉枯葉黃單胞桿菌、菜豆黃單胞桿菌、地毯草黃單胞菌等也能產(chǎn)黃原膠［20-21］。國內(nèi)黃原膠的生產(chǎn)雖有每年數(shù)千噸的產(chǎn)量，但產(chǎn)品質(zhì)量離國際市場要求尚有較大的距離，主要存在的問題是菌種、工藝設(shè)備的自動控制、黃原膠的深加工和二次開發(fā)等方面［22］。為了獲得高品質(zhì)高效的黃原膠生產(chǎn)菌，需要篩選分離新的生產(chǎn)菌，本研究根據(jù)已報道可產(chǎn)多糖膠質(zhì)的細菌屬種，從菌種庫中選擇3 個屬22 株菌，通過水提醇沉法和苯酚-硫酸法篩選獲得一株多糖膠質(zhì)高產(chǎn)菌。通過16S rDNA對該菌株進行鑒定；糖腈乙酸酯衍生化法對該多糖膠質(zhì)的單糖組分進行初步鑒定；黏度計和質(zhì)構(gòu)剖面分析法（texture profile analysis，TPA）對多糖膠質(zhì)的黏度性質(zhì)及力學(xué)性能進行研究，篩選具有工業(yè)應(yīng)用潛力的產(chǎn)高黏度微生物胞外多糖的菌株，為一種新型多糖生產(chǎn)菌的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考，以期為該多糖膠質(zhì)在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及其來源

在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資 源研究所菌種庫中選擇已報道可產(chǎn)多糖膠質(zhì)菌屬的22 株菌，具體如表1所示。

表1　實驗用菌株Table 1 The experimental strains tested in this study

1.1.2培養(yǎng)基與試劑

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母膏1 g/L，pH 7.2；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂17 g/L，pH 7.0～7.2；種子培養(yǎng)基：蔗糖 20 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母膏 5 g/L，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母膏2 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO40.1 g/L，pH 7.0。

結(jié)冷膠 上海金穗生物技術(shù)有限公司；黃原膠上海晶純生物技術(shù)有限公司；正丁醇、氯仿、苯酚、硫酸、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、氯化鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、磷酸、鹽酸羥胺、三氟乙酸、吡啶、乙酸酐、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、DEAE纖維素DE-52 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

GC6890/MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；UV2550紫外分光光度計 日本島津公司；470FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司；NDJ-8S黏度計上海方瑞儀器有限公司；TA.XTplus Texture Exponent 32質(zhì)地分析儀 英國SMS公司。

1.3方法

1.3.1出發(fā)菌株的分離篩選

將菌種經(jīng)NA培養(yǎng)基活化后，挑取單菌落接入種子液培養(yǎng)基中，30 ℃、培養(yǎng)16 h后接入發(fā)酵培養(yǎng)基。以液體發(fā)酵法測多糖膠質(zhì)產(chǎn)量為指標(biāo)，選取相對高產(chǎn)菌種。

不同種類的細菌產(chǎn)生菌體生物量和多糖膠質(zhì)的產(chǎn)量：菌株發(fā)酵液離心分離，收集沉淀物烘干，稱干質(zhì)量，以單位體積的菌體干質(zhì)量為菌體生物量；上清液用3 倍體積的冰乙醇沉降多糖膠質(zhì)，4 ℃靜置過夜，離心分離，無水乙醇洗滌3 遍，氮氣吹干，稱質(zhì)量，粉碎得多糖膠質(zhì)產(chǎn)量。

1.3.2菌株FJAT-10151種類確認(rèn)鑒定

1.3.2.1DNA提取及序列測定

DNA的提取及系列測定參照文獻［23］進行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增產(chǎn)物由上海博尚生物技術(shù)有限公司進行測序。測序結(jié)果經(jīng)美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）比對。

1.3.2.2高產(chǎn)菌株FJAT-10151生理生化及革蘭氏染色實 驗

對篩選獲得的高產(chǎn)菌株FJAT-10151進行生理生化實驗。另外，對菌株FJAT-10151進行革蘭氏染色顯微觀察：以大腸桿菌為陰性對照和枯草芽孢桿菌為陽性對照。

1.3.3FJAT-10151的發(fā)酵液中粗多糖產(chǎn)物的提取

挑取FJAT-10151單菌落至種子液中，30 ℃、170 r/min培養(yǎng)16 h后，按2%的接種量接入發(fā)酵液中，30 ℃、190 r/min培養(yǎng)72 h，獲得發(fā)酵液。離心分離，收集上清液，用3 倍體積的冰乙醇沉降多糖膠質(zhì)，4 ℃靜置過夜，離心分離，無水乙醇洗滌3 遍，氮氣吹干，稱質(zhì)量，粉碎得粗多糖產(chǎn)物FJAT-10151-DTJZ（即由地毯草黃單胞菌FJAT-10151的發(fā)酵液中提取的黃 原膠），備用。

