卵巢顯微制片及觀察計數(shù)的規(guī)范化方法

鄭 翔，畢文杰

（1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎醫(yī)學專業(yè)實驗室，成都610041；2.成都醫(yī)學院人體解剖學與組織胚胎學教研室，成都610500）

卵巢顯微制片及觀察計數(shù)的規(guī)范化方法

鄭 翔1，畢文杰2

（1.四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎醫(yī)學專業(yè)實驗室，成都610041；2.成都醫(yī)學院人體解剖學與組織胚胎學教研室，成都610500）

常規(guī)顯微制片技術在生物醫(yī)學領域具有重要作用。制片和觀察計數(shù)的方法亟待規(guī)范。該文以卵巢不同發(fā)育階段卵泡的計數(shù)研究為例，展示了常規(guī)顯微制片和觀察計數(shù)的原理與規(guī)范化方法，并融入了近年的技術改進。該文以具體實驗為基礎，探討了該技術的一般性操作原理和方法，旨在穩(wěn)定和提高顯微形態(tài)學研究的質量。

常規(guī)顯微制片；計數(shù)；卵巢；卵泡；大鼠

標本顯微制片和觀察計數(shù)是生物學與醫(yī)學領域必要的實驗技能。其中，動物組織常規(guī)顯微制片一般采用甲醛固定、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色（HE staining）的方法［1］。該法結果精美，易批量和連續(xù)制片，標本蠟塊耐保存［1-2］。然而，實驗耗時較長，操作環(huán)節(jié)多，技術經(jīng)驗對結果影響較大。目前國內高校實驗室和臨床病理科室的專職制片人員，普遍存在老齡化和人數(shù)銳減的問題。此外，商品化數(shù)字切片的教學應用［3］，進一步削弱了教學單位對制片技術的需求。因此，常規(guī)顯微制片這一基礎性重要技術，很多單位已不重視；相關專業(yè)研究生往往未掌握合格的制片操作，甚至將顯微制片任務外包。本文認為，要提高生物、醫(yī)學研究團隊的水平和高校形態(tài)學科的教學質量，提升常規(guī)顯微制片的質量、規(guī)范技術操作勢在必行。本文以醫(yī)學研究中常用的一個具有代表性的實驗——卵巢中不同發(fā)育階段的卵泡計數(shù)為例，介紹常規(guī)顯微制片和計數(shù)的規(guī)范化方法。

1 技術原理與設備條件

常規(guī)顯微制片的基本原理是:新鮮標本經(jīng)甲醛等化學試劑的作用，發(fā)生蛋白交聯(lián)［1］，即“化學固定”（chemical fixation）。固定后微觀結構和化學成分得以穩(wěn)定，防止自溶與腐敗。固定后標本仍富含水分，須經(jīng)有機試劑浸透脫水，最后用融化的石蠟進行置換，實現(xiàn)石蠟包埋（paraffin embedding）。標本的包埋蠟塊硬度和韌性適中，可借助切片機用鋒利刀片切成幾微米厚的薄切片。切片裱貼在防脫載玻片上進行HE染色。其中，蘇木素（hematoxylin）成分將細胞核、胞質的嗜堿性顆粒、細胞外基質的糖胺多糖等染成藍紫色，伊紅（eosin）則將其余結構染成深淺不等的粉紅色。染色切片經(jīng)透明和蓋玻片封固，可在顯微鏡下成像。

常規(guī)顯微制片及觀察計數(shù)的必要設備有:60℃恒溫箱、輪轉式切片機、生物組織攤烤片儀、生物顯微鏡和顯微照相系統(tǒng)。需批量儲備試劑和標本應配備4℃冰箱；制片工作量很大的科室可配備包埋工作臺、脫水機、染色機等自動化設備。

