生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記在翹嘴鱖五代中的富集

宋　易　梁旭方　田昌緒　呂麗媛　趙　程

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省淡水漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記在翹嘴鱖五代中的富集

宋易梁旭方田昌緒呂麗媛趙程

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省淡水漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

為進(jìn)一步了解人工選育對(duì)翹嘴鱖生長(zhǎng)相關(guān)遺傳標(biāo)記的影響作用，研究以翹嘴鱖“華康1號(hào)”的5代選育群體為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)具有生長(zhǎng)相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因型的5個(gè)標(biāo)記的6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)直接測(cè)序和聚丙烯酰胺凝膠電泳兩種方法分型后，統(tǒng)計(jì)其優(yōu)勢(shì)基因型個(gè)體數(shù)目在翹嘴鱖5代中的變化。結(jié)果顯示，在5代群體中，2個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)和4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的數(shù)目的分布范圍為0—4，從F1到F5代，這6個(gè)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的平均值分別為0.36、0.71、0.68、0.77和0.94，優(yōu)勢(shì)基因型的平均含量隨選育世代的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，從側(cè)面反映了人工選育在一定程度上富集了優(yōu)良基因。此外，對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行了遺傳相似性和遺傳距離分析，結(jié)果顯示，隨著選育的進(jìn)行，后續(xù)世代與F1的遺傳距離有明顯的增大趨勢(shì)，遺傳相似性減小，這符合育種的客觀(guān)規(guī)律。但相鄰世代間的遺傳距離則逐代減小，遺傳相似性逐代增大，說(shuō)明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來(lái)了，這種相似性表現(xiàn)在表型上包括生長(zhǎng)快、體重大、體長(zhǎng)增加等。F1到F5代處于中度遺傳多樣性的穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明群體還存在選育空間。

優(yōu)勢(shì)基因型；富集；微衛(wèi)星；單核苷酸多態(tài)性；翹嘴鱖

翹嘴鱖（Siniperca chuatsi Basilewsky），俗稱(chēng)季花、桂花，隸屬鱸形目（Perciformes）、暖鱸科（Percichthyidea）、鱖屬，是鱖屬魚(yú)類(lèi)中體型最大、生長(zhǎng)最快的一種鱖。其肉質(zhì)堅(jiān)實(shí)細(xì)嫩、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、無(wú)肌間刺，是一種經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高的名貴品種，在我國(guó)淡水養(yǎng)殖業(yè)中占重要經(jīng)濟(jì)地位［1］。隨著鱖養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，其養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖密度不斷提高，水域生態(tài)環(huán)境不斷遭到人為破壞，加之飼養(yǎng)管理不善，使得鱖漁業(yè)資源大幅度減少，甚至成為偶見(jiàn)種［2］。因此，研究開(kāi)發(fā)和保護(hù)翹嘴鱖資源越顯重要和迫切，開(kāi)展翹嘴鱖的分子生物學(xué)研究，以揭示翹嘴鱖的遺傳特征，為漁業(yè)利用提供相關(guān)資料以及翹嘴鱖的人工養(yǎng)殖及資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

標(biāo)記輔助育種是分子生物學(xué)最有效的育種技術(shù)之一，近年來(lái)在越來(lái)越多的育種項(xiàng)目中，產(chǎn)業(yè)育種者已經(jīng)通過(guò)這種技術(shù)獲得了生長(zhǎng)顯著快的個(gè)體，從而減少了養(yǎng)殖群體一些經(jīng)濟(jì)性狀的的丟失，包括生長(zhǎng)速度、抗病率和存活率等［3，4］。但目前關(guān)于標(biāo)記輔助育種的研究主要集中在序列位點(diǎn)的篩選，和篩選出的位點(diǎn)與性能的相關(guān)性分析方面［5—7］，而對(duì)篩選出的與性狀具有顯著性相關(guān)的位點(diǎn)在選育過(guò)程中的一個(gè)變化趨勢(shì)，卻很少有人進(jìn)行過(guò)研究。本研究在已經(jīng)選育出了生長(zhǎng)快的翹嘴鱖5代群體的基礎(chǔ)上，對(duì)篩得的標(biāo)記進(jìn)行一個(gè)可靠性的驗(yàn)證，以分析其用于輔助育種的可靠性。同時(shí)為進(jìn)一步了解人工選育對(duì)翹嘴鱖生長(zhǎng)相關(guān)遺傳標(biāo)記的影響作用提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)中用到的5代群體從F1到F5代，其生長(zhǎng)速率依次增加［8，9］，在5代群體中對(duì)篩選到的分子標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目進(jìn)行分析，研究結(jié)果可為標(biāo)記輔助育種提供依據(jù)。

