液體發(fā)酵竹紅菌素的提取與表征

邵 穎，陳安徽,*，陳小潔，張傳麗，胡 飛

液體發(fā)酵竹紅菌素的提取與表征

邵 穎1,2，陳安徽1,2,*，陳小潔1，張傳麗1,2，胡 飛3

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221008；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點實驗室，江蘇 徐州 221008；3.安徽省微生物防治重點實驗室，安徽 合肥 230036）

利用竹黃無性型菌株ZH-5-1進行液體深層發(fā)酵制備竹紅菌素，利用正交試驗設計優(yōu)化了提取工藝，并使用萃取及硅膠柱色譜技術進行了分離純化。結果表明，以丙酮為提取溶劑、料液比為1∶30（m/V）、于30 ℃溫度條件下超聲浸提30 min時，菌株ZH-5-1液體深層發(fā)酵菌絲體中竹紅菌素的提取率最高達4.83 mg/g；竹紅菌素提取液經(jīng)萃取分離獲得紫紅色結晶，該晶體經(jīng)過薄層層析法及高效液相色譜法分析確定為純品，質譜分析后發(fā)現(xiàn)其分子式為C30H26O10，確定為竹紅菌甲素，經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)其純度達到98.20%。

液體發(fā)酵；竹紅菌素；提??；分離；純化

竹紅菌素屬苝醌類色素，是藥用真菌竹黃菌、竹小肉座菌重要的有效活性成分，也是竹黃子座的紅色色素成分，是多種苝醌類衍生物的混合物，包括竹紅菌甲素、乙素、丙素、丁素[1]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，竹紅菌素對多種皮膚病具有良好的光敏治療效果[2-4]，因此其作為皮膚病外用藥物在臨床上得到了廣泛應用；隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)了竹紅菌素抗炎、鎮(zhèn)痛及優(yōu)良的光敏抗腫瘤、抗病毒等多種生物學活性[5-6]；進一步研究發(fā)現(xiàn)，竹紅菌素對多種惡性腫瘤細胞以及人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）等也具有很好的光敏抑制效果。光動力療法（potodynamic therapy）是一種正在研究開發(fā)的腫瘤新療法，而竹紅菌素顯著的光敏抗腫瘤活性使其極有可能成為新一代抗腫瘤光療藥物而服務于人類健康[7-8]。目前對竹紅菌素抗腫瘤活性的研究已見多篇文獻報道[9-17]。

目前，研究者們對于竹紅菌素的相關生物學活性已進行了系統(tǒng)研究。竹紅菌素主要來源于竹黃子座，但由于自然竹黃資源的有限性，許多學者將目光投向了竹黃無性型菌株的發(fā)酵菌絲體。梁曉輝等[18]對竹黃子座和竹黃液體發(fā)酵菌絲體中的成分進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)竹紅菌素在兩種原料中的含量接近，竹黃液體發(fā)酵菌絲體可以代替竹黃子座成為竹紅菌素來源。杜文[19]、楊珠英[20]等利用現(xiàn)代生物技術手段提高了竹黃無性型菌株液體發(fā)酵菌絲體中竹紅菌素的含量；胡飛[21]、韓錢松[22]、呂騰飛[23]等通過優(yōu)化竹黃無性型菌株的人工發(fā)酵工藝提高了發(fā)酵菌絲體中竹紅菌素的含量，研究結果發(fā)現(xiàn)菌絲體中竹紅菌素含量有一定提高；呂騰飛等[24]研究了竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產竹紅菌素過程中，培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對色素產量的影響。結果表明，在最佳的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化后竹紅菌素產量達1.66%。目前，竹黃無性型菌株菌絲體中竹紅菌素的高產工藝得到了系統(tǒng)研究，對竹紅菌素的研究尚有多篇文獻報道，但未見對竹黃無性型液體發(fā)酵，并對竹紅菌素提取和純化的系統(tǒng)綜合研究報道。本實驗通過對竹黃無性型菌株進行液體發(fā)酵，并對獲得的發(fā)酵菌絲體中的竹紅菌素進行提取及分離純化的工藝進行研究，以期為竹紅菌素的提取及開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