1.3.4FJAT-10151-DTJZ中中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)含量的測定

采用苯酚-硫酸法［24］測定FJAT-10151-DTJZ中中性多糖的含量：0.4 mL FJAT-10151-DTJZ溶液，超純水補足至1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和3 mL濃硫酸，振蕩混勻后沸水浴20 min，冷卻至室溫，在490 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖為對照。

采用咔唑法測定FJAT-10151-DTJZ中酸性多糖的含量：1 mL FJAT-10151-DTJZ溶液，超純水補足至4 mL，加入10 mL濃硫酸硼砂溶液，冰浴冷卻至4 ℃，沸水浴10 min后冰浴冷卻至4 ℃。再加入0.2 mL咔唑試劑，搖勻，沸水浴15 min后冰浴冷卻至4 ℃，在530 nm波長處測定吸光度，以葡萄糖醛酸為對照。

采用考馬斯亮藍法測定FJAT-10151-DTJZ中蛋白質(zhì)的含量：1 mL FJAT-10151-DTJZ溶液，加入5 mL的考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，放置5 min后，在580 nm波長處比色測定吸光度，以牛血清白蛋白為對照。

1.3.5FJAT-10151-DTJZ脫蛋白工藝

FJAT-10151-DTJZ采用Sevag法［25］脫蛋白，Sevag試劑為氯仿-正丁醇（4∶1，V/V），脫蛋白3 次后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿和正丁醇，加入3 倍體積的95%乙醇沉淀后得FJAT-10151-DTJZ樣品。

1.3.6FJAT-10151-DTJZ的分離純化

采用DEAE-52柱層析進行分級（Φ2.6 cm× 50 cm），分別用蒸餾水、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl梯度洗脫，流速1 m L/min，自動收集器每6 min收集1 管，用苯酚-硫酸法檢測，得到洗脫曲線，收集各洗脫峰，濃縮、透析、干燥后得多糖各組分。

1.3.7紫外-可見光譜分析

配制1.0 mg/mL DEAE-52水洗脫多糖溶液，于紫外光譜儀上掃描，掃描波長范圍200～400 nm。

1.3.8紅外光譜分析

DEAE-52水洗脫多糖膠質(zhì)樣品經(jīng)KBr壓片，于傅里葉紅外光譜儀上掃描分析，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1。1.3.9 FJAT-10151-DTJZ的氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析

由于糖類本身沒有足夠的揮發(fā)性，因此進行GC-MS分析之前必須先將其轉(zhuǎn)化成易揮發(fā)、對熱穩(wěn)定的衍生物。通常采用的衍生化方法有：三甲基硅醚衍生物、糖肟三甲基硅醚衍生物、糖腈乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯衍生物和三氟乙酸酯衍生物等［26-27］。

多糖的水解：20 mg DEAE-52水洗脫多糖膠質(zhì)溶于2 mL 2 mol/L三氟乙酸，封管，100 ℃水解6 h，減壓蒸餾除去三氟乙酸。

本實驗通過糖腈乙酸酯衍生化法［28］后進行GC-MS分析。在水解產(chǎn)物中加入20 mg鹽酸羥胺和1 mL吡啶，封管于90 ℃反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，再加入1 mL乙酸酐，封管于90 ℃反應(yīng)30 min，冷卻后取出 上清液，減壓濃縮至干，滴入0.5 mL氯仿溶解后進行GC-MS分析。同樣方法制備標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物。

色譜條件：氣相色譜柱HP-5MS柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm），氣化室溫度270 ℃，柱前壓17.8 kPa，分流比10∶1，隔墊吹掃流量3 mL/min，進樣量1 μL，升溫程序：起始溫度150 ℃保持6 min，以2 ℃/min升至220 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI；采集模式為全掃描；EMV模式為相對值；質(zhì)量掃描范圍：25～550 amu；MS離子源溫度為230 ℃，MS四極桿溫度150 ℃。

1.3.10FJAT-10151-DTJZ特性的研究

測定1 g/100 mL FJAT-10151-DTJZ在60 r/min條件下的黏度。FJAT-10151-DTJZ的力學(xué)性能通過TPA測試，得到硬度、凝聚性、彈性、回復(fù)性、黏附性、咀嚼性和脆性等相關(guān)質(zhì)構(gòu)參數(shù)［29］。以購買的結(jié)冷膠、黃原膠為對照。