此外，由于優(yōu)勢(shì)基因型的數(shù)量與相關(guān)性狀的顯著性存在正相關(guān)性，Kelly等［10］早在1995年就證實(shí)了基因聚合育種可以通過(guò)選育同時(shí)具有幾種抗性基因的個(gè)體而使其在抗性和生長(zhǎng)速度上同時(shí)得到提高。因此，有研究者希望通過(guò)基因聚合育種加快育種進(jìn)程，Servin等［11］提出要提高物種的某一性狀遺傳價(jià)值就要通過(guò)增加控制這一性狀的優(yōu)勢(shì)基因數(shù)目來(lái)實(shí)現(xiàn)，Lange和Whittaker［12］以及Hayes和Goddard［13］也指出，通過(guò)將所有的有效標(biāo)記用于同一群體的選育可以提高分子標(biāo)記輔助育種的效率和成功率。在魚(yú)類(lèi)中，徐磊等［14］通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)基因型含量分析發(fā)現(xiàn)大口黑鱸的生長(zhǎng)速率與優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目之間存在正相關(guān)性，而李紅霞等［15］在建鯉中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)論。因此，通過(guò)將某一性狀相關(guān)的基因或基因型聚合在一個(gè)群體上進(jìn)行研究，能更好地反應(yīng)出標(biāo)記與性狀的相關(guān)性，提高標(biāo)記用于輔助育種的效率。本實(shí)驗(yàn)選取的2個(gè)多核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)篩選自生長(zhǎng)激素基因［4］，4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選自鱖轉(zhuǎn)錄組生長(zhǎng)相關(guān)基因鄰近序列［16］，將它們結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究是基因聚合育種科學(xué)性的體現(xiàn)。

此次研究在翹嘴鱖養(yǎng)殖5代群體共155個(gè)個(gè)體中進(jìn)行來(lái)自不同基因序列位點(diǎn)的生長(zhǎng)相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因型分析，在驗(yàn)證前期篩選到的位點(diǎn)用于輔助育種的可靠性的同時(shí)，又通過(guò)來(lái)自不同基因序列的微衛(wèi)星位點(diǎn)、單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)進(jìn)行綜合探究，得到的具有實(shí)際應(yīng)用性的位點(diǎn)，可用于今后普通翹嘴鱖個(gè)體的選育工作中。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)魚(yú)來(lái)源于翹嘴鱖的5個(gè)連續(xù)選育世代，是湖北省淡水漁業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心從2008—2013年間連續(xù)選育出的世代群體，從F1到F5代的生長(zhǎng)速率依次增加［8，9］。從每一個(gè)世代中隨機(jī)挑選31尾翹嘴鱖個(gè)體，共計(jì)155尾。剪取鰭條用95%的酒精保存，放入-20℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2引物

實(shí)驗(yàn)中用于優(yōu)勢(shì)基因型分析的共有5對(duì)多態(tài)性引物均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室已發(fā)表文獻(xiàn)［4，16］，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，引物由上海英駿完成合成，引物的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1　翹嘴鱖4對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)微衛(wèi)星位點(diǎn)和1對(duì)生長(zhǎng)相關(guān)SNPs位點(diǎn)的引物序列及特征Tab. 1　Primer sequences and characteristics of 4 growth-related microsatellites and growth-related SNPs of S. chuatsi（Basilewsky）

1.3方法

基因組DNA提取參照天根動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)的介紹方法提取樣品基因組DNA，1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，調(diào)整DNA終濃度到100 ng/μL后，-20℃保存。

PCR反應(yīng)程序PCR反應(yīng)總體積為50 μL，含有10×buffer 5 μL，dNTP（10 μmol/L） 1 μL，上下游引物（20 μmol/L）各1 μL，基因組DNA 1 μL，rTaq酶（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司） 0.5 μL。在Biometra070-851PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4min，然后30個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，53.5—55.5℃復(fù)性45s，72℃延伸30s，最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物的檢測(cè)SSR產(chǎn)物檢測(cè)：PCR產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE緩沖液，120 V/cm電壓電泳。電泳結(jié)束后，取下凝膠用雙蒸水漂洗30s，后轉(zhuǎn)移至0.1%硝酸銀染色10min，再用雙蒸去離子水快速漂洗2次后，加入700 mL 顯影液顯色（含14 g氫氧化鈉，0.28 g碳酸鈉，2.8 mL 37%甲醛），待條帶顯現(xiàn)后，加入雙蒸水終止顯色。用Alpha Innotech402942凝膠成像系統(tǒng)掃描記錄。并用Alpha View SA軟件對(duì)每對(duì)微衛(wèi)星引物擴(kuò)增的等位基因分子量大小進(jìn)行估算。