2 標本化學固定

新鮮的人體或實驗動物標本，應盡快進行化學固定，防止組織缺氧后發(fā)生變化。卵巢常規(guī)制片，從組織離體或血供停止到浸透固定液，要求不超過1 h。由于固定液滲透時間與標本厚度的平方正相關［1］，故根據(jù)實踐，標本內部任一點距表面的最短距離不應超過2.5 mm。大鼠卵巢一般不超過該尺寸，可不切開。浸泡固定的時間不小于3 h，時間上限根據(jù)實驗目的確定。實驗暫停較久（如超過1月），應將標本保存在70乙醇中，勿長期存留于固定液。如需同步固定全身組織，可經(jīng)心臟或升主動脈灌注固定［4］。取材動作應輕柔，用鋒利眼科剪從輸卵管或子宮末端離斷，必要時夾持、犧牲卵巢周圍的脂肪組織，避免手術器械擠壓卵巢實質。

最常用的固定液為中性緩沖甲醛（neutral buffered formalin，NBF）［1，5］。NBF穩(wěn)定耐保存，作用溫和，適于絕大多數(shù)研究。甲醛溶液應從多聚甲醛加熱溶解獲得。市售37～40甲醛含有不少于8的穩(wěn)定劑甲醇，滲透速度快于甲醛，易損傷卵母細胞的膜性結構。標準配方中NBF滲透壓約940 mOsm/L，可通過增減磷酸鹽緩沖對的量來調整。一般采用600～940 mOsm/L固定，液量不小于標本體積20倍，都能得到良好固定。不能按生理滲透壓配液，否則溶液滲透壓易受卵泡液和其他體液影響，導致結構變形。NBF的pH介于6.8～7.2；太低交聯(lián)過快，后續(xù)步驟易致標本收縮硬化；太高造成某些分子改變，染色對比不佳。不論浸泡還是灌注固定，固定液溫度應保持15℃～25℃。過度預冷可能造成結構失真［6］。

3 石蠟包埋

目前國內外普遍采用乙醇脫水、二甲苯透明和石蠟3步浸透的包埋流程［1，5］。該法中試劑可重復利用，但步驟多、標本收縮顯著。四氫呋喃脫水、石蠟2步浸透的流程更快捷，標本不收縮，切片難度小，制片質量高于乙醇、二甲苯流程［7］。按表1所示的流程，通常半日即可完成操作。石蠟包埋、冷卻和蠟塊修切的方法與傳統(tǒng)流程相同。大鼠卵巢肉眼觀類似微縮的“多囊腎”。為提高效率，卵巢切片應沿短軸前進，取最大切面面積，故包埋時應使卵巢自然平放。

表1 標本脫水及石蠟包埋操作改進流程

4 石蠟切片

卵巢包埋蠟塊安裝在輪轉式切片機上，按4～6 μm切片。大鼠卵巢尺寸小，卵泡分布密集，進行連續(xù)取片計數(shù)更準確。目前一般采用一次性切片刀片，刀刃同一位置可切普通組織至少200斷面；平移位置4次，可確保切出800余斷面。單個卵巢連續(xù)切片一般共500～700斷面，不需更換刀片。切片操作參考輪轉式切片機的說明書，技巧和處置可參考相關文獻［5］。

生物組織攤烤片儀的水槽加注蒸餾水，對于熔點54℃～56℃的純蠟，展片水溫恒定為42℃～45℃。蠟片展平即撈起，在水面漂展不超過1 min，防止結構松散。卵巢連續(xù)切片時，將10個斷面的蠟帶裱貼成行，每張載玻片裱貼3行，共30斷面。

載玻片撈片前先經(jīng)防脫劑處理。常規(guī)制片的防脫劑常用明礬明膠［8］，采用涂布或浸沒處理。如切片還需長時間堿性環(huán)境浸泡、加熱，則應換用APES或L-多聚賴氨酸處理［1，4-5］。卵巢切片需在40℃恒溫過夜或60℃烘烤2～4 h方可緊密貼合。

5 HE染色

蘇木素為天然染料混合物，有多種配方［9］。僅做常規(guī)觀察，以Ehrlich配方為首選。其優(yōu)勢是可將細胞質和細胞外基質的嗜堿性成分一并清晰顯示。Ehrlich蘇木素穩(wěn)定，耐存放，染色效能下降緩慢。伊紅通常采用1水溶性伊紅-黃（eosin-Y）的蒸餾水溶液，加2～3滴濃甲醛防止微生物滋生。