菌株來源：竹黃無性型菌株ZH-5-1分離自安徽宣城地區(qū)的竹黃（Shiraia bambusicola Henn.）子實體，保存于安徽省微生物防治重點實驗室。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸出粉10 g/L、瓊脂20 g/L，蒸餾水定容。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、蛋白胨5 g/L、NaNO310 g/L、KCl 1.5 g/L、MgSO41.5 g/L、KH2PO42 g/L，pH 6.0。

1.2 試劑與儀器

丙酮（分析純） 天津市福晨化學試劑廠；甲醇（分析純） 徐州星光化工廠；甲醇（色譜純） 江蘇恒安試劑公司；柱層析硅膠 中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司；GF254高效薄層硅膠板 青島海洋化工廠。

SGQ-100發(fā)酵設備 常州市三高生物技術工程設備有限公司；冷凍干燥系統(tǒng)（批號040520111G） 美國Labconco公司；SENCO R-502B旋轉蒸發(fā)器 上海申勝生物技術公司；高效液相色譜儀 美國Agilent公司；分析柱Synergi Hydro-RP18（4.6 mm×250 mm，4 μm）美國Waters公司；LRH-250-G光照培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；Spectra Max M2全波長掃描酶標儀 美國Molecular Device公司。

1.3 方法

1.3.1 竹紅菌素含量的測定

參照胡飛等[21]的方法進行。

1.3.2 竹黃無性型菌株的發(fā)酵及菌絲體的獲得

參照邵穎等[25]的方法進行。

1.3.3 發(fā)酵菌絲體中竹紅菌素的提取

1.3.3.1 提取劑的選擇

準確稱取0.05 g菌絲凍干粉11 份，各分別加入甲醇、無水乙醇、丁醇、正丁醇、丙酮、正己烷、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷和水各1 mL，室溫（28 ℃）條件下超聲浸提40 min后于10 000 r/min離心5 min去除沉淀，采用全波長掃描酶標儀于465 nm波長處測定竹紅菌素含量。

1.3.3.2 提取溫度的確定

準確稱取0.05 g菌絲凍干粉6 份，各加入1 mL丙酮，分別于4、10、20、30、40 ℃和50 ℃條件下超聲浸提40 min后于10 000 r/min離心5 min去除沉淀，采用全波長掃描酶標儀于465 nm波長處測定竹紅菌素含量。

1.3.3.3 提取時間的確定

準確稱取0.05 g菌絲凍干粉7 份，各加入1 mL 丙酮，于40 ℃條件下，分別超聲浸提10、20、30、40、50、60、70、80 min后離心去除沉淀，采用全波長掃描酶標儀于465 nm波長處測定竹紅菌素含量。

1.3.3.4 料液比的確定

準確稱取等量菌絲凍干粉6 份，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（m/V）加入丙酮，于40 ℃條件下超聲浸提60 min后離心去除沉淀，采用全波長掃描酶標儀于465 nm波長處測定竹紅菌素含量。

1.3.3.5 正交試驗優(yōu)化提取條件

在各單因素提取條件的基礎上，深入探討各成分參數(shù)交互影響，選取破壁方法、提取溫度、提取時間、料液比4 個因素，設計了四因素三水平正交試驗。

1.3.4 竹紅菌素的分離

1.3.4.1 竹紅菌素提取物的萃取

竹紅菌素粗提物經(jīng)減壓濃縮干燥后，用氯仿溶解，再用氯仿-水（2∶1，V/V）的溶劑進行反復萃取獲得竹紅菌素粗提物，將提取物、粗提物及竹紅菌素標準品在相同條件下進行薄層層析，觀察萃取效果。