SNP產(chǎn)物檢測(cè)：將特異性好（瓊脂糖電泳條帶單一）的PCR產(chǎn)物送公司測(cè)序，獲得多態(tài)性位點(diǎn)序列信息。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

基因型的讀取微衛(wèi)星分位點(diǎn)分型：根據(jù)每個(gè)個(gè)體產(chǎn)生的條帶位置確定其基因型，讀取各個(gè)個(gè)體的基因型，并記錄。

單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)分型：將獲得的序列信息用SeqMan軟件進(jìn)行峰值讀圖，用MS-tools記錄每個(gè)群體中各個(gè)個(gè)體的位點(diǎn)的基因型，并記錄。

SNP位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的分型及生長(zhǎng)相關(guān)性分析參見(jiàn)田昌緒等［4］的研究，采用直接測(cè)序的方法對(duì)群體進(jìn)行基因型分型后，對(duì)各基因型與體重、體長(zhǎng)、體高進(jìn)行顯著性分析而得出其優(yōu)勢(shì)基因型；SSR位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的分型及生長(zhǎng)相關(guān)性分析參見(jiàn)易提林等［16］的研究，采用聚丙烯酰胺凝膠和銀染的方法對(duì)群體分型后，對(duì)基因型進(jìn)行體重、體長(zhǎng)、體高的顯著性分析而得出其優(yōu)勢(shì)基因型。SNP位點(diǎn)g.4940A＞C、g.4948A＞T的優(yōu)勢(shì)基因型為CC、TT，微衛(wèi)星位點(diǎn)SC10、SC52、Sin135、AP34-23的優(yōu)勢(shì)基因型為230/256、211/220、275/290、238/255。

基因型數(shù)目的統(tǒng)計(jì)分別在每代31個(gè)個(gè)體，共155個(gè)個(gè)體中統(tǒng)計(jì)其基因型數(shù)目，計(jì)算單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)g.4940A＞C、g.4948A＞T和微衛(wèi)星位點(diǎn)SC10、SC52、Sin135、AP34-23的優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目。

遺傳距離和遺傳相似性的計(jì)算基于微衛(wèi)星標(biāo)記的5個(gè)群體兩兩比較的遺傳相似度（S）和遺傳距離（D），按Nei［17］方法進(jìn)行計(jì)算，運(yùn)用軟件Mega 6.0進(jìn)行計(jì)算，并分析其變化趨勢(shì)，計(jì)算公式：S= 2 Nxy/（Nx+ Ny）。

把電泳圖譜中任何一個(gè)個(gè)體在任意一泳道垂直方向顯示的帶紋記做“1”，而其他個(gè)體對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)缺少此帶則記做“0”，這樣可以得到各個(gè)個(gè)體的二進(jìn)制數(shù)據(jù)信息的方陣。將上述二進(jìn)制數(shù)據(jù)方陣用PhylTools 軟件計(jì)算獲得個(gè)體間遺傳距離矩陣；根據(jù)Nei 公式計(jì)算任意翹嘴鱖的遺傳相似度S以及遺傳距離D。

其中，Nxy為兩個(gè)體共享的圖帶數(shù)，Nx和Ny分別為x和y 個(gè)體擁有的圖帶數(shù)。一個(gè)群體（或品種、品系）內(nèi)多個(gè)個(gè)體兩兩配對(duì)比較得到的S 值的平均值就反映了該群體內(nèi)DNA 指紋圖相似程度或變異程度。

遺傳多態(tài)性的計(jì)算利用Popgen32軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算出5個(gè)群體每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因觀(guān)測(cè)雜合度、基因期望雜合度等遺傳參數(shù)，分析其變化趨勢(shì)；

多態(tài)信息含量（Polymorphism information content，PIC）按BOTSTEIN等［18］的公式計(jì)算。

式中，Pi、Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因的頻率；n為等位基因頻率數(shù)目。

2　結(jié)果

2.1選育世代優(yōu)勢(shì)基因型的富集

每個(gè)選育世代優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目分布這5對(duì)引物在翹嘴鱖5代選育群體中表現(xiàn)出了良好的特異性和較高多態(tài)性，在155尾鱖DNA中擴(kuò)增后，統(tǒng)計(jì)每代優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目（表2）。

