低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

王 婷，趙 培，王雪青*

低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響

王 婷，趙 培，王雪青*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

以球等鞭金藻（Isochrysis galbana）3011為對(duì)象，通過(guò)研究降低培養(yǎng)溫度后其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性以及還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）含量的變化，以闡明低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響。用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合熒光染色法測(cè)定低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；并采用氣相色譜法檢測(cè)球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量。結(jié)果表明：在21、18、15 ℃低溫環(huán)境處理下，球等鞭金藻細(xì)胞SOD、CAT和POD活性均隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；溫度越低，峰值出現(xiàn)越早，且峰值越大，峰后酶活性下降越快；GSH含量的變化趨勢(shì)與上述酶活性的變化相似，MDA含量則持續(xù)增加；ROS水平隨著溫度的降低而呈現(xiàn)出較為復(fù)雜的變化，15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h出現(xiàn)ROS水平爆發(fā)，20 h時(shí)達(dá)到峰值，分別為（14.11±0.11）%和（14.74±0.58）%（P＜0.05）；經(jīng)18 ℃低溫誘導(dǎo)24 h后，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量為0.105 mg/g，比對(duì)照組高0.06 mg/g。因此，低溫環(huán)境可以作為提高代謝物產(chǎn)量的誘導(dǎo)子，使球等鞭金藻細(xì)胞產(chǎn)生主動(dòng)防御反應(yīng)，引起清除活性氧相關(guān)的酶活性的升高，同時(shí)也提高了DHA產(chǎn)量。

球等鞭金藻3011；抗氧化；低溫；活性氧；二十二碳六烯酸

微藻是生活在海洋或者陸地中的微小生物，是最主要的初級(jí)生產(chǎn)者，對(duì)于穩(wěn)定海洋生態(tài)系統(tǒng)有著非常重要的作用。一些環(huán)境因子發(fā)生變化，如溫度除了能改變微藻的生長(zhǎng)和發(fā)育速率、調(diào)控某些酶的活性之外，還會(huì)影響細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)組成、營(yíng)養(yǎng)素的利用率等，以達(dá)到主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境改變的目的[1]。有研究報(bào)道，低溫可以改變機(jī)體內(nèi)與抗氧化防御系統(tǒng)密切相關(guān)的酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)自由基含量增加[2-4]。在植物細(xì)胞與組織培養(yǎng)過(guò)程中，如青蒿、長(zhǎng)春細(xì)胞，一定量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可充當(dāng)環(huán)境刺激信號(hào)的二級(jí)信使，通過(guò)細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)環(huán)境因子對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量和組成的調(diào)控[5-8]。

球等鞭金藻屬于金藻門，普林藻綱，等鞭藻目，等鞭藻科。由于其個(gè)體小、無(wú)細(xì)胞壁、易消化、富含多糖及多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）等代謝產(chǎn)物，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的開口餌料，同時(shí)也是生產(chǎn)DHA的潛力藻種。有研究顯示低溫可以促進(jìn)多不飽和脂肪酸的形成[9]，因此通過(guò)低溫環(huán)境刺激來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)DHA含量是其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵步驟。然而關(guān)于球等鞭金藻受到低溫環(huán)境的刺激時(shí)，其與ROS密切相關(guān)的酶的變化以及一些次生代謝產(chǎn)物的積累尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境作為刺激因子，研究其對(duì)球等鞭金藻的抗氧化系統(tǒng)和DHA含量的影響，為提高球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)DHA含量和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻（Isochrysis galbana）3011由中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)系實(shí)驗(yàn)室提供。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；2’,7’-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉（dichlorodihydro-fluorescein diacetate，DCFH-DA）、冰醋酸、磷酸鹽緩沖液、DHA甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FACSCalibur流式細(xì)胞儀 美國(guó)BD公司；TI-U倒置式熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.3 方法

1.3.1 球等鞭金藻的培養(yǎng)

采用f/2培養(yǎng)基對(duì)球等鞭金藻進(jìn)行培養(yǎng)，按體積分?jǐn)?shù)10%接種，培養(yǎng)溫度24～26 ℃，明/暗周期為14 h/10 h，光照度為4 500 lx，于光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期的球等鞭金藻，經(jīng)分瓶后分別在24、21、18、15 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h（每組3 個(gè)平行，其中24 ℃作為對(duì)照組），每6 h定時(shí)測(cè)定球等鞭金藻細(xì)胞的SOD、POD、CAT活力以及GSH、MDA含量。

