益氣活血復(fù)方對動脈粥樣硬化家兔NF-κB基因表達(dá)的影響

柳士博,張　艷，禮　海,朱潔潔

(1.撫順市中醫(yī)院,遼寧 撫順 113008；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,沈陽 110032；3.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，沈陽110101)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

益氣活血復(fù)方對動脈粥樣硬化家兔NF-κB基因表達(dá)的影響

柳士博1,張艷2*，禮海3,朱潔潔1

(1.撫順市中醫(yī)院,遼寧 撫順 113008；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,沈陽 110032；3.沈陽市第二中醫(yī)醫(yī)院，沈陽110101)

目的探討益氣活血復(fù)方對家兔頸總動脈球囊損傷模型CRP水平及NF-κB基因表達(dá)的影響。方法采用頸總動脈球囊損傷聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)家兔的實(shí)驗(yàn)方法。篩選家兔40只，隨機(jī)分為模型組、西藥對照組、治療組、正常組,共4組。各組家兔于8周末，清晨空腹經(jīng)耳中央動脈采血,分離血漿。處死家兔后取頸總動脈組織，測定NF-κB基因表達(dá)。結(jié)果治療組、西藥對照組與模型組比較(P<0.01)，都能降低血漿CRP水平；與治療組比較，西藥對照組CRP水平下降更為明顯。治療組、西藥對照組均能下調(diào)NF-κB基因表達(dá)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與正常組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論益氣活血復(fù)方能夠降低血漿CRP水平，下調(diào)NF-κB基因表達(dá)，具有明顯的拮抗炎癥反應(yīng)的作用，有利于緩解動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

益氣活血復(fù)方；動脈粥樣硬化；NF-κB；CRP

動脈粥樣硬化(AS)導(dǎo)致最常見的器官病變是冠心病[1]。預(yù)防和治療動脈粥樣硬化是降低冠心病病死率，并提高患者預(yù)后及生活質(zhì)量的有效途徑。益氣活血復(fù)方是恩師從醫(yī)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)方，治療冠心病取得滿意臨床療效[2]。本實(shí)驗(yàn)研究采用家兔高脂環(huán)境下的頸動脈內(nèi)皮球囊損傷模型[3]，應(yīng)用益氣活血復(fù)方干預(yù),觀測其對動脈粥樣硬化家兔血漿CRP水平及NF-κB基因表達(dá)的影響[4]。旨在從分子生物學(xué)水平探討益氣活血復(fù)方對在體動物AS的干預(yù)作用。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物選取健康6月齡雄性新西蘭大耳白兔40只，體質(zhì)量(2.48±0.35)kg。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，普通級。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物益氣活血復(fù)方由黃芪、當(dāng)歸、桃仁、紅花等藥物組成。遼寧省中醫(yī)研究院劑型研究室制備，含4.87 g/g生藥。西藥對照藥：辛伐他汀片，10 mg/片(上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：061201)。膽固醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，批號：2040612)。

1.3試劑與儀器RT-PCR試劑盒：大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，批號：Bk2201。DNA-marker DL2000：大連寶生物工程有限公司(TaKaRa)，批號：CB3301。NF-κB、GAPDH內(nèi)參照由寶生物工程(大連)有限公司合成。球囊導(dǎo)管及手推式壓力泵：美國Boston Scientific公司，MAV-MR 20 mmΧ20 mm,CE0197。全自動生化分析儀：日立7600型。低溫高速離心機(jī)：德國，型號HERAEUS BIOFUGE28R。PCR儀：美國PERKIN ELMER，型號PE9600。