HE染色流程如表2所示。最受經(jīng)驗影響的為蘇木素的染色和分色。先過染，再用鹽酸乙醇液分色，這樣顯示結構更精細。卵巢4～6 μm切片一般分色15～30 s（較多數(shù)標本更久），結構區(qū)分最佳。由于染液和分色液反復使用，不同批次和使用次數(shù)對染色、分色效能有影響，故每批次操作應預試。根據(jù)預試結果按統(tǒng)一時間操作，避免質量不一。

表2 HE染色操作流程

HE染色的手工操作有標本缸——提籃染色、試劑瓶——臥式缸染色和立式缸染色3種方式，單次裝片量分別為30～60張、10～19張和5～9張。3種方式分別適用于批量制片、科研和教學。卵巢連續(xù)切片一套16～24張，用提籃染色1次完成或臥式缸染色分兩次完成均可。染色機的裝片量與提籃染色方式相同。

6 顯微觀察和計數(shù)

本文以原始、初級和次級卵泡的計數(shù)為例，如圖1所示。

技術條件:NBF（600 mOsm/L）固定，乙醇-四氫呋喃脫水、石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。Olympus C5060WZ數(shù)碼相機接Olympus BHS生物顯微鏡照相。

放大倍數(shù):圖1（a）～圖1（c）為10×40（高倍）；圖1（d）為10×10（低倍）。

目前國內外大多數(shù)文獻采用等距取片法，計數(shù)切到卵母細胞的卵泡數(shù)量。由于各階段卵泡中卵母細胞尺寸差別顯著，如表3所示，取片間距過小會高估次級卵泡數(shù)量，而間距過大又會低估原始卵泡和早期初級卵泡數(shù)量，如表4所示。因此，分次按不同間距等距取片計數(shù)，方可獲得準確結果。其中，初級卵泡還應區(qū)分單層和多層卵泡細胞兩階段，即圖1（b）和圖1（c）分次計數(shù)。為確保卵母細胞既不重復出現(xiàn)也不遺漏，取片間距應不小于該階段卵母細胞的平均直徑2RO，且不大于RF+2RO（RF為該型卵泡平均直徑；原理如圖2所示）。表3最右列顯示了一只健康16周齡雌性未孕大鼠左側卵巢卵泡計數(shù)的準確結果。

圖1 大鼠原始卵泡和生長卵泡的形態(tài)

表3 不同階段卵泡卵母細胞的直徑比較（各階段n=10）

表4 不同取片間距和取片方式下卵泡計數(shù)結果的比較

圖2中，假設各卵泡和卵母細胞均為規(guī)則球形，半徑相同，卵母細胞居卵泡正中；卵泡之間按最緊密方式堆積。沿圖中自下而上方向取片，S1為剛切到卵母細胞O1的平面，S2為卵母細胞O2最后出現(xiàn)的切面。S1與S2之間的距離為RF+2RO，即為最大取片間距。超過該間距取片，可能遺漏一層（O2所在層次）卵泡。

圖2 卵泡計數(shù)取片間距的理論模型

7 討論

大鼠卵巢標本的制片和觀察計數(shù)有以下5個質量控制環(huán)節(jié)。1）NBF滲透壓為600～940 mOsm/L，不含Cl-離子，液量體積不小于標本的20倍，否則結構易變形。2）保證脫水和石蠟浸透各步的基本時間，每步如能搖勻液體1次更穩(wěn)妥。3）切片厚度4～6 μm，展片水溫與石蠟熔點配合，漂展良好即盡快裱貼，避免切片變形或破壞。4）通過預試確定合理的蘇木素染色、分色條件，染色全程切片不能干燥。5）計數(shù)尺寸差別較大的結構（如卵泡），應根據(jù)該結構不同類型的尺寸分次進行，且取片間距也應參考待檢結構的尺寸確定。

