煙粉虱溶菌酶基因的鑒定及表達分析

于 潔，王登杰，雷仲仁，王海鴻

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煙粉虱溶菌酶基因的鑒定及表達分析

于 潔1，王登杰2，雷仲仁1，王海鴻1

（1中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2四川省達州市達川區(qū)植保植檢站，四川達州 635000）

【目的】鑒定煙粉虱（）體內的溶菌酶基因，并對其序列特征、進化關系和表達模式進行分析，探索該基因在煙粉虱應對球孢白僵菌侵染過程中的作用，為進一步解析煙粉虱先天免疫過程提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳缘?代高通量測序的結果為依據(jù)，比對非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫，篩選E值＜10-5的基因為煙粉虱溶菌酶基因（lysozyme gene of，），利用ORF Finder預測的開放閱讀框，并得到氨基酸序列；利用Pfam和SMART預測BtLyz的蛋白質結構域；利用SinglP 4.1 Server預測BtLyz序列的信號肽；利用MEGA6.0軟件進行BtLyz的氨基酸多序列比對；利用MEGA6.0軟件，對BtLyz與其他昆蟲的31個同源蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，并利用鄰接法構建系統(tǒng)進化樹來進一步分析鑒定該基因；采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析球孢白僵菌侵染煙粉虱卵、若蟲、成蟲后，在12、24、36、48、60 h時目標基因的時空表達模式?！窘Y果】鑒定出煙粉虱4個溶菌酶基因，分別命名為、、和，基因序列全長分別為1 819、1 149、829和928 nt，分別編碼159、160、148和160個氨基酸，且均含有信號肽。蛋白質結構分析、氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，BtLyz1和BtLyz4屬于i型溶菌酶，BtLyz2和BtLyz3屬于c型溶菌酶。BtLyz-1與豌豆長管蚜ApLyz-i1位于同一進化支上，BtLyz4與柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆長管蚜ApLyz-i2位于同一進化支上。BtLyz2和BtLyz3與褐飛虱NlLyz-c1和異色瓢蟲HaLyz-c3位于同一進化支上。與對照相比，卵期4個溶菌酶基因和若蟲期的相對表達量沒有顯著變化；若蟲期的相對表達量先上調再下調，而后又有所上調的波動趨勢，24 h時上調表達最明顯，為對照組的4.55倍；成蟲期和的相對表達量均為先上調再下調，而后又有所上調的波動趨勢，60 h時上調表達最明顯，為對照組的11.31和4.21倍；若蟲期和的相對表達量均為先上調再下調表達，在誘導24 h時上調表達最明顯，為對照組的5.09和8.31倍，而后急劇下調，在60 h時下調表達最明顯，為對照組的0.19和0.13倍；成蟲期和的相對表達量均為先上調再下調的表達趨勢，在24 h時上調最明顯，為對照組的5.56和8.84倍。【結論】從煙粉虱體內鑒定了4個溶菌酶基因序列，其中2個為c型溶菌酶序列，2個為i型溶菌酶序列；在球孢白僵菌侵染煙粉虱不同蟲態(tài)、不同時間后，卵期的相對表達量與對照相比沒有顯著變化；在若蟲和成蟲期，不同表現(xiàn)出不同的表達趨勢。4個可能參與了煙粉虱對真菌侵染的免疫反應，有可能成為煙粉虱生物防治的潛在新靶標。