2　方法

2.1動物分組及取材動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成2組。6只喂以標(biāo)準(zhǔn)兔飼料的正常對照組，34只喂以高膽固醇飼料的手術(shù)組。手術(shù)組34只新西蘭大耳白兔行頸總動脈球囊損傷術(shù)。4周后，完成頸總動脈球囊損傷術(shù)的動物根據(jù)血脂水平、動物體質(zhì)量等指標(biāo)，隨機(jī)分為模型組、西藥對照藥辛伐他汀組(西藥對照組)、益氣活血復(fù)方組(治療組)。由于在造模過程中死亡4只，所以模型組、西藥對照組、治療組每組各10只。加正常組，共4組。各給藥組在每天清晨只喂食藥物飼料，待吃完后，再加足高膽固醇飼料；模型組喂以高膽固醇飼料；正常組則只供普通飼料飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組家兔每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整每只實(shí)驗(yàn)動物的給藥量，共給藥4周。第8周末，處死所有家兔后，分離頸總動脈損傷血管段，正常組取其頸總動脈相對應(yīng)處，結(jié)扎兩端后剪取放入DEPC處理彈頭管中，-80 ℃保存。

2.2給藥劑量辛伐他汀5 mg/(kg·d)，益氣活血復(fù)方顆粒1 g/(kg·d)。

2.3指標(biāo)測定

2.3.1血漿CRP水平測定各組家兔于8周末，清晨空腹稱重后，經(jīng)耳中央動脈采血4 mL，EDTA抗凝，分離血漿，-80 ℃保存。

2.3.2RT-PCR方法測定血管內(nèi)皮(組織)中NF-κB基因表達(dá)1)血管壁總RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng):取動脈血管0.5 cm,按試劑盒說明操作。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃變性3 min后進(jìn)入循環(huán),94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。2)定量分析：取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，加入6×溴酚蘭上樣緩沖液2 μL后上樣，于配加了溴乙錠的2%的瓊脂糖凝膠上電泳,應(yīng)用Bio-Rad Gel Doc 1 000成像系統(tǒng)采集實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖像，并用凝膠成像分析系統(tǒng)GIS120D對圖像條帶進(jìn)行灰度掃描，以GAPDH為內(nèi)參基準(zhǔn)作半定量分析，測定樣本NF-κB基因的相對表達(dá)量。

3　結(jié)果

3.1各組家兔一般狀況比較正常組家兔一般狀況良好，被毛豐厚細(xì)密，富有光澤，皮膚緊密結(jié)實(shí)，門齒潔白整齊，耳長直立，精神飽滿，日?；顒?、飲水及采食積極，食欲佳。造模后家兔一般狀況欠佳，被毛粗糙無光澤，皮膚厚而松弛，日?；顒恿棵黠@減少，多靜伏，精神不振，食欲欠佳。在給藥的4周后，治療組、西藥對照組的家兔一般狀況明顯改善，精神轉(zhuǎn)佳，活動、采食頻繁。模型組一般狀況無明顯改善。

3.2各組家兔血漿CRP水平比較見表1。

1　各組家兔血漿C反應(yīng)蛋白變化情況±s)

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與治療組比較，▲P<0.05

3.3各組家兔NF-κB基因表達(dá)比較見表2。

表2　各組家兔動脈組織NF-κB mRNA表達(dá)的比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