樣品制備：在室溫下將FJAT-10151-DTJZ、結(jié)冷膠、黃原膠溶液分裝在模具中，迅速置于冰鹽水中冷卻凝膠，在4 ℃冰箱中放置24 h后進行TPA測試。

測試參數(shù)：預(yù)壓速率為1.0 mm/s，下壓速率為1.0 mm/s，回復(fù)速率為1.0 mm/s，下壓距離為4 mm，兩次壓縮之間的停留時間為5 s，觸發(fā)力為5 g。每組測試均做5 次平行測定，實驗結(jié)果為平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1高產(chǎn)多糖膠質(zhì)菌株

圖1　FJAT-10151菌株的菌落形態(tài)（a）和乙醇提取多糖膠質(zhì)的形態(tài)（bb）Fig. 1 Colony morphology （a） and form of exopolysaccharides （b） from strain FJAT-10151 precipitated by ethanol

先觀察22 株菌的菌落大小、顏色、光澤度、菌落邊緣特征是否明顯、菌落是否透明、是否具有遷移性等形態(tài)學(xué)特征，觀察菌株發(fā)酵液醇沉降的產(chǎn)物性狀及計算產(chǎn)膠率，初步篩選獲得一株多糖膠質(zhì)的高產(chǎn)菌FJAT-10151。該菌菌落較小、圓形、淡黃色、表面光滑且濕潤、微隆、邊緣整齊、不透明、具有遷移性（圖1a）；所產(chǎn)粗多糖膠質(zhì)FJAT-10151-DTJZ性狀疏松透明呈果凍狀（圖1b）。

表2　菌體生物量及多糖膠質(zhì)產(chǎn)量Table 2 Bacterial biomass and polysaccharide production

圖2　多糖膠質(zhì)產(chǎn)量/菌體生物量的聚類分析Fig. 2 Cluster diagram for the ratio of dry exopolysaccharide gum weight to dry cell weight

以表2菌株編號為樣本，以多糖膠質(zhì)產(chǎn)量、菌體生物量為指標(biāo)，構(gòu)建矩陣，用Within-Groups Linkage為聚類方法，Cosine為區(qū)間進行系統(tǒng)聚類。如圖2所示：第1類，多糖膠質(zhì)產(chǎn)量高于菌體生物量，共2 株即菌株FJAT-10151、FJAT-10174；第2類，多糖膠質(zhì)產(chǎn)量/菌體生物量＞0.45，共7 株即菌株FJAT-10625、FJAT-10754、FJAT-5444、FJAT-5627、FJAT-10617、FJAT-10714、FJAT-10628；第3類，多糖膠質(zhì)產(chǎn)量/菌體干質(zhì)量＜0.45，剩余的13 株。細菌產(chǎn)生的菌體生物量和多糖膠質(zhì)產(chǎn)量差異最大的是Sphingomonas paucimobilis FJAT-4703，菌體生物量（6.820 g/L）是多糖膠質(zhì)產(chǎn)量（1.008 g/L）的6.76 倍；多糖膠質(zhì)產(chǎn)量最高的是Xanthomonas axonopodis FJAT-10151，為8.648 g/L。

2.2FJAT-10151的菌株種類鑒定

篩選得到的高產(chǎn)多糖膠質(zhì)菌株FJAT-10151的核苷酸序列有1 412 bp，16S rDNA序列經(jīng)NCBI比對，高產(chǎn)多糖菌株FJAT-10151與Xanthomonas axonopodis親緣關(guān)系最近，16S rDNA同源性為 100%，其次與Xanthomonas phaseoli同源性為99.79%，所以菌株FJAT-10151應(yīng)屬于是地毯草黃單胞菌屬Xanthomonas axonopodis。與之前資源保存庫所登記的記錄相符。將同源性較高菌株的16S rDNA序列下載進行對比分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用MEGA軟件中Neighbour-Joining方法，當(dāng)Bootstrap值為1 000 次時，形成的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，F(xiàn)JAT-10151與Xanthomonas axonopodis聚在同一個分支。

圖3　16S rDNA序列構(gòu)建的菌株FJAT-10151的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Neighbour-Joining evolutionary tree of strain FJAT-10151