煙粉虱；溶菌酶；生物信息學分析；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】溶菌酶（lysozyme，Lyz）在昆蟲先天免疫過程中起到抵抗細菌[1-3]、真菌[1,4-6]和病毒[7]的重要作用，是一種廣譜的抗菌效應分子，為昆蟲組織中分布最廣泛的抗菌蛋白[8]。因此，研究昆蟲溶菌酶基因的作用對理解昆蟲先天免疫反應具有重要意義。【前人研究進展】溶菌酶又稱胞壁質酶或-乙酸胞壁質聚糖水解酶，能夠特異水解肽聚糖中-乙酰葡聚胺和-乙酰胞壁酸之間的-1,4-糖苷鍵，破壞肽聚糖支架，在內部滲透壓的作用下致使細胞脹裂開，引起微生物的裂解[1]。在動物中主要有3種不同類型的溶菌酶，即c型溶菌酶（chicken type）、g型溶菌酶（goose type）、i型溶菌酶（invertebrate type）[1,4]。在昆蟲體內主要分布為c型和i型溶菌酶：c型溶菌酶有8個半胱氨酸殘基（形成分子內二硫鍵）和2個潛在的催化位點（谷氨酸和天冬氨酸）[9]；i型溶菌酶由10或12個半胱氨酸殘基形成分子內二硫鍵[10]。溶菌酶作為首個從昆蟲體內純化的抗菌物質，在多種昆蟲中均被發(fā)現(xiàn)。大蠟螟（）在幼蟲到蛹的變態(tài)階段，溶菌酶的活性顯著增強[11]；棉鈴蟲（）溶菌酶在幼蟲期間呈組成型低表達，在蛹期表達量急劇增加，在蛹中期達到峰值，蛹后期和成蟲期又下調表達[12]；岡比亞按蚊（）溶菌酶在不同發(fā)育階段和不同組織中均被發(fā)現(xiàn)[13]；斜紋夜蛾（）溶菌酶在末齡若蟲的血淋巴中被分離出來[14]；煙粉虱（）是蔬菜、花卉和棉花等經(jīng)濟作物上的重要害蟲[15]，應用球孢白僵菌（）防治煙粉虱是一種有效的生物防治手段[16-18]?！颈狙芯壳腥朦c】溶菌酶在昆蟲先天免疫過程中起著重要作用，目前國內外對昆蟲溶菌酶的研究以家蠶（）[3,19]、褐飛虱（）[20]、沙漠蝗（）[21]、岡比亞按蚊[13,22]、斜紋夜蛾[14]等昆蟲為主，而針對經(jīng)濟危害性巨大的煙粉虱卻沒有得到鑒定和相關研究?！緮M解決的關鍵問題】通過對球孢白僵菌侵染煙粉虱的轉錄組數(shù)據(jù)分析，鑒定出煙粉虱體內的溶菌酶基因序列，并利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析煙粉虱不同蟲態(tài)被球孢白僵菌侵染后的mRNA轉錄水平變化，以期為深入研究這些基因在煙粉虱先天免疫反應中的作用提供線索。

1 材料與方法

試驗于2015年在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所完成。

1.1 BtLyz的蛋白結構檢測與系統(tǒng)進化分析

來自于筆者實驗室第2代高通量測序結果[17]。將初步篩選得到的基因在NCBI的NR核酸數(shù)據(jù)庫中通過BLASTX算法進行搜索，當E值＜10-5時進一步確定為。利用ORF Finder預測的開放閱讀框，并得到氨基酸序列；利用Pfam和SMART預測BtLyz的蛋白質結構域；利用SinglP 4.1 Server預測BtLyz序列的信號肽；利用MEGA6.0軟件進行BtLyz的氨基酸多序列比對；利用MEGA6.0軟件，對BtLyz與其他昆蟲的31個同源基因進行系統(tǒng)進化分析，并采用鄰接法（neighbor-joining method）構建系統(tǒng)進化樹。

1.2 供試真菌

選用球孢白僵菌菌株GZGY-1-3，保藏在中國普通微生物菌種保藏中心（No. 9254），該菌株對煙粉虱具有高致病性[17-18]。參考王登杰等[18]的方法制備培養(yǎng)基：玉米粉2%、麥麩1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.3%、MgSO4·7H2O 0.1%、NH4NO30.1%、瓊脂2%、無菌水96%。在溫度為25℃、光周期為L﹕D=12 h﹕12 h的條件下將球孢白僵菌分生孢子在培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，獲得分生孢子后，于4℃下冷藏貯存。用無菌的接種環(huán)將孢子從培養(yǎng)基上刮下，置于滅菌的0.05%吐溫-80溶液中配置成1.0×108個/mL的孢子懸浮液備用。

1.3 供試昆蟲

供試煙粉虱采集自河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所實驗基地番茄（）上，根據(jù)線粒體DNA上的COⅠ基因序列鑒定其為Q生物型[23]，用番茄幼苗飼養(yǎng)于中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所蔬菜害蟲組養(yǎng)蟲室內，飼養(yǎng)條件為溫度26℃、光周期L﹕D=12 h﹕12 h、相對濕度60%—80%。

從大量飼養(yǎng)的煙粉虱中收集600對成蟲，放入裝有6株高25 cm左右的健康番茄苗的養(yǎng)蟲籠（35 cm×42 cm×45 cm）內讓其產(chǎn)卵，24 h后將植株上的煙粉虱成蟲全部移除，保留帶有新鮮卵的番茄植株備用。