本文方法對其他標本的顯微制片也有普遍適用性，但有的方面需調整。比如組織塊的尺寸，大鼠卵巢較小，不必切開固定。而肝、腎等實質器官則必須切割。因肝具有豐富血管通道，厚度可適當增大。肺則常用經(jīng)氣管灌注固定液的方式固定，經(jīng)70%乙醇脫水后再切開。睪丸尺寸較大本應切開，但因內部張力大易膨出，故有必要采用灌注固定法或換用其他快速固定液［10］。又如NBF的滲透壓，在處理不熟悉的標本時應預試，以標本宏觀不收縮、顯微結構真實為標準。多數(shù)腺體、睪丸等滲透壓要求偏低，在450～600 mOsm/L為宜；腎、卵巢、附睪、精子涂片等，則適合采用600～940 mOsm/L的高滲液。NBF各成分的配比要根據(jù)不同標本進行調整才能獲得上佳的顯微圖像。

四氫呋喃脫水流程為我室近年的改進。該流程具有速度快、質量高的顯著優(yōu)勢［7］。該法處理的標本，可照常進行免疫組織化學、原位雜交等檢測，靈敏度與傳統(tǒng)乙醇、二甲苯流程無差別，我們常規(guī)制片可首選Ehrlich蘇木素。在組織化學實驗中如需復染細胞核，應采用Mayer配方，避免胞核以外的結構著染。

本文未區(qū)分成熟卵泡和次級卵泡。大鼠成熟卵泡階段時間短，典型形態(tài)標志不顯著，易誤判。故表3中次級卵泡和成熟卵泡合并計數(shù)。本文未顯示閉鎖卵泡數(shù)量。閉鎖卵泡數(shù)量通過HE染色觀察會被低估，因為原始卵泡閉鎖后不留痕跡，而其他階段的閉鎖卵泡，僅在卵母細胞凋亡時可辨［11］，此后演化成間質腺，計數(shù)困難。

大鼠卵巢取片間距，根據(jù)切片實測平均值（如表3所示），代入圖2關系式估算。這一關系式雖基于理想化的球體模型，并假設卵母細胞居卵泡正中，但也適于球形細胞（RF和RO視為胞質和胞核的半徑）、梭形結構（橫斷面呈圓形緊密堆積）和胞核偏心位的標本。由于卵母細胞的核與卵泡相比太小，故一般不以胞核為標志來計數(shù)，否則工作量過大。分類計數(shù)法獲得的是卵泡的絕對數(shù)量；大量文獻中按同一間距取片計數(shù)得到的數(shù)據(jù)并非全部無用，在比較同類型卵泡數(shù)量的組間差別時仍具有參考價值。

8 結束語

常規(guī)石蠟切片-HE染色技術對操作經(jīng)驗依賴性較高，已有報道關注該技術的規(guī)范性和質量［2，12-14］。卵巢常規(guī)顯微制片和卵泡觀察計數(shù)是生物顯微技術中一個具有代表性的實驗。通過該實驗，展示了最新的常規(guī)制片流程和技術要點，旨在通過闡明原理，進一步提高技術的規(guī)范性、穩(wěn)定性和實驗結果的準確性。采用規(guī)范化方法有利于科研合作、回顧研究和教學培訓，尤其是當前方興未艾的數(shù)字化切片的發(fā)展［3］，對制片技術提出了更高乘描繪［J］.大學物理實驗，2013，26（2）:82-84.

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Standardized Method of Conventional Microscopic Section Making，Observation and Counting of Ovary

ZHENG Xiang1，BI Wenjie2
（1.Laboratory of Basic Medical Sciences，West China College of Preclinical Medicine and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.Department of Anatomy，Chengdu Medical College，Chengdu 610500，China）

The conventional microscopic section making technique plays an important role in biomedical sciences.The method and procedures for section making，observation and counting should be standardized.The authors show the principles and the standardized method based on the case of counting follicles of different developmental stages in the rat ovary，and introduce the recent technical improvement.Taking a particular experiment as an example，this paper discusses the general principles of operation and methods in order to stabilize and improve the quality of microscopic morphological studies.

conventional microscopic section making；counting；ovary；ovarian follicle；rat

R329-33

A

10.3969/j.issn.1672-4550.2016.05.011

2015-07-19

四川大學實驗技術項目（2015-165）；四川省衛(wèi)生廳科研項目（130294）。

鄭 翔（1981-），男，碩士，實驗師，主要從事組織胚胎學與病理學實驗技術及實驗教學。