高產(chǎn)菌株FJAT-10151測定為革蘭氏陰性菌株；其生理生化實驗結(jié)果為：七葉苷、鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（o-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG）、半固體瓊脂、葡萄糖半固體、葡萄糖銨和鳥氨酸脫羧酶為陽性；MR-VP、丙二酸鹽、尿素酶、甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、乳糖、木糖、水楊苷、鼠李糖、棉子糖、木糖明膠、西蒙氏枸櫞酸鹽、賴氨酸脫羧酶和色氨酸肉湯為陰性。

2.3FJAT-10151-DTJZ黃原膠中中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)含量測定

通過苯酚-硫酸法對22 株菌所產(chǎn)多糖膠質(zhì)中性糖的含量進行測定，其中FJAT-10617、FJAT-10625、FJAT-10151、FJAT-10272、FJAT-504共5 株所產(chǎn)粗多糖膠質(zhì)中中性糖的含量超過0.5 g/L，F(xiàn)JAT-10151可達3.2 g/L，說明FJAT-10151菌株產(chǎn)胞外多糖能力較強，后期就以FJAT-10151為主要實驗菌株。該菌株所產(chǎn)多糖膠質(zhì)FJAT-10151-DTJZ的中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)含量如表3所示。Sevag法除蛋白后蛋白的含量為7.5%。

表3　FJAT-10151-DTJZ中性糖、酸性糖、蛋白質(zhì)的含量Table 3 Neutral sugar， acid sugar and protein contents of FJAT-10151-DTJZ-DTJZ

2.4FJAT-10151-DTJZ的DEAE-52纖維素柱層析

用超純水、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液梯度洗脫，每隔6 min收集1 管，篩選某些管號進行硫酸-苯酚法測定，得到3 個洗脫峰（圖4），分別收集得到3 個組分，其中超純水和0.1 mol/L NaCl洗脫得到的多糖組分得率高。

圖4　FJAT-10151-DTJZ在DEAE-52纖維素層析柱上的洗脫曲線Fig. 4 Chromatographic isolation of FJAT-10151-DTJZ on DEAE-cellulose column

2.5FJAT-10151-DTJZ黃原膠紫外光譜和紅外光譜分析

配制0.1 mg/mL的FJAT-10151-DTJZ溶液，在紫外波長190～400 nm范圍進行掃描，結(jié)果如圖5所示。在200～400 nm之間未見明顯的蛋白和核酸的吸收峰。

圖5　FJAT-10151-DTJZ的紫外光譜Fig. 5 UV spectrum of FJAT-10151-DTJZ

由圖6可知，在3 600～3 200、3 200～2 800、2 000～1 400、1 200～1 000 cm-1這4 個譜段內(nèi)都出現(xiàn)了典型糖類物質(zhì)的吸收峰。3 430 cm-1處的吸收峰強且寬，為分子間締合羥基的伸縮振動；2 922 cm-1為C—H的伸縮振動吸收峰；1 624 cm-1處出現(xiàn)典型酰胺譜圖；1 384 cm-1處吸收峰為酰胺中的C—N伸縮振動吸收峰，表明糖中殘留蛋白質(zhì)；1 163 cm-1處的吸收峰是環(huán)上C—O吸收峰；1 413 cm-1處吸收峰為=CH2的變形吸收峰；1 060 cm-1和1 020 cm-1處的吸收峰是醇羥基的變角振動吸收峰；895 cm-1是β-D-甘露吡喃糖環(huán)β-端基差向異構(gòu)的C—H變角振動的特征吸收峰；795 cm-1是D-葡萄糖吡喃糖環(huán)C—O—C振動吸收峰，895 cm-1處的吸收峰，而在844 cm-1處沒有特征吸收峰，說明該多糖組分里存在β型糖苷鍵；819 cm-1的弱吸收峰是甘露糖的特征吸收峰。通過對特征峰指認(rèn)，確認(rèn)分離純化出來的FJAT-10151-DTJZ的組成為β-糖苷鍵型吡喃糖。

圖6　FJAT-10151-DTJZ在DEAE-52水洗脫的紅外光譜Fig. 6 IR spectrum of FJAT-10151-DTJZ with water elution on DEAE-cellulose column

2.6FJAT-10151-DTJZ黃原膠單糖組分分析

FJAT-10151-DTJZ的水解產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)單糖經(jīng)糖腈乙酸酯衍生化后，利用GC-MS進行檢測分析，結(jié)果如圖7所示。各標(biāo)準(zhǔn)單糖出峰順序和保留時間：甘露糖（27.472 min）和葡萄糖（27.987 min）。將多糖膠質(zhì)水解產(chǎn)物衍生化圖譜與標(biāo)準(zhǔn)單糖、黃原膠衍生化圖譜對照，結(jié)合出峰時間及質(zhì)譜結(jié)果初步將FJAT-10151-DTJZ鑒定為黃原膠，是由甘露糖和葡萄組成的雜多糖，其物質(zhì)的量比為1∶1.12。

