基于線粒體COI基因的雷州半島馬尾藻屬常見種DNA條形碼鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

賀　亮，廖　健，全秋梅，梁　忠，謝恩義，劉　麗，劉楚吾

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

基于線粒體COI基因的雷州半島馬尾藻屬常見種DNA條形碼鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

賀亮，廖健，全秋梅，梁忠，謝恩義，劉麗，劉楚吾

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

采用DNA條形碼技術(shù)輔以傳統(tǒng)形態(tài)分類方法，對雷州半島馬尾藻屬（Sargassum）6常見種進(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化分析。測得6種馬尾藻線粒體COI基因序列，該序列與GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫中馬尾藻序列同源性均大于或等于99%，該結(jié)果與形態(tài)分類學(xué)鑒定結(jié)果一致。COI基因序列特征分析表明，6種馬尾藻保守位點(diǎn)421個，變異位點(diǎn)58個，簡約信息位點(diǎn)21個，單一突變位點(diǎn)37個，變異率7.7%，T、C、A、G平均含量分別為39.1%、18.9%、19.1%、22.9%，A+T含量（58.2%）高于C+G含量（41.8%），UUU所編碼的苯丙氨酸（F）使用頻率最高，達(dá)12.5%，最大似然法估算的轉(zhuǎn)換顛換比值為2.42，種間遺傳距離多在0.030±0.013～0.100±0.016之間。聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定、同源性分析結(jié)果一致。

馬尾藻屬；mtDNA-COI基因；物種鑒定；分子系統(tǒng)進(jìn)化；DNA條形碼

馬尾藻屬（Sargassum C.Agardh）隸屬于褐藻門（Phaeophyta）無孢子綱（Phaeophyta）墨角藻目（Fucales）馬尾藻科（Sargassaceae），是熱帶及溫帶沿海常見的大型海藻，主要分布于印度-西太平洋和澳大利亞、加勒比海等沿海海域［1］，多數(shù)種類生活在低潮帶和潮下帶淺水區(qū)的巖石上，是重建海藻床和實(shí)施海洋生境修復(fù)的重要構(gòu)成物種，具有重要的生態(tài)價值。該屬藻類株型較大，種類甚多，曾記錄的種、變種及變型共 878種，目前已證實(shí)有 340種，我國海域有130種［1］。目前，已有基于形態(tài)特征的馬尾藻系統(tǒng)學(xué)研究［2-7］，但分子生物學(xué)角度的相關(guān)研究相對欠缺。近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基于DNA條形碼技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物分類學(xué)、系統(tǒng)學(xué)以及種群遺傳學(xué)等方面研究，分子數(shù)據(jù)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類數(shù)據(jù)使難以界定的物種分類得以較好地解決［8］。每種生物特有的基因序列是進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定的基礎(chǔ)，核基因、質(zhì)體基因、線粒體基因等可能成為分子標(biāo)記的潛在對象。線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA） 作為真核生物的核外遺傳物質(zhì)，具有基因組結(jié)構(gòu)簡單、呈母性遺傳、編碼效率高、進(jìn)化速率快且不發(fā)生重組等特性，應(yīng)用線粒體DNA及其片段的測序分析技術(shù)對馬尾藻進(jìn)行物種鑒定與分類分析將更加客觀、科學(xué)，其中，細(xì)胞色素C氧化酶亞基I （cytochrome c oxidase subunit I，COI） 基因序列是線粒體基因的重要部分，具有進(jìn)化速度較快、易擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，可作為良好的分子標(biāo)記用于種內(nèi)、屬間系統(tǒng)進(jìn)化研究［9］。目前，線粒體COI作為DNA條形碼已廣泛應(yīng)用于動物分類鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化研究［10-12］，而有關(guān)海洋藻類的DNA條形碼研究多集中在硅藻以及紅藻上，但關(guān)于褐藻研究相對比較薄弱，有待進(jìn)一步的發(fā)展，如Saunders［13］于2005年首次利用線粒體COI基因?qū)t藻3個群體的46個樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明，線粒體COI基因可準(zhǔn)確區(qū)分形態(tài)相似的紅藻，并發(fā)現(xiàn)一些新種；Evans等選取COI、18Sr DNA、rbc L、ITSrDNA等4個基因作為DNA條形碼對硅藻屬的34個體進(jìn)行評價研究，認(rèn)為線粒體COI比rbc L和18sr DNA的變異率均較高，ITSr DNA的種內(nèi)變異率太高，且現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中硅藻的ITSr DNA序列信息極少，線粒體COI基因較適于作為硅藻的DNA條形碼進(jìn)行研究［14］；Mattio和Payri在分析馬尾藻屬不同條形碼基因時也暗示了線粒體基因 mtsp（mitochondrial targeting signal peptide）、COI和COIII作為褐藻條形碼基因的可能性［15］。本研究獲取6種馬尾藻線粒體COI部分序列，從分子水平對其進(jìn)行DNA條形碼鑒定，并探討其系統(tǒng)進(jìn)化，為馬尾藻物種鑒定和分子系統(tǒng)學(xué)研究提供分子生物學(xué)依據(jù)，為雷州半島地方性馬尾藻的種質(zhì)資源保護(hù)與可持續(xù)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料采集