1.3.2.1 粗酶液的提取及蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

取培養(yǎng)11 d至對(duì)數(shù)末期的球等鞭金藻液40 mL，8 000 r/min離心10 min，棄上清液，收獲球等鞭金藻細(xì)胞。用4 mL的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）重懸細(xì)胞，冰浴條件下超聲破碎30 次（功率400 W、時(shí)間3 s、間隔3 s），4 ℃靜置1 h，12 000 r/min離心20 min，上清液即為酶粗提液。取粗酶液1 mL并加入考馬斯亮藍(lán)溶液3 mL，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛血清白蛋白所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.105 6x－0.034 4（R2=0.995），計(jì)算出蛋白質(zhì)含量。

1.3.2.2 SOD活力測(cè)定

黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶催化下產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2－?），當(dāng)反應(yīng)體系中有SOD時(shí)，O2－?可被氧化生成H2O2，其可氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，通過(guò)測(cè)定550 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出SOD活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，抑制1 mL反應(yīng)液中O2－?氧化后將氧化羥胺轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，并與顯色劑反應(yīng)后形成紫紅色絡(luò)合物所需要的酶量。按照公式（1）計(jì)算SOD活力。

式中：0.5為說(shuō)明書所提供的參數(shù)；對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

1.3.2.3 POD活力測(cè)定

POD催化過(guò)氧化氫和愈創(chuàng)木酚產(chǎn)生醌類化合物，此化合物進(jìn)一步縮合成有顏色的化合物，通過(guò)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出POD活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，在30 min內(nèi)以1 mL反應(yīng)液中愈創(chuàng)木酚為底物催化過(guò)氧化氫形成醌類化合物進(jìn)一步縮合成有色化合物所需要的酶量。按照公式（2）計(jì)算POD活力。

式中：12、1 000為說(shuō)明書提供參數(shù)；1為比色光徑系數(shù)；30為反應(yīng)時(shí)間/min；對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

1.3.2.4 CAT活力測(cè)定

CAT分解H2O2的反應(yīng)可通過(guò)加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的H2O2與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種黃色的絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)定405 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出CAT活力，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。酶活力單位（U）定義為在上述反應(yīng)條件下，在60 min內(nèi)分解1 mL反應(yīng)液中H2O2所需要的酶量。按照公式（3）計(jì)算CAT活力。

式中：271為說(shuō)明書提供參數(shù)；60為反應(yīng)時(shí)間/min；對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣。

1.3.2.5 GSH含量測(cè)定

二硫代二硝基甲苯與巰基化合物反應(yīng)產(chǎn)生黃色絡(luò)合物，通過(guò)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出GSH含量，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。按照公式（4）計(jì)算GSH含量。

式中：307為GSH的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣；空白組為以試劑盒中的試劑1替代待測(cè)樣。

1.3.2.6 MDA含量測(cè)定

MDA與硫代巴比妥酸縮合形成紅色產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定532 nm波長(zhǎng)處吸光度的變化即可得出MDA含量，設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書方法進(jìn)行。按照公式（5）計(jì)算MDA含量。

式中：對(duì)照組為以最適溫度培養(yǎng)0 h的樣品替代待測(cè)樣；10 nmol/mL為標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；標(biāo)準(zhǔn)組為以10 nmol/mL標(biāo)準(zhǔn)品替代待測(cè)樣；空白組為以無(wú)水乙醇替代待測(cè)樣。

1.3.3 ROS水平測(cè)定

采用流式細(xì)胞儀將培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)末期的球等鞭金藻細(xì)胞在24、21、18、15 ℃條件下分別誘導(dǎo)不同的時(shí)間，每4 h以流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平，以倒置熒光顯微鏡鏡檢染色后細(xì)胞狀態(tài)。并設(shè)3 個(gè)平行組，具體操作步驟為：樣品以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液洗滌去雜質(zhì)，10 000 r/min離心15 min，重復(fù)3 次，稀釋至106個(gè)/mL以下，各取1 mL在24 ℃條件下培養(yǎng)的細(xì)胞樣品作為對(duì)照，以0.5 μmol/L的終濃度進(jìn)行Fluo-3-AM（鈣離子熒光探針）染色，避光孵育15 min后上樣。流式細(xì)胞儀用氳離子激光激發(fā)光源，功率15 mW，發(fā)射光波長(zhǎng)488 nm，F(xiàn)luo-3-AM的綠色熒光用525 nm/30 nm帶通濾片收集，應(yīng)用Cellquest軟件收集、儲(chǔ)存、處理數(shù)據(jù)。將各組細(xì)胞樣品以相同濃度染料染色后涂于玻片上，立即置于倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)酯酶水解生成的DCFH被細(xì)胞內(nèi)的ROS氧化生成的熒光性的DCF，可被倒置熒光顯微鏡檢測(cè)到，并照相記錄[10-12]。