圖7　標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物（a）、黃原膠（b）和FJAT-10151-DTJZ（cc）的糖腈乙酸酯GC-MS總離子流圖Fig. 7 GC-MS total ion current chromatograms of standard monosaccharides （a） and aldononitrile acetates （b） of xanthan and FJAT-10151-DTJZ （c）

2.7FJAT-10151-DTJZ黃原膠特性分析

FJAT-10151-DTJZ易溶于水，呈膠狀、黏稠狀。FJAT-10151-DTJZ、結(jié)冷膠和黃原膠的黏度分別為408、 266、436 mPa·s，即FJAT-10151-DTJZ的 黏度與黃原膠相當(dāng)，是結(jié)冷膠的1.5 倍，表明FJAT-10151-DTJZ的膠性良好。

根據(jù)TPA測試得到的壓縮-拉伸曲線求出相關(guān)的質(zhì)構(gòu)參數(shù)如表4所示。黏著性反映的是由于測試樣品的黏著作用所消耗的功；膠黏性反映破碎膠態(tài)到可以咀嚼狀態(tài)時所需的能量；咀嚼性是反映從可咀嚼狀態(tài)到可吞咽狀態(tài)所需要的能量；由表4可知，提取的粗膠多糖與購買回來的黃原膠、結(jié)冷膠相比：硬度小，彈性和黏著性較好，膠黏性和咀嚼性最好。

表4　多糖的黏度及相關(guān)質(zhì)構(gòu)參數(shù)Table 4 Viscosity and texture parameters of polysaccharides

3　結(jié) 論

本研究篩選獲得一株高產(chǎn)多糖膠質(zhì)的菌株Xanthomonas axonopodis FJAT-10151，F(xiàn)JAT-10151-DTJZ的多糖膠質(zhì)產(chǎn)量可達8.65 g/L，優(yōu)于白先放等［30］報道的2.35 g/L、de Jesus Assis等［31］報道的5.59 g/L 。

本研究通過水提醇沉法從菌株的發(fā)酵液中提取多糖膠質(zhì)，再通過苯酚-硫酸法測定多糖膠質(zhì)含量，篩選獲得一株高產(chǎn)多糖膠質(zhì)的菌株FJAT-10151，分離自福建省順昌紅心柚葉片，與工業(yè)生產(chǎn)菌野油菜黃單胞菌同為植物源微生物細菌［32-33］。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗和16S rDNA序列的同源性分析，該菌鑒定為地毯草黃單胞菌Xanthomonas axonopodis FJAT-10151。該菌株鑒定為革蘭氏陰性菌株，與Zimaro等［34］報道一致；菌落較小、圓形、淡黃色、表面光滑且濕潤、微隆、邊緣整齊、不透明、具有遷移性，與Zaid 等［35］報道一致。

利用SPSS 16.0軟件對22 株株菌發(fā)酵過程中菌體和多糖膠質(zhì)的相關(guān)性進行研究，細菌產(chǎn)生的菌體生物量和多糖膠質(zhì)產(chǎn)量差異最大的是Sphingomonas paucimobilis FJAT-4703，菌體生物量是多糖膠質(zhì)產(chǎn)量的6.76 倍；多糖膠質(zhì)產(chǎn)量最高的是X anthomonas axonopodis FJAT-10151，為8.648 g/L。多糖膠質(zhì)的生產(chǎn)與細胞的生長有關(guān)，主要是在穩(wěn)定期［36-37］。

FJAT-10151-DTJZ性狀疏松透明呈果 凍狀，純度為45.71%（中性糖36.81%，酸性糖8.9%），經(jīng)Sevag法去蛋白和糖腈衍生化后，GC-MS的分析結(jié)果表明FJAT-10151-DTJZ的單糖主要組分為甘露糖和葡萄糖，物質(zhì)的量比為1∶1.12。通過紅外光譜、紫外光譜、GC-MS等手段初步鑒定該多糖膠質(zhì)FJAT-10151-DTJZ為黃原膠。黃原膠可具有增稠性、乳化性、穩(wěn)定性等優(yōu)點，在食品、化工、醫(yī)藥、石油等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用［38-40］。在同等條件下，F(xiàn)JAT-10151-DTJZ的黏度為408 mPa·s，與黃原膠相當(dāng)，是結(jié)冷膠的1.5 倍。TPA測試結(jié)果表明，與購買的結(jié)冷膠、黃原膠相比，本研究得到的黃原膠硬度小，彈性和黏著性較好，膠黏性和咀嚼性最好，說明FJAT-10151-DTJZ的膠性質(zhì)優(yōu)良。

［1］ CHEN J， ZHANG W， LI X. Preparation and characterization of a novel superabsorbent of konac glucomannan- poly （acrylic acid） with trimethylolpropane trimethacrylate cross-linker［J］. RSC Advances，2015， 5（48）: 38417-38423. DOI:10.1039/C5RA04522C.