馬尾藻樣品于2015年11月至2016年3月采自湛江硇洲島海域、徐聞四塘和海安灣。低溫條件下迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，選擇生長良好藻體，用抽濾海水洗凈藻體表面附著物后，暫養(yǎng)于1 000 mL燒杯內(nèi)，暫養(yǎng)條件為：溫度（20±0.5）℃，鹽度為28，光照周期12L：12D，照度4 000～6 000 lx，翌日提取基因組DNA。

1.2形態(tài)學(xué)分類

［1］對藻樣鑒定至種。

1.3分子生物學(xué)鑒定

1.3.1基因組DNA提取每個樣本剪取幼嫩的葉片組織約100 mg，于研缽中與石英砂、碳酸鈣充分研磨后，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA，提取步驟參照說明書。經(jīng)10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳定性檢測和Nanodrop 2000定量分析后，合格樣品于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2mtDNA-COI 序列PCR擴(kuò)增與測序選取檢測合格的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物參考文獻(xiàn)［16］，正反向序列為：CNCOI-F，5′-TCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3′； CNCOI-R，5′-ACT TCTGGATGTCCAAAAAAVCA-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃下再延伸10min，4℃下保存。反應(yīng)體系采用25μL，含2.5 mmol/L dNTP 2μL、10×Buffer（含Mg2+） 2.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5μmol/L引物各1μL、模板DNA 1μL、500 u/L Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH2O補(bǔ)足體積。擴(kuò)增產(chǎn)物用10 mg/mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.3.3數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)人工校正，利用 Bio-Editor和DNAMAN軟件對所測序列進(jìn)行峰圖人工校正和序列拼接后，與此同時，從GenBank中下載褐藻門9種馬尾藻的線粒體COI基因序列（GenBank序列號及詳細(xì)信息見表1），共16條序列，利用Mega 5.0進(jìn)行多序列比對，并計(jì)算堿基組成及序列變異各項(xiàng)參數(shù)，其中包括保守位點(diǎn)（C）、變異位點(diǎn)（V）、簡約信息位點(diǎn)（Pi）和單一突變位點(diǎn)（S），利用Mega 5.0中Cumpute codon usage Bias程序分析密碼子使用頻率，計(jì)算Kimura 2-parameter遺傳距離；并以鄰位連接（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 置信值重復(fù)抽樣1 000次，以最大似然法（ML） 估算轉(zhuǎn)換顛換比R值。

表1　本研究所涉及線粒體COI基因序列基本信息Table 1　Information about mtDNA-COI gene sequences

2　結(jié)果與分析

2.1形態(tài)學(xué)分類與分子鑒定

藻樣形態(tài)學(xué)特征見表2，依據(jù)文獻(xiàn)［1］鑒定為果葉馬尾藻（Sargassum carpophyllum）、冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）、瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、匍枝馬尾藻（S.polycystum）、全緣馬尾藻（S.integerrimum）。其線粒體COI基因序列經(jīng)人工矯正和剪切后長度為479 bp，與GenBank、BOLD數(shù)據(jù)庫中已有數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，與其同源性最高的分別是果葉馬尾藻、冬青葉馬尾藻、半葉馬尾藻中國變種、瓦氏馬尾藻、匍枝馬尾藻以及全緣馬尾藻，相似度均大于或等于99%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