1.3.4 DHA含量測(cè)定

采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）測(cè)定DHA含量，具體操作步驟如下。

1.3.4.1 多不飽和脂肪酸的提取

以76 mL乙醇-氫氧化鉀溶液溶解1 g球等鞭金藻凍干粉，50 W超聲破碎20 min，70 ℃浸提1 h，抽濾，用乙醇洗滌濾餅，加入20 mL去離子水?dāng)U大體積，用正己烷萃取，HCl調(diào)整溶液pH值后，加入正己烷進(jìn)行皂化反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除正己烷，用尿素包埋溶液中的飽和脂肪酸或者單不飽和脂肪酸后－20 ℃冷凍保存2 h（此過(guò)程一直在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行）。

1.3.4.2 多不飽和脂肪酸甲酯化

在1 g球等鞭金藻粉所得的多不飽和脂肪酸中，加入硫酸-甲醇溶液置于75 ℃條件下水浴甲酯化1 h，反應(yīng)結(jié)束后加入生理鹽水和正己烷，振蕩混勻，靜置分層，取上層溶液，加入適量的無(wú)水硫酸鈉離心10 min，取上層溶液并用正己烷定容至10 mL，置于－20 ℃條件下保存。

1.3.4.3 DHA含量測(cè)定

采用GC法測(cè)定DHA含量。操作條件如下：色譜柱為HP-88型石英毛細(xì)管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；色譜柱溫度：210 ℃，恒溫20 min，以3 ℃/min升溫至240 ℃，維持20 min；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；FID檢測(cè)器溫度：260 ℃；進(jìn)樣方式：分流，分流比10∶1；進(jìn)樣量：1 μL；載氣：高純氮?dú)猓?9.99%）。

1.3.4.4 DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取不同質(zhì)量濃度DHA-甲酯對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1.0 μL，測(cè)定峰面積響應(yīng)值，分別以DHA-甲酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，得到線性回歸方程y=947.32x－4 032.5（R2=0.999 1）。表明在DHA-甲酯質(zhì)量濃度為2 000～20 000 μg/mL范圍內(nèi)，色譜峰面積與DHA-甲酯含量線性關(guān)系良好。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 球等鞭金藻在最適溫度下的生長(zhǎng)特性

圖1 球等鞭金藻3011在24 ℃條件下的生長(zhǎng)曲線（n==33）Fig.1 Growth curve of Isochrysis galbana 3011 at 24 ℃(n = 3)

圖1 為球等鞭金藻細(xì)胞在最適溫度（24 ℃）下培養(yǎng)測(cè)得的生長(zhǎng)曲線，該曲線的回歸方程為y=0.000 2x5－0.003 6x4－0.082 1x3+2.274 0x2－5.108 2x（R2= 0.993 5）。球等鞭金藻的生長(zhǎng)特點(diǎn)如下：第1～4天為生長(zhǎng)停滯期，第5～10天為指數(shù)生長(zhǎng)期，第11～13天為指數(shù)生長(zhǎng)末期，第14～18天為靜止期，第19天之后進(jìn)入細(xì)胞衰亡期。本研究選取生物量最高的指數(shù)末期（第11天）作為低溫誘導(dǎo)時(shí)間，同時(shí)后續(xù)實(shí)驗(yàn)將最適溫度（24 ℃）設(shè)置為對(duì)照組。

2.2 低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻抗氧化系統(tǒng)的影響

2.2.1 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響

圖2 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響Fig.2 Effect of low temperature on SOD activity

不同溫度對(duì)球等鞭金藻SOD活性的影響見圖2。當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí)，與對(duì)照組比較，其他處理組的球等鞭金藻SOD活力均顯著提高，而且誘導(dǎo)溫度越低，SOD活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，15、18、21 ℃處理組的球等鞭金藻SOD活力又依次開始下降，這3 個(gè)處理組球等鞭金藻SOD活力的最大值分別為1 079.63、1 009.2、849.27 U/mg，比對(duì)照組分別提高了179%、168%和141%。