［2］ TOMSHICH S V， KOMANDROVA N A， WILDMALM G， et al. Structure of acidic O-specific polysaccharide from the marine bacterium Cellulophaga baltica［J］. Bioorg Khim， 2007， 33（1）: 83-87. DOI:10.1134/S1068162007010104.

［3］ FEDOROV S N， ERMAKOVA S P， ZVYAGINTSEVA T N. Anticancer and cancer preventive properties of marine polysaccharides: some results and prospects［J］. Marine Drugs， 2013， 11（12）: 4876-4901. DOI:10.3390/md11124876.

［4］ KOBATA A. Glycobiology in the field of aging research introduction to glycogerontology［J］. Biochimie， 2003， 85（1/2）: 13-24. DOI:10.1016/S0300-9084（03）00003-8.

［5］ NAGAI Y. Glycobiology in the 21stCentury: coming developments in glycobiology［J］. Glycoconjugate Journal， 2002， 19（3）: 161-163. DOI:10.1023/A:1024275322537.

［6］ SHIOMI M， SASAKI K， MUROFUSHI M， et al. Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from Kefir grain［J］. Japanese Journal of Medical Science Biology， 1982， 35（2）: 75-80. DOI:10.7883/yoken1952.35.75.

［7］ MAITY S， SA B. Ca-carboxymethyl xanthan gum mini-matrices: swelling， erosion and their impact on drug release mechanism［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2014， 68: 78-85. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2014.04.036.

［8］ PHILIPPIS R D， COLICA G， MICHELETTI E. Exopolysaccharideproducing cyanobacteria in heavy metal removal from water: molecular basis and practical applicability of the biosorption process［J］. Applied Microbiology Biotechnology， 2011， 92（4）: 697-708. DOI:10.1007/s00253-011-3601-z.

［9］ SLAVEYKOVA V I， PARTHASARATHY N， DEDIEU K， et al. Role of ectracellular compounds in Cd-sequestration relative to Cd uptake by bacterium Sinorhizobium meliloti［J］. Environmental Pollution，2010， 158（8）: 2561-2565. DOI:10.1016/j.envpol.2010.05.016.

［10］ CHANG Z Q， LEE J S， GEBRU E， et al. Mechanism of macrophage activation induced by beta-glucan produced from Paenibacillus polymyxa JB115［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications， 2010， 391（3）: 1358-1362. DOI:10.1016/ j.bbrc.2009.12.064.

［11］ HOU C T， AHLGREN J A， BROWN W， et al. Production of an extracellular polysaccharide by Agrobacterium sp. DS3 NRRL B-14297 isolated from soil［J］. Journal of Industrial Microbiology，1996， 16（2）: 129-133. DOI:10.1007/BF01570073.

［12］ YU X Q， ZHANG C， YANG L P， et al. CrdR function in a curdlan-producing Agrobacterium sp. ATCC31749 strain［J］. BMC Microbiology， 2015， 15（1）: 25-35. DOI:10.1186/s12866-015-0356-1.

［13］ ZHANG J， DONG Y C， FAN L L， et al. Optimization of culture medium compositions for gellan gum production by a halobacterium Sphingomonas paucimobilis［J］. Carbohydrate Polymers， 2015， 115: 694-700. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.09.029.

［14］ HARDING N E， PATEL Y N， COLEMAN R J. Organization of genes required for gellan polysaccharide biosynthesis in Sphingomonas elodea ATCC 31461［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 2004， 31（2）: 70-82. DOI:10.1007/s10295-004-0118-9.［15］ KAUR V， BERA M B， PANESAR P S， et al. Welan gum: microbial production， characterization， and applications［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2014， 65: 454-461. DOI:10.1016/ j.ijbiomac.2014.01.061.