1.3.4.2 竹紅菌素粗提物的硅膠柱色譜分離

將萃取后的竹紅菌素粗提物濃縮至干，得到深棕色浸膏100 mg，與硅膠（H60）拌樣上柱（H＝30 cm、R＝5 cm），硅膠柱床采用濕法裝柱。采用二氯甲烷-甲醇洗脫系統(tǒng)進行梯度洗脫，每個梯度的洗脫體積約為400 mL，僅收集紅色洗脫液，約每50 mL洗脫液收集一瓶，共收集紅色洗脫液8 瓶。將收集到的洗脫液濃縮揮發(fā)有機溶劑后進行薄層層析，用氯仿-甲醇-水（35∶2∶1，V/V）的溶劑展開，并于365 nm波長處觀察熒光猝滅點，將含有相似成分的洗脫液合并收集，并對其進行編號。濃縮后重復上述步驟重新上柱進行硅膠柱色譜分離，經(jīng)3 次硅膠柱分離后，洗脫液35 ℃減壓濃縮至5 mL置于試管中長時間靜置，試管壁上有紫紅色結晶貼壁析出。收集紫紅色結晶物進行純度及結構檢測。

1.3.5 純度鑒定

1.3.5.1 薄層層析鑒定

將經(jīng)過提取分離后得到的紫紅色結晶溶于適量丙酮，點樣于薄層層析板，分別于3 種不同的展開劑（三氯甲烷-甲醇（70∶1，V/V）、二氯甲烷-甲醇（9∶1，V/V）、三氯甲烷-甲醇-水（35∶2∶1，V/V））中展開，于可見光下觀察展開斑點，并于365 nm波長處觀察熒光猝滅點，以鑒定物質的純度。

1.3.5.2 高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）鑒定

將分離到的紫紅色結晶溶于適當溶劑中進行HPLC分析，并在相同色譜條件下進樣竹紅菌素標準品，根據(jù)色譜峰鑒定物質的純度。色譜條件為：標準品進樣量為10 μL，樣品進樣量為20 μL；分析檢測色譜柱為分析型（3.9 mm×150 mm，5 μm），Atlantis柱；流動相：甲醇-雙蒸水（65∶35，V/V）；檢測波長為300 nm；流速為0.5～1.0 mL/min。

1.3.6 純化合物的質譜分析

取1 mg樣品溶于1 mL色譜純甲醇中，分別采用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）離子化法測試質譜圖，確定分子質量及主要碎片的質荷比；HPLC條件：流動相為甲醇，進行梯度洗脫；MS條件：陽離子模式：毛細管電壓為4 000 V，加熱氣的溫度為300 ℃，氣體流速為10 L/min，噴嘴壓力為30 psi；二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）條件：全波長掃描。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用DPS7.05版軟件對實驗結果進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示。

2 結果與分析

2.1 竹紅菌素的提取

2.1.1 提取劑的選擇

圖1 不同提取劑對竹紅菌素含量的影響Fig.1 Effect of extraction solvent type on the yield of hypocrellin

由圖1可知，竹紅菌素在丙酮和正丁醇作提取劑時，提取的竹紅菌素含量最高，分別高達3.680 mg/g和3.593 mg/g。但考慮到正丁醇沸點較高，會給后續(xù)竹紅菌素的制備工作帶來困難，故選擇丙酮作為最佳提取劑。

2.1.2 提取溫度的選擇

圖2 不同提取溫度對竹紅菌素含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of hypocrellin

由圖2可知，隨著提取溫度的升高，提取液中竹紅菌素的含量隨之增加，但當溫度達到40 ℃以后基本不再發(fā)生變化?？紤]到竹紅菌素提取液丙酮的沸點較低，故初步選擇提取溫度為40 ℃。

2.1.3 提取時間的確定

以丙酮為提取溶劑，在40 ℃溫度條件下考察了提取時間對竹紅菌素提取效果的影響，結果如圖3所示。提取液中竹紅菌素的含量隨著提取時間的延長而增加，但在60 min以后含量基本不再增加，甚至出現(xiàn)降低的趨勢，因此確定提取時間為60 min。