卵：剪下上述帶有新鮮卵的番茄葉片用球孢白僵菌孢子懸浮液浸泡10 s，自然晾干后將葉片放在保濕培養(yǎng)皿中，以未經(jīng)球孢白僵菌懸浮液處理作對照。于處理12、24、36、48、60 h后分別取樣，每次收集300粒卵作為1個樣品。取樣時用毛細管吸取少量的Trizol試劑，然后在葉片上利用毛細現(xiàn)象吸取葉片上的卵。

若蟲：將上述帶有新鮮卵的番茄植株放入干凈的養(yǎng)蟲籠中，15 d后大多數(shù)卵已發(fā)育為4齡若蟲，將帶有4齡若蟲的葉片剪下，放入球孢白僵菌懸浮液中浸泡10 s，自然晾干后的葉片放在保濕培養(yǎng)皿中，以未經(jīng)球孢白僵菌懸浮液處理作對照。于處理12、24、36、48、60 h后分別取樣，每次收集50只若蟲作為1個樣品。

成蟲：取新鮮干凈的番茄幼苗葉片，放入球孢白僵菌懸浮液中浸泡10 s，自然晾干后的葉片放在保濕培養(yǎng)皿中，然后收集當天羽化的煙粉虱成蟲若干也放入培養(yǎng)皿中，讓其自由接觸葉片上的孢子，以未經(jīng)球孢白僵菌懸浮液處理作對照。于處理12、24、36、48、60 h后分別取樣，每次收集50只成蟲作為1個樣品。

每次收集的樣品立即放入液氮中凍存用于qRT-PCR檢測。分別收集3次樣品作為3次重復。

1.4 總RNA的提取、cDNA第一鏈的合成及qRT-PCR檢測

用1 mL Trizol重懸上述3個蟲態(tài)不同時間點的煙粉虱樣品，按Trizol Reagent說明書提取總RNA，RNA純度及定量則采用紫外分光光度法進行測定，取OD260/280處于1.9—2.1及OD260/230處于1.8—2.1的RNA備用。依據(jù)Reverse Transcription System以2 μg·μL-1總RNA為模板制備cDNA第一鏈，加入總RNA 1.0 μL、Oligo (dT)15Primer 1.0 μL、Nuclease-Free Water 8.0 μL，混勻后70℃變性5 min，完成后置于冰上，繼續(xù)在樣品管中加入RT-Mix 10 μL（Nuclease-Free Water 1.6 μL、Goscript 5×Reaction Buffer 4.0 μL、25 mmol·L-1MgCl22.0 μL、PCR Nucleotide Mix 1.0 μL、Recombinant RNasin? Ribonuclease Inhibitor 0.4 μL、Reverse Transcriptase 1.0 μL）。反轉錄程序為：25℃退火5 min，42℃延伸60 min，70℃逆轉錄酶失活15 min，4℃終止反應。將cDNA稀釋10倍后用于qRT-PCR反應。

以煙粉虱第2代高通量測序的結果為依據(jù)[17]，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物用于的熒光檢測，內參基因采用（表1）。采用GoTaq? qPCR Master Mix試劑盒，設置20 μL反應體系：無核酸酶水7 μL、GoTaq? qPCR Master Mix 10 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、cDNA 2 μL。反應程序為：95℃預變性2 min，95℃變性15 s，60℃退火和延伸共1 min，進行40個循環(huán)；最后以0.01℃·s-1的速度從65—95℃記錄熔解曲線。熒光檢測均設置3次技術重復和3次生物學重復用于數(shù)據(jù)分析。依據(jù)各樣品和其相對應的的Ct值，參照2-ΔΔCt方法對qRT- PCR結果進行分析[24]。不同樣本之間的差異采用SAS 9.2軟件進行統(tǒng)計分析，以 Duncan氏新復極差方法進行差異顯著性檢驗。