［16］ POLLOCK T J， MIKOLAJCZAK M， YAMAZAKI M， et al. Production of xanthan gum by Sphingomonas bacteria carrying genes from Xanthomonas campestris［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 1997， 19（2）: 92-97. DOI:10.1038/sj.jim.2900449.［17］ WIBBERG D， ALKHATEEB R S， WINKLER A， et al. Draft genome of the xanthan producer Xanthomonas campestris NRRL B-1459（ATCC 13951）［J］. Journal of Biotechnology， 2015， 204: 45-46. DOI:10.1016/j.jbiotec.2015.03.026.

［18］ 聶凌鴻， 周如金. 黃原膠的開發(fā)應(yīng)用現(xiàn)狀［J］. 糧油食品科技， 2004，12（6）: 14-16. DOI:10.3969/j.issn.1007-7561.2004.06.006.

［19］ TAO F， WANG X， MA C Q， et al. Genome sequence of Xanthomonas campestris JX， an industrially productive strain for xanthan gum［J］. Journal of Bacteriology， 2012， 194（17）: 4755-4756. DOI:10.1128/ JB.00965-12.

［20］ ROJAS R， NISHIDOMI S， NEPOMUCENO R， et al. Glutamate transport and xanthan gum production in the plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri［J］. World Journal of Microbiology Biotechnology， 2013， 29（11）: 2173-2180. DOI:10.1007/s11274-013-1383-4.

［21］ 吳國荃， 王金臺， 羅書凱. 黃原膠的國內(nèi)生產(chǎn)現(xiàn)狀及趨勢［J］. 化工技術(shù)經(jīng)濟， 2004， 22（10）: 15-18. DOI:10.3969/ j.issn.1673-9647.2004.10.004.

［22］ 劉清泉. 黃原膠產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］. 中國食品添加劑，2002（6）: 5-7. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2002.06.002.

［23］ 鄭梅霞， 劉波， 葛慈斌， 等. 陜北土壤芽孢桿菌種類分布多樣性研究［J］. 福建省農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2014， 29（4）: 364-372. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0384.2014.04.013.

［24］ DUBOIS M， GILLES K A， HAMILTON J K， et al. Colorimetric method for determin ation of sugars and related substances［J］. Analytical Chemistry， 1956， 28（3）: 350-356. DOI:10.1021/ ac60111a017.

［25］ 謝麗源， 張勇， 彭衛(wèi)紅， 等. 鮑氏針層孔菌菌絲體多糖脫蛋白方法研究［J］. 中藥材， 2011， 34（2）: 293-295. DOI:10.13863/ j.issn1001-4454.2011.02.018.

［26］ RUIZ-MATUTE A I， HERNANDEZ-HERNANDEZ O，RODRIGUEZ-SANCHEZ S， et al. Derivatization of carbohydrates for GC and GC-MS analyses［J］. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences， 2011， 879（17）: 1226-1240. DOI:10.1016/j.jchromb.2010.11.013.

［27］ PRICE N P. Acylic sugar derivatives for GC/MS analysis of13C-enrichment during carbohydrate metabolism［J］. Analytical Chemistry， 2004， 76（22）: 6566-6574. DOI:10.1021/ac049198m.

［28］ 李莉， 石俊英. 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析肉桂多糖及脂類成分［J］. 中藥材， 2013， 36（4）: 578-580. DOI:10.13863/ j.issn1001-4454.2013.04.048.

［29］ 劉興余， 金邦荃， 氣詹巍， 等. 豬肉質(zhì)構(gòu)的儀器測定與感官評定之間的相關(guān)性分析［J］. 食品科學(xué)， 2007， 28（4）:245-248. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.04.056.

［30］ 白先放， 李柱， 劉海東. 亞硝酸誘變選育黃原膠高產(chǎn)菌株初探［J］. 企業(yè)科技與發(fā)展， 2011（1）: 32-34.

［31］ de JESUS ASSIS D， BRANDAO L V， de SOUSA COSTA L A， et al. A study of the effects of aeration and agitation on the properties and production of xanthan gum from crude glycerin derived from biodiesel using the response surface methodology［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2014， 172（5）: 2769-2785. DOI:10.1007/s12010-014-0723-7.

［32］ BRUNINGS A M， GABRIEL D W. Xanthomonas citri: breaking the surface［J］. Molecular Plant Pathology， 2003， 4（3）: 141-157. DOI:10.1046/j.1364-3703.2003.00163.x.

［33］ GRAHAM J H， GOTTWALD T R， CUBERO J， et al. Xanthomonas axonopodis pv. citri: factors affecting successful eradication of citrus canker［J］. Molecular Plant Pathology， 2004， 5（1）: 1-15. DOI:10.1046/ j.1364-3703.2004.00197.x.