圖3 不同提取時間對竹紅菌素含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of hypocrellin

2.1.4 料液比的確定

圖4 不同提取料液比對竹紅菌素含量的影響Fig.4 Effect of solid to solvent ratio on the yield of hypocrellin

由圖4可知，當料液比達到1∶20時，竹紅菌素的提取效果顯著，故最佳料液比選擇為1∶20。

2.1.5 最佳提取工藝的正交試驗結果

在單因素提取條件篩選的基礎上，為了綜合考察各因素間的交互影響，以竹紅菌素含量為指標，以破壁方法、提取溫度、提取時間、料液比等為因素進行正交試驗，結果見表1。

表1 以竹紅菌素產量為指標的正交試驗方案及結果Table 1 Orthogonal array design with experimental results for hypocrellin production

由表1可知，A因素的極差最大，其次是D、C、B。故各因素對竹紅菌素提取效果的影響主次順序為A＞D＞C＞B。為了進一步考察各因子對指標的影響，進行了隨機區(qū)組模型方差分析，方差分析結果見表2。

表2 竹紅菌素含量方差分析結果Table 2 Analysis of variance for hypocrellin production

由表2可知，4 個因素在95%的置信度下對竹紅菌素的提取效果均產生顯著影響。因此，竹黃無性型菌株菌絲中竹紅菌素最佳提取條件為A3B1C2D2，即選擇超聲波破壁方式、提取溫度30 ℃、提取時間30 min、料液比1∶30，在此最佳條件下，菌絲體中竹紅菌素提取率達到4.83 mg/g。

2.2 竹紅菌素的分離

2.2.1 竹紅菌素提取物的萃取

菌絲體經(jīng)丙酮提取后獲得竹紅菌素提取物，提取物中含有的大量水溶性雜質將會影響竹紅菌素的分離效果。鑒于竹紅菌素為脂溶性苝醌類物質，故選擇氯仿-水（2∶1）的溶劑對提取物進行反復萃取。提取物經(jīng)萃取后的樣品作為竹紅菌素粗提物進行硅膠柱色譜分離。將竹紅菌素提取物和竹紅菌素粗提物在展開劑（氯仿-甲醇-水（35∶2∶1，V/V））中展開，并在可見光及365 nm波長處觀察樣品的展開斑點，薄層層析圖譜如圖5所示。

圖5 竹紅菌素粗樣在可見光（a）和365 nm波長處（b）的薄層層析Fig.5 Thin layer chromatograph of the crude hypocrellin sample

由圖5可知，竹紅菌素提取物在萃取后進行薄層展開顯現(xiàn)的斑點數(shù)量明顯少于萃取前，且萃取后的樣品展開后主要斑點的Rf值與竹紅菌素標準品的Rf值基本保持一致，說明通過反復萃取可以有效去除竹紅菌素提取物中的雜質。

2.2.2 竹紅菌素粗提物的硅膠柱層析分離

薄層層析分析檢測發(fā)現(xiàn)1#和2#瓶洗脫液展開后在365 nm處無熒光斑點；3#～8#瓶收集到的洗脫液點樣展開后在365 nm處有磚紅色熒光出現(xiàn)，熒光斑點Rf值為0.52，與竹紅菌素標準品的Rf值相當。將3#～8#瓶洗脫液合并濃縮后靜置，瓶壁上出現(xiàn)紫紅色結晶。再連續(xù)進行3 次硅膠柱層析，收集貼壁紫紅色結晶。根據(jù)薄層展開結果及樣品遷移率初步判斷紅色結晶為竹紅菌素。

2.3 純度鑒定

2.3.1 薄層層析鑒定

薄層層析圖譜如圖6所示，經(jīng)過硅膠柱層析分離得到的紫紅色結晶物質在3 種不同展開劑中展開，在365 nm波長處觀察只有單一斑點，而且可見光下也僅呈現(xiàn)一個斑點，初步判斷該紫紅色結晶為純化合物。