表1 煙粉虱溶菌酶基因的qRT-PCR引物

2 結果

2.1 BtLyz蛋白結構與系統(tǒng)進化分析

通過BLASTX比對發(fā)現(xiàn)，有4個基因序列為序列，分別命名為、和，其核酸長度分別為1 819、1 149、829和928 nt，通過ORF Finder預測可能均為全長序列，分別編碼159、160、148和160個氨基酸。通過SignalP 4.1 Server 軟件分析發(fā)現(xiàn)，4個BtLyz均有信號肽，分別由22、21、22和21個氨基酸組成。通過Pfam在線分析發(fā)現(xiàn)，4個BtLyz均具有Lyz家族特有的保守性結構域（圖1），其中BtLyz1和BtLyz4為i型溶菌酶，BtLyz2和BtLyz3為c型溶菌酶。在i型溶菌酶中，有12個保守的半胱氨酸殘基位點（圖2）；在c型溶菌酶中，有8個半胱氨酸殘基和2個潛在的催化位點（即谷氨酸和天冬氨酸）（圖3）。對這4個BtLyz和其他昆蟲的31個Lyz的遺傳進化分析，i型和c型溶菌酶被分成了兩個獨立的群體：BtLyz1和BtLyz4聚在i型溶菌酶一支上，BtLyz-1與豌豆長管蚜ApLyz-i1位于同一進化支上，BtLyz4與柑桔木虱DcLyz-i3和豌豆長管蚜ApLyz-i2位于同一進化支上；BtLyz2和BtLyz3聚在c型溶菌酶一支上，與褐飛虱NlLyz-c1和異色瓢蟲HaLyz-c3位于同一進化支上（圖4）。

Destabilase：i型溶菌酶的失穩(wěn)酶家族保守結構域Destabilase superfamily of i-type lysozyme；LYZ1：c型溶菌酶c-type lysozyme；紫紅色表示低復雜度的區(qū)域Fuchsia indicated low complexity area

Bt：煙粉虱Bombyx mori；Ag：岡比亞按蚊Anopheles gambiae；Am：意蜂Apis mellifera；Bm：家蠶Bombyx mori；Dm：黑腹果蠅Drosophila melanogaster；Ea：安德愛勝蚓Eisenia andrei；Pa: 美洲大蠊Periplaneta americana。下同The same as below。下劃線表示預測的信號肽The predicted secretion signal peptide was underlined；紅色字體表示保守的半胱氨酸red letters indicated conserved cysteine；藍色字體表示保守的組氨酸blue letters indicated conserved histidine；“·”代表序列比對的空位“·” indicated sequence alignment vacancies

Aa：埃及伊蚊Aedes aegypti；Hc：刻克羅普斯蠶蛾Hyalophora cecropia；Lm：東亞飛蝗Locusta migratoria；Ms：煙草天蛾Manduca sexta。下同The same as below。下劃線表示預測的信號肽The predicted secretion signal peptide was underlined；紅色字體表示保守的半胱氨酸Red letters indicated conserved cysteine；藍色字體表示保守的谷氨酸和天冬氨酸Blue letters indicated conserved glutamate and aspartate；“·”代表序列比對的空位“·” indicated sequence alignment vacancies

Ad：達氏按蚊Anopheles darlingi；Ap：豌豆長管蚜Acyrthosiphon pisum；Dc：柑橘木虱Diaphorina citri；Gm：大蠟螟Galleria mellonella；Ha：異色瓢蟲Harmonia axyridis；Mr：苜蓿切葉蜂Megachile rotundata；Nl：褐飛虱Nilaparvata lugens：Px：柑橘鳳蝶Papilio xuthus；Tb：巴西錐蝽Triatoma brasiliensis；第1支Clade 1：c型溶菌酶c-type lysozymes；第2支Clade 2：i型溶菌酶i-type lysozymes

2.2 球孢白僵菌侵染煙粉虱后的表達分析

煙粉虱受球孢白僵菌侵染后，4個的相對變化量均有變化。卵期在不同時間點的相對表達量較穩(wěn)定，且均與對照水平相當。在若蟲期處于先上調再下調，而后又有所上調的波動趨勢，24 h時上調表達最明顯，為對照組的4.55倍；和在若蟲期均為先上調表達再下調表達，在24 h時上調最明顯，為對照組的5.09和8.31倍，而后急劇下調，在60 h時下調表達最明顯，為對照組的0.19和0.13倍；在若蟲期的相對表達量較穩(wěn)定，與對照水平相當。和在成蟲期均為先上調再下調，而后又有所上調的波動趨勢，60 h時上調表達最明顯，為對照組的11.31和4.21倍；和在成蟲期均為先上調再下調的表達趨勢，在24 h時上調最明顯，為對照組的5.56和8.84倍（圖5）。

圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤。不同小寫字母表示經(jīng)Duncan新復極差方法檢驗在P＜0.05水平差異顯著