［34］ ZIMARO T， THOMAS L， MARONDEDZE C， et al. Insights into Xanthomonas axonopodis pv. citri biofilm through proteomics［J］. BMC Microbiology， 2013， 13: 186. DOI:10. 1186/ 1471-2180-13-186.

［35］ ZAID A M， BONASERA J M， BEER S V. OEM: a new medium for rapid isolation of onion-pathogenic and onion-associated bacteria［J］. Journal of Microbiological Methods， 2012， 91（3）: 520-526. DOI:10.1016/j.mimet.2012.09.031.

［36］ BORN K， LANGENDORFF V， BOULENGUER P. Xanthan［M］. Weinheim， Germany: WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA，2005: 535-573.

［37］ ZHANG Z G， CHEN H Z. Fermentation performance and structure characteristics of xanthan produced by Xanthomonas campestris with a glucose/xylose mixture［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology，2010， 160（6）: 1653-1663. DOI:10.1007/s12010-009-8668-y.

［38］ YANG F， YANG L， GUO X， et al. Production and purification of a no vel xanthan lyase from a xanthan-degrading Microbacterium sp. strain XT11［J］. Scientific World Journal， 2014， 2014: 368-434. DOI:10.1155/2014/368434.

［39］ CADMUS M C， JACKSON L K， BURTON K A， et al. Biodegradation of xanthan gum by Bacillus sp.［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1982， 44（1）: 5-11.

［40］ KHALIL M， MOHAMED JAN B. Herschel-Bulkley rheological parameters of a novel environmentally friendly lightweight biopolymer drilling fluid from xanthan gum and starch［J］. Journal of Applied Polymer Science， 2012， 124（1）: 595-606. DOI:10.1002/app.35004.

Screening and Identification of Bacteria for Enhanced Production of Polysaccharide Gum

ZHENG Meixia1， ZHU Yujing1， LIU Bo1，*， PAN Zhizhen1， CHEN Meichun1， ZHANG Lianbao1，2， HUANG Sufang1
（1. Agricultural Bio-resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou 350003， China；2. School of Life Sciences， Xiamen University， Xiamen 361005， China）

For the purpose of increasing the production of microbial polysaccharide gum， strain FJAT-10151， which showed a productivity of 8.65 g/L， was screened from 22 bacterial isolates conserved in our laboratory， which have been reported for the production of polysaccharide gum. The selected isolated was identified as Xanthomonas axonopodis by 16S rDNA sequence analysis. By morphology observation， physiological and biochemical tests and Gram staining， it was further identified as a Gram negative strain， and its colonies were small， round， yellowish， opaque and mobile， having a smooth，moist and slightly bulge surface and regular edge. Polysaccharide gum was isolated from the fermentation broth of the strain in water extraction and alcohol precipitated. As determined by phenol-sulfuric acid method， carbazole method and Coomassie brilliant blue method， the contents of neutral saccharide， acidic saccharide and protein in the exopolysaccharide gum were 36.81%， 8.90% and 15.27%， respectively. The polysaccharide gum was deproteinized by the Sevage method and then completely hydrolyzed for gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） analysis after derivatization to aldononitrile acetates. The analysis indicated that it mainly consisted of glucose and mannose at a molar ratio of 1:1.12. It was identified by FTIR， UV spectroscopy and GC-MS as a xanthan. Gelation properties of the polysaccharide gum were tested by viscosity and texture profile analysis （TPA）. The viscosity of 1 g/100 mL polysaccharide gum solution was 408 mPa?s at 60 r/min. The TPA results indicated that the polysaccharide gum extracted from Xanthomonas axonopodis FJAT-10151 had excellent gel properties with the smallest hardness， better elasticity and stickiness， and the best adhesiveness and chewiness compared with commercial gellan and xanthan. In conclusion， this Xanthomonas axonopodis strain has potential applications.

Xanthomonas axonopodis； xanthan； gumminess

2015-09-28

國家農(nóng)業(yè)部“948計劃”項目（2014-Z48）；福建省公益類科研院所專項（2015R1018-2）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新項目（2015CX-7）

鄭梅霞（1986—），女，實習(xí)研究員，碩士，研究方向為微生物生物技術(shù)。E-mail：zhengmeixia2005@163.com

劉波（1957—），男，研究員，博士，研究方向為微生物生物技術(shù)與農(nóng)業(yè)生物藥物。E-mail：fzliubo@163.com

10.7506/spkx1002-6630-201615029

TS202

A

1002-6630（2016）15-0171-08

引文格式：