圖6 紫紅色結晶物的薄層層析圖譜Fig.6 TLC assay of purple-red crystals

2.3.2 HPLC鑒定

將竹紅菌素標準品和分離到的紫紅色結晶物質分別用適量甲醇溶解后配制成0.2 mg/mL的溶液進行反相HPLC分析。標準品進樣量為10 μL，樣品進樣量為20 μL；分析檢測HPLC色譜圖如圖7所示。圖7A中，竹紅菌素標準品的HPLC圖譜中出現(xiàn)2 個吸收峰，前峰為竹紅菌甲素，后峰為竹紅菌乙素。由圖7B中的HPLC分析圖譜可以看出，紫紅色結晶物質進樣后也得到2 個強吸收峰，且兩個峰的出峰保留時間基本與竹紅菌素標準品相似，無其他吸收峰出現(xiàn)，說明經(jīng)硅膠柱色譜分離得到的紫紅色結晶為竹紅菌素，且該物質為純化合物。

圖7 竹紅菌素標準品（A）和紫紅色結晶（B）的HPLC圖譜Fig.7 HPLC of hypocrellin (A) and purple-red crystal (B)

2.4 質譜分析

為了進一步驗證分離得到的紫紅色結晶物質，將紫紅色結晶溶于適量甲醇后按照1.3.6節(jié)的方法進行質譜分析，分析圖譜如圖8所示。從MS陰離子圖中可看到只有一個峰，雜質峰信號很弱；離子圖的后段有一不規(guī)則峰，從分析經(jīng)驗，該不規(guī)則峰應為溶劑雜質，而不是樣品中的雜質。從液相色譜來看，在全波長掃描的條件下，僅有一個主峰，同時樣品中只有一個在465 nm波長處有明顯吸收峰的化合物，因此可確定該化合物是一純品。從MS陰離子圖譜中化合物陰離子m/z為545.145 3，得出對應的分子式是C30H25O10，由于其對應的峰是M—H峰，所以該化合物的準確分子式為C30H26O10，與竹紅菌甲素的分子式完全一致。通過液相色譜峰面積計算，可知竹紅甲素的純度為98.20%。

圖8 樣品的HPLC-MS陰離子質譜圖Fig.8 HPLC chromatogram and negative ion mass spectra of purple red crystal

3 討 論

竹紅菌素較好的光敏抗癌活性、抗炎、鎮(zhèn)痛等活性已得到了廣泛認可，竹紅菌素作為一種新型、高效的光敏劑也得到了國內外學者的廣泛關注。在竹黃自然資源日益緊缺的條件下，篩選竹黃無性型菌株并從其發(fā)酵產物中規(guī)?；崛≈窦t菌素應用于食品、保健品、藥品開發(fā)等領域具有重要的現(xiàn)實意義。但是，目前竹黃無性型菌株發(fā)酵產物中關于竹紅菌素提取工藝的系統(tǒng)研究報道還甚少，極大限制了竹紅菌素資源的開發(fā)與應用。本研究對一株竹黃無性型菌株進行液體發(fā)酵，利用獲得的發(fā)酵菌絲體進行了竹紅菌素的提取工藝研究，并對獲得的竹紅菌素粗提物進行了分離純化。

在本實驗條件下按照料液比為1∶30（m/V）的比例加入提取劑丙酮、于30 ℃溫度條件下超聲浸提30 min，竹黃無性型菌株ZH-5-1液體深層發(fā)酵菌絲體中竹紅菌素的提取率最高。提取液經(jīng)氯仿-水（2∶1）的溶劑反復萃取后可有效去除雜質成分。除雜后的竹紅菌素粗提物經(jīng)簡單的硅膠柱色譜分離并收集紅色洗脫液即可得到高純度的竹紅菌素樣品，經(jīng)質譜分析后發(fā)現(xiàn)分離得到的物質為竹紅菌甲素。本研究為竹紅菌素的提取和竹紅菌甲素的純化提供了參考。

[1] 黃小波. 藥用真菌竹黃的液體發(fā)酵工藝優(yōu)化及竹紅菌素的提取研究[D]. 杭州: 浙江農林大學, 2010.