3 討論

通過蛋白質結構分析和氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，本試驗鑒定的4個BtLyz均具有Lyz的典型特征，此結果與已知昆蟲的Lyz蛋白質特征相一致[2,21-22]。本文中筆者發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱中的2個基因編碼c型溶菌酶，2個基因編碼i型溶菌酶。在其他昆蟲中，報道了更多的溶菌酶基因，如異色瓢蟲中有4個基因編碼c型溶菌酶，6個基因編碼i型溶菌酶[25]；油菜露尾甲（）中有6個基因編碼c型溶菌酶，5個基因編碼i型溶菌酶[26]；岡比亞按蚊中有8個基因編碼c型溶菌酶，2個基因編碼i型溶菌酶[13]；褐飛虱中有1個基因編碼c型溶菌酶，7個基因編碼i型溶菌酶[20]。Q型煙粉虱中是否還存在更多的其他、B型生物型煙粉虱中溶菌酶的存在情況等均需要進一步探究。

煙粉虱4個溶菌酶均含有信號肽，這種結構也在異色瓢蟲[25]、岡比亞按蚊[13,22]、褐飛虱[20]等昆蟲中發(fā)現(xiàn)，Irwin等[27]認為，溶菌酶若具有信號肽，則屬于分泌型蛋白，且分子內二硫鍵使分子呈緊密橢球形有助于溶菌酶分泌到胞外。煙粉虱溶菌酶均具有信號肽和多個保守的半胱氨酸殘基，由此推測為分泌型表達蛋白。

鑒定的4個BtLyzs與不同昆蟲的Lyz在進化關系上相近。其中，BtLyz2和BtLyz3聚在c型溶菌酶一支上，與褐飛虱NlLyz-c1和異色瓢蟲HaLyz-c3位于同一進化支上，說明可能來源于共同的祖先，且在先天免疫反應中執(zhí)行類似的功能。NlLyz-c1和HaLyz-c3在中性介質中均攜帶負電荷，屬于酸性酶類（pI分別為6.64和5.46），這可能使其在帶負電的微生物表面便于擴散[20,25]，BtLyz2和BtLyz3在中性介質中可能也攜帶負電荷。HaLyz-c3是異色瓢蟲體內主要的溶菌酶，呈組成型表達，外源微生物對該基因的表達并沒有產(chǎn)生明顯的影響[25]；NlLyz-c1在褐飛虱的5齡若蟲階段顯著高水平表達，且在唾液腺中特異性表達[20]。煙粉虱和褐飛虱同屬于半翅目，在功能上可能更相似，其中NlLyz-c1呈誘導型表達模式[20]，這與煙粉虱被球孢白僵菌侵染時類似。BtLyz1和BtLyz4聚在i型溶菌酶一支上，BtLyz-1與豌豆長管蚜ApLyz-i1位于同一進化支上，BtLyz4與柑橘木虱DcLyz-i3和豌豆長管蚜ApLyz-i2位于同一進化支上，其中，煙粉虱、柑橘木虱和豌豆長管蚜均屬于廣義的半翅目害蟲，說明可能來源于共同的祖先，且在先天免疫反應中執(zhí)行類似的功能。

通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，被球孢白僵菌侵染的煙粉虱體內，4個在不同蟲態(tài)不同時間點表達量均發(fā)生變化，進一步證明了上述4個均與免疫有關的推測。不同的誘導倍數(shù)不同，表明煙粉虱的免疫應答方式不同。在褐飛虱的卵期一直處于低表達水平[20]，這與煙粉虱卵期和若蟲期在不同時間點的相對表達量較穩(wěn)定的現(xiàn)象類似，推測溶菌酶在煙粉虱卵期和若蟲期不發(fā)揮免疫功能。棉鈴蟲幼蟲受球孢白僵菌感染不同時間，溶菌酶基因先上調再下調表達，在24 h時達到最高[12]，這與和在若蟲和成蟲期的表達模式類似。受綠僵菌變種（var.）感染的沙漠蝗體內溶菌酶活性顯著降低[6]，甜菜夜蛾（）幼蟲在受真菌感染后，溶菌酶基因的表達量先下調再上調，在即將死亡時表達量達到最高[5]，這與煙粉虱溶菌酶的表達方式均不同。另外，若蟲期和成蟲期與成蟲期的相對表達量均處于先上調再下調，而后又有所上調的波動趨勢，這與其他昆蟲溶菌酶的表達模式不同。除和在若蟲期的相對表達量變化趨勢不同外，其他c型溶菌酶和i型溶菌酶的相對表達量變化趨勢一致，推測c型和i型溶菌酶可能在不同的免疫通路中發(fā)揮作用。