表2　翹嘴鱖每代個(gè)體優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)量的分布Tab. 2　The quantitative distribution of samples with different advantage genotypes of each generation

每個(gè)選育世代優(yōu)勢(shì)基因型頻率分布根據(jù)上述統(tǒng)計(jì)的每個(gè)世代優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目，計(jì)算每個(gè)世代的優(yōu)勢(shì)基因型頻率（表3），由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，從F1到F5，其優(yōu)勢(shì)基因型頻率呈上升趨勢(shì)。

表3　翹嘴鱖每代優(yōu)勢(shì)基因型總數(shù)頻率分布Tab. 3　The frequencies of total advantage genotypes in each generation of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

2.2五代群體遺傳距離分析

為研究選育對(duì)5代群體的遺傳結(jié)構(gòu)的影響，計(jì)算了各群體的微衛(wèi)星標(biāo)記間的遺傳距離和遺傳相似度（表4）。結(jié)果顯示，隨著選育的進(jìn)行，F(xiàn)5與F1的遺傳距離（黑體）有明顯的增大，遺傳相似性減小，這符合選育的客觀(guān)規(guī)律。但相鄰世代間的遺傳距離（黑體）則逐代減小，遺傳相似性逐代增大，說(shuō)明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來(lái)了，這種相似性表現(xiàn)在表型上包括生長(zhǎng)快、體重大、體長(zhǎng)增加等。

表4　基于微衛(wèi)星標(biāo)記的翹嘴鱖選育世代群體遺傳相似度（右上角）和遺傳距離（左下角）Tab. 4　The genetic similarity ang genetic ditance based on microsatellite of the breeding generations of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

2.3五代群體遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星標(biāo)記在5個(gè)群體中平均等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)、平均觀(guān)測(cè)雜合度和平均期望雜合度、平均多態(tài)信息含量（表5）。F1到F5代的PIC分別為0.5317、0.5611、0.5191、0.4248和0.4716，并沒(méi)有出現(xiàn)較大的波動(dòng)，根據(jù)Botstein等［18］提出的當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該位點(diǎn)為高度多態(tài)，當(dāng)0.25＜PIC＜0.5時(shí)，該位點(diǎn)為中度多態(tài)，當(dāng)PIC＜0.25時(shí)，則為低度多態(tài)。本研究隨機(jī)群體PIC處于中等多態(tài)水平，說(shuō)明群體能維持自身的穩(wěn)態(tài)，并存在選育空間。

表5　基于微衛(wèi)星標(biāo)記的翹嘴鱖選育世代群體遺傳多樣性參數(shù)Tab. 5　The diversity parameters based on microsatellite of the breeding generations of Siniperca chuatsi（Basilewsky）

3　討論

3.1生長(zhǎng)相關(guān)分子標(biāo)記優(yōu)勢(shì)基因型的富集

優(yōu)勢(shì)基因型在選育群體“華康1號(hào)”中的富集結(jié)果表明，這6個(gè)位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型平均值隨著群體生長(zhǎng)速率的增加而增大，這些位點(diǎn)可作為翹嘴鱖普通個(gè)體選育中的可靠性標(biāo)記用于將來(lái)的輔助育種中。這一結(jié)果對(duì)于魚(yú)類(lèi)其他經(jīng)濟(jì)性狀，比如肉質(zhì)、適溫性等的選育工作也是十分有借鑒作用的，研究者可以將前期篩得的與性狀相關(guān)的位點(diǎn)在一個(gè)表型明顯的世代群體中進(jìn)行驗(yàn)證，若具有較好的特異性，且位點(diǎn)的性狀相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因型與世代群體的表型有顯著的相關(guān)性，則可大大提高這些標(biāo)記用于后期輔助育種的成功率，減少一些因標(biāo)記的不實(shí)用性造成的損失。優(yōu)勢(shì)基因型以及基因聚合育種用于肉質(zhì)、生長(zhǎng)速率的選育工作前期已經(jīng)有研究者在建鯉［19］和大口黑鱸［20］中進(jìn)行過(guò)，也獲得了有效的性狀相關(guān)的標(biāo)記，且徐磊等［14］也在其選育的大口黑鱸世代群體中對(duì)前期篩得的標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，獲得了較好的檢測(cè)結(jié)果。