[2] 梁曉輝, 蔡宇杰, 廖祥儒, 等. 藥用真菌竹黃的研究進展[J].食品與生物技術學報, 2008, 27(5): 21-26. DOI:10.3321/ j.issn:1673-1689.2008.05.004.

[3] YANG H L, HUANG F R. Quantum chemical and statistical study of hypocrellin dyes with phototoxicity against tumor cells[J]. Dyes and Pigments, 2007, 74: 416-423. DOI:10.1016/j.dyepig.2006.03.002.

[4] 肖彩霞, 劉同軍, 楊海龍. 竹紅菌素及其衍生物抗腫瘤活性的研究進展[J]. 食品與藥品, 2008, 10(7): 55-58. DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2008.04.017.

[5] HUDSON J B, ZHOU J, CHEN J, et al. Hypocrellin form Hypcrella bambusae is phototoxic to human immunodeficiency virus[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 1994, 60: 253-255.

[6] ALI S M, CHEE S K, YUEN G Y, et al. Hypericin and hypocrellin induced apoptosis in human mucosal carcinoma cells[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2001, 65: 59-73.

[7] 曾佳, 高志, 李倩, 等. 竹紅菌素光動力抗腫瘤治療的研究進展[J]. 激光雜志, 2012, 33(3): 44-45. DOI:10.3969/ j.issn.0253-2743.2012.03.024.

[8] 劉子文, 趙玉沛, 廖泉, 等. 2-丁胺-2-去甲氧基竹紅菌乙素光動力作用誘導Capan-1細胞凋亡與線粒體損傷的關系[J]. 中華外科雜志, 2006, 44(1): 36-39. DOI:10.3760/j:issn:0529-5815.2006.01.012.

[9] 博乃武, 黃磊, 全蘭萍, 等. 竹紅菌甲素對小鼠紅細胞膜的光氧化作用[J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 1990, 4(1): 75-76.

[10] MARX J L. Oxygen free radical linked to many disease[J]. Science, 1987, 235: 529-533.

[11] 傅乃武, 褚衍行, 黃磊, 等. 竹紅菌甲素對腫瘤細胞光動力作用和體內代謝的研究[J]. 癌癥, 1989, 8(6): 450-451; 478.

[12] 張力, 賈弘提, 董滄玉. 竹紅菌甲素敏化S-180腫瘤細胞膜的光氧化反應及機理探討[J]. 中國醫(yī)學科學院學報, 1993(2): 93-95.

[13] 王景祥, 何祖澤, 朱麗青, 等. 竹紅菌乙素對小鼠肝癌H-22的抑制作用[J]. 中國藥理學通報, 1997, 13(2): 187-188.

[14] LIPSON R L. The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection[J]. Journal of the National Cancer Insititute, 1961, 26: 1-11.

[15] 曹恩華, 程龍生. 竹紅菌甲素光敏作用所致死的Hela細胞DNA單鏈斷裂重接的研究[J]. 實驗生物學報, 1988, 21(1): 79-85.

[16] 許娜飛, 王景福, 曹麗華, 等. Hela細胞對竹紅菌甲素攝取的直接觀察與動態(tài)過程分析[J]. 生物物理學報, 1995, 11(2): 261-266.

[17] 馬嵐. 獼猴胚胎干細胞的分離、鑒定、培養(yǎng)及應用研究[D]. 昆明:中國科學院昆明動物研究所, 2000: 109-127.

[18] 梁曉輝, 蔡宇杰, 廖祥儒, 等. 竹黃發(fā)酵菌絲與竹黃子座成分比較分析[J]. 食品與生物技術學報, 2009, 28(5): 705-708. DOI:10.3321/ j.issn:1673-1689.2009.05.024.