4　討論

中醫(yī)學(xué)將冠心病[5-10]歸屬于“胸痹”范疇，認(rèn)為其以氣虛為本，血瘀為標(biāo)，具有本虛標(biāo)實(shí)的病理特點(diǎn)。追溯至《素問·陰陽應(yīng)象大論》：“陰盛則陽病”“氣虛宜掣引之”的論述，氣屬陽血屬陰，本著“氣行則血行”“血實(shí)宜決之”扶正祛邪的原則，治以扶陽益氣為主，輔以活血化瘀，以達(dá)氣旺則血充，氣行則血暢，氣血調(diào)和之目的[11]。黃芪、當(dāng)歸、桃仁、紅花是本實(shí)驗(yàn)研究中益氣活血復(fù)方的主要組方藥物，具有顯著的補(bǔ)虛化瘀之功效?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，黃芪總提取物在體外抗血栓形成、增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基能力及降低氧化應(yīng)激反應(yīng)等方面具有顯著作用[12]。當(dāng)歸、川芎兩藥為臨床常見的配伍佳對，二者氣血兼顧，補(bǔ)而不滯，活血行血而性質(zhì)柔潤。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了兩者配伍可明顯增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，降低血管阻力，提高機(jī)體的抗氧化活性[13]。紅花中含有高達(dá)85%的羥基紅花黃色素，能顯著改善冠狀動脈的血流動力學(xué)及凝血機(jī)制，延長APTT[14]，其與桃仁配伍具有極佳的活血化瘀功效。冠心病動脈粥樣硬化的形成即“血瘀證狀態(tài)”，其因炎癥累及所致的內(nèi)皮損傷，心肌能量代謝的關(guān)鍵酶活性異常等因素均對AS的形成起促進(jìn)作用[15]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，益氣活血復(fù)方能夠降低血漿CRP水平，下調(diào)頸總動脈球囊損傷術(shù)后家兔NF-κB基因表達(dá)，NF-κB表達(dá)減少后，由之調(diào)控的有關(guān)炎性因子和生長因子的表達(dá)也會隨之降低，從而達(dá)到明顯的拮抗炎癥反應(yīng)的作用。益氣活血復(fù)方可能是通過一系列復(fù)雜機(jī)制以影響Kappa-B激酶抑制劑的活性，使NF-κB無法通過細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，失去了與DNA結(jié)合的機(jī)會，最終實(shí)現(xiàn)降低NF-κB的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)的目的[16]。由此可見，益氣活血復(fù)方具有明顯的防治動脈粥樣硬化的作用。與西藥相比療效相近，且具有不良反應(yīng)少、毒性低的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)可為益氣活血中藥防治動脈粥樣硬化提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Yiqihuoxue compound on expression of atherosclerosis in rabbits NF-κB gene

LIU Shibo1,ZHANG Yan2*,LI Hai3,ZHU Jiejie1

(1.Fushun Hospital of Traditional Chinese Medicine,Fushun 113008,Liaoning Province,China;2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,China;3.The Second Shenyang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110101,China)

ObjectiveTo observing the effect of the formula of Supplementing Qi and activating blood circulation on the CRP level and the expression of NF- kappa B in the rabbit carotid artery balloon injury model,the effect mechanism of the prescription for supplementing qi and activating blood circulation in the treatment of atherosclerosis was discussed.MethodsCommon carotid artery injury combined with high-fat diet fed rabbits experimentally.Screening of 40 rabbits were randomly divided into model group,western medicine control group,the treatment group,plus the normal control group,a total of four groups of rabbits.Rabbits in each group of 8 weeks,fasting blood by ear central artery,plasma separated.Rabbits were sacrificed after taking carotid artery tissue,measuring gene expression NF-κB.ResultsTreatment group,western medicine group and the model group (P<0.01),can reduce plasma CRP levels;compared with the treatment group and comparison group CRP levels decreased more obvious.NF-κB gene therapy group,comparison group can be reduced,there was no significant difference (P>0.05),no difference (P>0.05) and the normal group.ConclusionYiqihuoxue compound capable of lowering plasma CRP levels,reduced NF-κB gene expression,has obvious antagonistic role of inflammation,and help alleviate the development of atherosclerosis.

Yiqihuoxue compound;atherosclerosis;NF-κB;CRP

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.006

遼寧省科技廳自然科學(xué)基金“益氣活血中藥防治PTCA術(shù)后再狹窄的臨床及實(shí)驗(yàn)研究”(20062073)。

柳士博(1983-)，女，碩士研究生，主治中醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心血管病臨床研究。

張艷，女，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，電話-1388929805，電子信箱-Yanzhang1016@126.com

R285.5

A

2095-6258(2016)05-0895-03

2016-05-24)