另外，孫效文等［21］在研究中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)記的數(shù)目與個(gè)體大小之間存在正相關(guān)性，也就是說(shuō)含有效生長(zhǎng)相關(guān)標(biāo)記越多的個(gè)體，其生長(zhǎng)速度越快。在這個(gè)事實(shí)的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中篩選到的標(biāo)記的生長(zhǎng)相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因型數(shù)目與世代群體的生長(zhǎng)速度之間存在正相關(guān)性，就說(shuō)明了這些位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)的可靠性。類(lèi)似的研究在其他水產(chǎn)動(dòng)物中還不夠深入，只是停留在位點(diǎn)的篩選和性狀相關(guān)性分析層面。何焱等［22］在中華鱘的LPL 和HL基因上篩得了生長(zhǎng)密切相關(guān)的SNP位點(diǎn)，彭敏燕等［23］在翹嘴鱖AMY基因上檢測(cè)到了SNP和SSR位點(diǎn)，并分析了其單倍型與攝食性狀的關(guān)聯(lián)性，陶文靜等［24］對(duì)生長(zhǎng)激素受體基因進(jìn)行了SNP位點(diǎn)篩選及增重相關(guān)性分析，但這些位點(diǎn)應(yīng)用于后期輔助育種工作的仍十分少見(jiàn)，若對(duì)這些篩選到的位點(diǎn)進(jìn)行類(lèi)似的標(biāo)記數(shù)目與個(gè)體表型之間的相關(guān)性分析，則可對(duì)其用于選育工作的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，促進(jìn)這些標(biāo)記在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用，這對(duì)提高標(biāo)記輔助育種的應(yīng)用性是十分有意義的。

3.2生長(zhǎng)相關(guān)基因的聚合育種

此外，本實(shí)驗(yàn)的2個(gè)多核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)篩選自生長(zhǎng)激素基因［4］，4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選自鱖轉(zhuǎn)錄組生長(zhǎng)相關(guān)基因鄰近序列［16］，這些位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)基因型的平均含量是對(duì)多個(gè)生長(zhǎng)相關(guān)基因的聚合效果，能更全面地反應(yīng)標(biāo)記與表型之間的相關(guān)性。研究表明，動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀都是受多個(gè)基因控制的［25］，因此，在不同基因序列上進(jìn)行位點(diǎn)篩選和優(yōu)勢(shì)基因型統(tǒng)計(jì)的多基因聚合分析，可以為了解多個(gè)基因作用于同一性狀的綜合作用奠定重要的基礎(chǔ)。多基因聚合分析在真菌系統(tǒng)分類(lèi)［26］、雞肌肉脂肪性狀［27］和豬繁殖性狀［28］的研究中都已用到，但在魚(yú)類(lèi)中的應(yīng)用還不多，郭立等［29］進(jìn)行了線(xiàn)粒體多基因聚合分析在鯔科魚(yú)類(lèi)的譜系篩選及其效應(yīng)探究，徐磊等［14］做了優(yōu)勢(shì)基因型在大口黑鱸中的富集分析，此外，類(lèi)似的聚類(lèi)研究主要集中在地理分布［30］和外形分析［31］等方面，深入分子水平的聚合分析還有待進(jìn)一步研究。而微衛(wèi)星遺傳距離的分析說(shuō)明人工選育將遺傳相似性較大的群體保留下來(lái)了，這種相似性表現(xiàn)在表型上包括生長(zhǎng)快、體重大、體長(zhǎng)增加等，這是對(duì)人工選育作用的進(jìn)一步驗(yàn)證。F1到F5代的遺傳多樣性并沒(méi)有出現(xiàn)較大的波動(dòng)，而是處于一個(gè)穩(wěn)定的中等水平，說(shuō)明群體既存在選育空間，又可以處于自身穩(wěn)定的狀態(tài)。