[19] 杜文, 田維毅, 王平, 等. 微生物激發(fā)子對竹黃產竹紅菌素的影響[J]. 食用菌學報, 2014, 21(4): 23-26. DOI:10.3969/ j.issn.1005-9873.2014.04.007.

[20] 楊珠英, 潘魏松, 聶云, 等. 甲基磺酸乙酯誘變選育竹紅菌甲素高產菌株[J]. 生物加工過程, 2014, 12(2): 24-27. DOI:10.3969/ j.issn.1672-3678.2014.02.005.

[21] 胡飛, 李瑞雪, 李春如, 等. 一株竹黃無性型菌株液態(tài)發(fā)酵產竹紅菌素的初步研究[J]. 生物學雜志, 2008, 25(2): 44-47. DOI:10.3969/ j.issn.2095-1736.2008.02.012.

[22] 韓錢松. 竹黃菌SUPER-H168液態(tài)發(fā)酵產竹紅菌素的優(yōu)化[D]. 無錫:江南大學, 2013.

[23] 呂騰飛. 竹黃菌固體發(fā)酵產竹紅菌素的優(yōu)化和放大[D]. 無錫: 江南大學, 2014.

[24] 呂騰飛, 丁彥蕊, 廖祥儒, 等. 竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產竹紅菌素條件的優(yōu)化[J]. 食品與生物技術學報, 2013, 32(8): 832-837. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1689.2013.08.009.

[25] 邵穎, 陳安徽, 賀菊萍, 等. 液體發(fā)酵竹紅菌素的穩(wěn)定性及抗腫瘤活性[J]. 食品科學, 2011, 32(23): 96-100.

Extraction, Purification and Characterization of Hypocrellin from Liquid-Cultured Mycelia of Shiraia bambusicola

SHAO Ying1,2, CHEN Anhui1,2,*, CHEN Xiaojie1, ZHANG Chuanli1,2, HU Fei3
(1. College of Food (Biological) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China; 2. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Food Resource Development and Quality Safety, Xuzhou 221008, China; 3. Anhui Provincial Key Laboratory of Microbial Pest Control, Hefei 230036, China)

The extraction of hypocerllin from submerged-cultured mycelia of an anamorphic strain ZH-5-1 isolated from the fruiting body of Shiraia bambusicola was optimized by orthogonal array design, and the purification was investigated using several solvent extraction cycles and silica gel column chromatography. The maximum yield of hypocerllin of 4.83 mg/ g was obtained after 30 min of ultrasonic-assisted extraction at 30 ℃ using acetone as the extraction solvent with a solid to solvent ratio of 1:30 (m/V). Purple-red crystals were obtained after subsequent successive extraction, which were determined to be pure by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). After HPLC-MS analysis, the molecular formula of the pure purple-red compound was C30H26O10and it was determined as hypocerllin A with a purity up to 98.20%.

liquid-state fermentation; hypocrellin; extraction; isolation; purification

10.7506/spkx1002-6630-201601025

Q939.9

A

1002-6630（2016）01-0139-06

邵穎, 陳安徽, 陳小潔, 等. 液體發(fā)酵竹紅菌素的提取與表征[J]. 食品科學, 2016, 37(1): 139-144. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601025. http://www.spkx.net.cn

SHAO Ying, CHEN Anhui, CHEN Xiaojie, et al. Extraction, purification and characterization of hypocrellin from liquid-cultured mycelia of Shiraia bambusicola[J]. Food Science, 2016, 37(1): 139-144. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601025. http://www.spkx.net.cn

2015-06-19

江蘇省科技計劃（產學研合作前瞻性聯(lián)合研究項目）項目（BY2015024-04）

邵穎（1979—），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源開發(fā)與應用。E-mail：shyzhbo2005@126.com

*通信作者：陳安徽（1979—），男，副教授，博士，研究方向為應用微生物學。E-mail：chenah201@126.com