2.2線粒體COI基因片段序列特征分析

多序列比對結(jié)果表明，6種馬尾藻線粒體COI基因序列保守位點(diǎn)421個，變異位點(diǎn)58個，簡約信息位點(diǎn)21個，單一突變位點(diǎn)37個，變異率7.7%。堿基組成分析揭示，T、C、A和G的平均含量分別為39.1%、18.9%、19.1%、22.9%，其中A+T含量（58.2%）明顯高于C+G（41.8%）。堿基在密碼子的第1、2、3位分布不均勻，具有明顯偏倚性，其中堿基C偏向于密碼子第1位（28.1%），其在第2、3位的含量顯著降低，分別為9.8%和18.8%。密碼子使用偏向性結(jié)果表明，UUU所編碼的苯丙氨酸（F）使用頻率最高，達(dá)12.5%。479 bp線粒體COI基因部分序列共編碼159個氨基酸，且無插入、缺失及終止密碼子。估算的轉(zhuǎn)換顛換R比值為2.42，表明序列中轉(zhuǎn)換明顯多于顛換。

2.3遺傳距離

11種馬尾藻Kimura雙參數(shù)進(jìn)化模型的種間平均遺傳距離見表3。結(jié)果顯示，藻樣S001、張氏馬尾藻（S.zhangii）與銅藻（S.horneri）種間平均遺傳距離最大，均為 0.112±0.016，表明三者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而樣品S002和樣品S006種間平均遺傳距離最?。?.002±0.002），表明兩者親緣關(guān)系最近，多數(shù)種間平均遺傳距離在 0.030±0.013～0.100± 0.016之間。可見，11種馬尾藻種間遺傳距離較小，這與11種馬尾藻同屬馬尾藻屬存在一定聯(lián)系。

表2　6種馬尾藻主要部位形態(tài)特征描述Table 2　Morphological description of the main parts of 6 species of Sargassum

表3　基于線粒體COI基因序列11種馬尾藻的16條序列種間遺傳距離Table 3　Interspecific genetic distance based on 16 sequences of mtDNA-COI gene from 11 species of Sargassum

2.4聚類分析

采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），以海帶目海帶科的海帶（Saccharina japonica，AB775228.2）為外群，構(gòu)建11種馬尾藻的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖1）。由圖1可見，馬尾藻屬的11個物種與外群分開，其中，藻樣S004、S001、S003與GenBank數(shù)據(jù)庫下載瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）分別以高達(dá)99%、100%、100%置信值在發(fā)生樹上各聚為一支，表明藻樣S004、S001、S003與GenBank數(shù)據(jù)庫下載數(shù)據(jù)為同種，與形態(tài)學(xué)、同源性分析結(jié)果保持一致，證實(shí)此三藻樣分別為瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense），而藻樣 S006與GenBank數(shù)據(jù)庫下載全緣馬尾藻（S.integerrimum）聚為一小支，且與冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）聚為一大枝，表明三者親緣關(guān)系較近，藻樣 S005在發(fā)生樹上單獨(dú)聚為一支，與其他藻類相對較遠(yuǎn)。

圖1　11種馬尾藻線粒體COI基因片段聚類分析Fig.1　Phylogenetic analysis of mtDNA-COI gene fragments of 11 species of Sargassum

3　討　論

長期以來，復(fù)雜多樣的海洋藻類分類問題一直都是困擾國內(nèi)外藻類學(xué)家的一項(xiàng)重大難題，而其復(fù)雜的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系也成為學(xué)者們常關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，對于馬尾藻分類鑒定主要依據(jù)藻體顏色、固著器、主干、初次生分枝、藻葉、氣囊和生殖托的形態(tài)以及毛窩是否存在等形態(tài)學(xué)特征，但這些性狀受外界環(huán)境、物種性別以及發(fā)育階段等因素影響變化較大，僅依靠形態(tài)特征對某些外觀較為相似的馬尾藻，很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，因此在進(jìn)行藻類分類鑒定時利用DNA條形碼技術(shù)輔助研究顯得尤為重要［17-18］。線粒體COI基因是線粒體內(nèi)13種氨基酸編碼基因之一，在種間變異適宜，可提供比較豐富的變異位點(diǎn)，已漸漸被應(yīng)用于馬尾藻屬等樣品的物種鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化等研究［19-21］。本研究通過對馬尾藻樣品線粒體 COI基因中 479 bp片段并結(jié)合GenBank和BOLD數(shù)據(jù)庫中已有數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分析，利用 Kimura雙參數(shù)進(jìn)化模型的種間平均遺傳距離，并以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，鑒定出所獲取馬尾藻樣品分別為果葉馬尾藻（S.carpophyllum）、冬青葉馬尾藻（S.ilicifolium）、半葉馬尾藻中國變種（S.hemiphyllum var chinense）、瓦氏馬尾藻（S.vachellianum）、匍枝馬尾藻（S.polycystum）以及全緣馬尾藻（S.integerrimum），與形態(tài)結(jié)果一致。說明線粒體 COI基因用于馬尾藻物種鑒定具有較高的可行性與高效性，通過傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與DNA條形碼技術(shù)相結(jié)合，可較好實(shí)現(xiàn)對馬尾藻樣本的準(zhǔn)確鑒定。