綜上所述，分子標(biāo)記輔助育種和基因聚合育種相結(jié)合的育種思路已經(jīng)越來(lái)越受到關(guān)注。本研究中用到的生長(zhǎng)激素基因已經(jīng)得到較深入研究，許多研究者都在魚(yú)類(lèi)里驗(yàn)證了該基因的生長(zhǎng)功能［32—35］。而翹嘴鱖“華康1號(hào)”5代選育群體具有從F1到F5生長(zhǎng)速率依次增加的明顯表現(xiàn)型，在這樣的選育群體中對(duì)篩選到的分子標(biāo)記的生長(zhǎng)相關(guān)優(yōu)勢(shì)基因型平均值進(jìn)行分析，可以驗(yàn)證標(biāo)記用于輔助育種的可靠性，同時(shí)可以檢測(cè)人工選育對(duì)翹嘴鱖生長(zhǎng)相關(guān)遺傳標(biāo)記的影響作用。但是，選育出具有顯著表型的群體是一個(gè)較龐大的工程，群體的選育和標(biāo)記的篩選是一個(gè)互相檢測(cè)的過(guò)程，若選育出表型顯著的群體，類(lèi)似本實(shí)驗(yàn)的研究便可開(kāi)展，為篩選到更多可用于輔助育種的標(biāo)記提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料，同時(shí)大大減少了育種的工作量。另外，從研究較透徹的性狀相關(guān)功能基因上去篩選標(biāo)記，也可大大提高標(biāo)記的可靠性［36］，候選基因法近些年在人類(lèi)疾病、鳥(niǎo)類(lèi)遷徙適應(yīng)性和谷物含鋅量、抗病性等方面都得到應(yīng)用［37—39］，在水產(chǎn)動(dòng)物上的發(fā)展也在推進(jìn)［40—43］。多基因、多標(biāo)記的聚合分析已經(jīng)是育種的必然趨勢(shì)，而獲得表型顯著的群體后，這種分析又可變得更快、更容易實(shí)現(xiàn)了。

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PYRAMIDING OF GROWTH-RELATED MARKERS IN FIVE BREEDING GENERATIONS OF SINIPERCA CHUATSI BASILEWSKY

SONG Yi，LIANG Xu-Fang，TIAN Chang-Xu，Lü Li-Yuan and ZHAO Cheng
（Key Lab of Freshwater Animal Breeding，College of Fisheries，Huazhong Agricultural University，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province，Wuhan 430070，China）

Gene pyramiding breeding is based on the effect of polygenic polymerization to change correlated character. In previous studies，growth-related markers were found in Siniperca chuatsi. Among them，five markers with six growth-favorable genotypes were selected，including two sites of single nucleotide polymorphism（SNP） located in GH gene and four sites of microsatellite（SSR）：SC10，SC52，Sin135 and AP34-23. To get deeper insight into the effect of artificial breeding on growth-related markers identified in previous studies，we analyzed the number of favorable genotypes of these markers in five breeding generations of Siniperca chuatsi，‘Huakang No.1'. By direct-sequencing and polyacrylamide gel electrophoresis，we found that the sum of two SNP favorable genotypes and four SSR favorable genotypes appeared pyramiding. The result showed that the number of total favorable genotypes ranges from 0 to 4 in the tested fishes. The average contents were 0.36，0.71，0.68，0.77，0.94 in F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，F(xiàn)4 and F5 generations，respectively，showing the number of favorable genotypes increased synchronously with the growth rate of the populations，which reflects that，artificial breeding has aggregated favorable genotypes in some degree. The SSR analysis showed that，when compared with F1，the genetic distances increased from F2 to F5 while the genetic similarity decreased，which observed objective law. When compared with its contiguous generation，the genetic distances decreased from F1 to F5 while the genetic similarity increased. The analysis of the genetic distances indicated that artificial breeding has conserved individuals of higher genetic similarity，which in performance have phenotypes of fast growth，heavier body weight or longer body length. The genetic diversity shows no large fluctuations，but a state of stability，which indicated further space for breeding.

Favorable genotype； Pyramiding； SSR； SNP； Siniperca chuatsi Basilewsky

G344+.1

A

1000-3207（2016）05-0951-07

10.7541/2016.123

2016-03-30；

2016-05-05

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272641）； 珠江流域高產(chǎn)精養(yǎng)池塘健康養(yǎng)殖技術(shù)與示范（2012BAD25B04）； 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)（2662015PY041，2015BQ040）專(zhuān)項(xiàng)資助 ［Supported by the Science Foundation of China（31272420）； the Key Projects in the National Science & Technology Pillar Program（2012BAD25B04）； the Fundamental Research Funds for the Central Universities（2662015PY041，2015BQ040）］

宋易（1991—），女，湖北咸寧人； 在讀碩士生； 研究方向?yàn)轸~(yú)類(lèi)遺傳與育種。E-mail：15902792427@163.com

梁旭方（1965—），男，博士，教授； E-mail：xufang_liang@hotmail.com