4 結論

從煙粉虱轉錄組數(shù)據(jù)中鑒定了4個溶菌酶基因序列，其中2個為c型溶菌酶序列，2個為i型溶菌酶序列；與對照相比，煙粉虱被球孢白僵菌處理不同時間后，卵期的相對表達量較穩(wěn)定；在若蟲和成蟲期，不同表現(xiàn)出不同的表達趨勢。4個可能參與了煙粉虱對真菌侵染的免疫反應中，有可能成為煙粉虱生物防治的新靶標。

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（責任編輯 岳梅）

Identification and Expression Analysis on Lysozyme Gene of

YU Jie1, WANG Deng-jie2, LEI Zhong-ren1, WANG Hai-hong1

(1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193;2Dachuan Plant Protection and Quarantine Station in Dazhou City of Sichuan Province, Dazhou 635000, Sichuan)

【Objective】The objective of this study is to provide a basis for understanding the important role of lysozyme genes ininfected by the fungus, identify lysozyme genes and analyze their sequence features, evolutionary relationships and expression pattern, and to provide a theoretical foundation for charifying innate immunity in【Method】Target genes were screened from the results of the second-generation high-throughput sequencing against the redundancy nucleotide databases when the E value ＜10-5. The open reading frame and amino acid sequence ofwere found using the ORF Finder software; the protein domains of BtLyzs were predicted using Pfam and SMART software; the signal peptide sequence of BtLyzs was predicted using SignalP 4.1 Server; the amino acid sequence alignment of BtLyzs was performed using the MEGA6.0 software; BtLyzs were characterized by using phylogenetic analysis with homologous genes of 31 other insects, a neighbor-joining of phylogenetic tree was constructed using the MEGA 6.0 software for further analysis and identification of the genes. The expression pattern of screened genes were determined at egg, nymph and adult stages ofwhich were infected by the fungusafter 12, 24, 36, 48, 60 h using the quantitative real-time PCR (qRT-PCR). 【Result】 Four lysozyme genes were identified and designated as,,and, which were 1 819, 1 149, 829, 928 nt, respectively. They were predicted to encode proteins of 159, 160, 148, 160 amino acids, respectively. Amino acid sequence alignment, phylogenetic analysis and protein tertiary structure prediction showed that BtLyz1 and BtLyz4 belong to i-type lysozymes, BtLyz2 and BtLyz3 belong to c-type lysozymes. BtLyz-1 formed a clade specific withof ApLyz-i1, BtLyz4 formed a clade specific withof DcLyz-i3 andof ApLyz-i2; BtLyz2 and BtLyz3 formed a clade specific withof NlLyz-c1 andofHaLyz-c3. Compared to the control, the relative expression of all four genes in egg andnymph stage underwent the fluctuation of up-regulation, down-regulation, and second up-regulation and peaked at 24 h, it was increased 4.55 folds compared to the control; the transcription ofandadult stage underwent the fluctuation of up-regulation, down-regulation, and second up-regulation and peaked at 60 h, they were increased 11.31 and 4.21 folds compared to the control. the transcription ofnymph stage underwent the fluctuation of up-regulation and down-regulation and peaked at 24 h, they were increased 5.09 and 8.31 folds compared to the control, then down-regulated obviously at 60 h, they were reduced 0.19 and 0.13 folds compared to the control. the transcription ofadult stage underwent the fluctuation of up-regulation and down-regulation and peaked at 24 h, they were increased 5.56 and 8.84 folds compared to the control. 【Conclusion】 Fourgenes were identified in. Among them, two are c-type and two are i-type lysozymes. Transcriptional levels of four BtLyzs genes inwere induced through different developmental stages and different time points in fungi-treated individuals compared to the control, they were not induced significantly in eggs, and showed different expression trends in nymphs and adults. The fourgenes probably might participated in the innate immune responses to fungus infection, and could be a new potential target for biocontrol of.

; lysozymes; bioinformatic analyses; quantitative real-time PCR

2016-02-04；接受日期：2016-04-17

國家科技支撐計劃（2012BAD19B06）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303019-02）

于潔，Tel：010-62815930；E-mail：candyyudi@163.com。王登杰，E-mail：wdj198974@163.com。于潔和王登杰為同等貢獻作者。通信作者王海鴻，E-mail：wanghaihong2020@sina.com