經(jīng)過十幾年的發(fā)展，海藻分子系統(tǒng)學(xué)研究已建立了基本方法，在分類、系統(tǒng)進(jìn)化和生物地理學(xué)研究方面取得了一定的研究成果。但是到目前為止，多數(shù)工作仍限于積累信息、利用孤立的分子證據(jù)構(gòu)建局部的分子系統(tǒng)樹，分子方法在藻類方面尚無統(tǒng)一的研究標(biāo)準(zhǔn)，而整體的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究仍然很模糊，僅是對一些物種的傳統(tǒng)分類地位提出質(zhì)疑和分類修訂建議，此外，NCBI數(shù)據(jù)庫里藻類的基因序列并不全面，缺乏很多藻類的基因數(shù)據(jù)，準(zhǔn)確完整的基因序列還有待補(bǔ)充［23］。因此，藻類物種鑒定目前仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主，相信隨著對馬尾藻分子標(biāo)記研究的深入以及分子數(shù)據(jù)的補(bǔ)充與完善，將有助于促進(jìn)馬尾藻DNA條形碼的建立，進(jìn)而使物種繁多、形態(tài)多變的馬尾藻物種鑒定和種間系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究更加科學(xué)。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

DNA Barcoding and Phylogenetic Analysis of Common Species of Sargassum from Leizhou Peninsula Based on mtDNA-COI Gene Sequences

HE Liang，LIAO Jian，QUAN Qiu-mei，LIANG Zhong，XIE En-yi，LIU Li，LIU Chu-wu
（Key Laboratory of Aquaculture in South China Sea for Aquatic Economic Animal of Guangdong Higher Education Institutes，F(xiàn)isheries College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524025，China）

Species identification and phylogenetic relationship in 6 common species of Sargassum collected from Leizhou Peninsula were analyzed by appling DNA barcoding technology assisted traditional morphological classification method.Mt-DNA COI gene sequences of 6 species of Sargassum and existing data in GenBank and BOLD database for homology analysis showed that the similarity is 99% or more，the molecular data were consistent with the morphological identification results.In addition，the analyses on characteristics of COI gene sequence shows that COI gene sequence in 6 species Sargassum including 421 conserved sites，58 variable sites，21 Parsim-Informative sites，and 37 Singleton sites，accounted for 7.7%.Nucleartides composition results showed：T，C，A，G average contents were 39.1%，18.9%，19.1%，22.9%，respectively，and A+T content （58.2%） was significantly higher than C+G content （41.8%）.The highest frequency of amino acid was Phenylalanine（F） which coded by UUU（12.5%）.The rate of transition and transversion based on maximum likelihoodwas 2.42.Interspecific genetic distances were from 0.001 ± 0.001 to 0.113 ± 0.016.The result of cluster analysis was consistent with that of morphological identification and homology analysis.

Sargassum； mtDNA-COI； species identification； molecular phylogenetic； DNA barcoding

Q78；Q949

A

1673-9159（2016）04-0017-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.004

2016-06-07

2016年度廣東大學(xué)生科技創(chuàng)新培育專項(xiàng)資金立項(xiàng)項(xiàng)目（pdjh2016b0236）；中央分成海域使用金支出項(xiàng)目（2011-2-2-09-3）；廣東省海洋漁業(yè)科技推廣專項(xiàng)（A201308E02）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B020307006）

賀亮（1990－），男，碩士研究生，從事海洋生境修復(fù)與生物資源保護(hù)研究。E-mail：gdhydxhl1990@foxmail.com

劉麗（1974－），女，教授，主要從事海洋生物保護(hù)及遺傳多樣性研究。E-mail：zjouliuli@163.com