2.2.2 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響

不同溫度對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響見圖3。球等鞭金藻經(jīng)過(guò)較短時(shí)間（少于18 h）的低溫誘導(dǎo)時(shí)，與對(duì)照組比較，球等鞭金藻的CAT活力顯著提高，而且誘導(dǎo)溫度越低，CAT活力提高程度越大。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，15 ℃處理組的球等鞭金藻CAT活性在18 h后開始下降，18 ℃處理組則發(fā)生在24 h之后，而21 ℃處理組在30 h之后才開始有緩慢下降。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻CAT活力的最大值分別為332.05、318.90、282.47 U/mg，比對(duì)照組分別提高了1.73、1.67、1.47 倍。

圖3 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻CAT活性的影響Fig.3 Effect of low temperature on CAT activity

2.2.3 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響

圖4 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響Fig.4 Effect of low temperature on POD activity

低溫對(duì)球等鞭金藻POD活性的影響如圖4所示，在低溫誘導(dǎo)18 h內(nèi)，與對(duì)照組相比，球等鞭金藻POD酶活力有明顯提高，并且誘導(dǎo)溫度越低，POD活力提高程度越大。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)18 h時(shí)，15 ℃處理組的球等鞭金藻POD活力開始下降，6 h后（24 h時(shí)）18 ℃處理組POD活力也開始下降，當(dāng)?shù)蜏卣T導(dǎo)至30 h時(shí)，21 ℃處理組的POD活力開始緩慢下降。48 h時(shí)，15、18 ℃處理組的POD活力已經(jīng)低于對(duì)照組。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻的POD活力最大值分別為217.40、214.67、202.33 U/mg，比對(duì)照組分別提高了152%、150%、142%。

2.2.4 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻GSH含量的影響

圖5 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻GSH含量的影響Fig.5 Effect of low temperature on GSH content

如圖5所示，3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，但與上述3 種酶的區(qū)別在于48 h內(nèi)，3 個(gè)低溫誘導(dǎo)處理組的球等鞭金藻GSH含量始終高于對(duì)照組。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間少于18 h時(shí)，與對(duì)照組相比，GSH含量明顯提高，而且溫度越低，GSH含量增加速率越快。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，15 ℃處理組的球等鞭金藻GSH含量在18 h時(shí)開始下降，18 ℃處理組在24 h時(shí)GSH含量下降， 21 ℃處理組在30 h之后才開始緩慢下降。21、18、15 ℃處理組球等鞭金藻的GSH含量最大值分別為613.65、773.68、782.76 mg/g pro，比對(duì)照組分別提高了1.53、1.93、1.95 倍。

2.2.5 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻MDA含量的影響

圖6 低溫誘導(dǎo)對(duì)球等鞭金藻MDA含量的影響Fig.6 Effect of low temperature on MDA content

圖6 顯示了由低溫所引起的球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)MDA含量的變化，與對(duì)照組比較，各處理組球等鞭金藻在短時(shí)間（24 h內(nèi)）的低溫誘導(dǎo)處理下的MDA含量并無(wú)差異（P＞0.05）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在30 h 時(shí)15 ℃處理組的球等鞭金藻MDA含量最先開始增加，6 h后（36 h 時(shí)）18 ℃處理組的MDA含量也出現(xiàn)了顯著增加，而21 ℃處理組則是在48 h時(shí)才檢測(cè)到MDA含量的存在。15、18、21 ℃處理組球等鞭金藻在48 h時(shí)的MDA含量分別為2.987、2.477、1.00 nmol/mg pro。

總之，球等鞭金藻3011經(jīng)低溫誘導(dǎo)，其細(xì)胞內(nèi)SOD、POD和CAT活力以及GSH含量均顯著提高。副產(chǎn)物MDA的水平受誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的雙重影響，低溫長(zhǎng)時(shí)環(huán)境中MDA水平增加明顯。因此，誘導(dǎo)溫度越低，處理時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)球等鞭金藻的正常生理代謝影響越大，引起細(xì)胞膜的損傷程度越高，從而導(dǎo)致球等鞭金藻細(xì)胞偏離正常水平生長(zhǎng)。而合適的環(huán)境刺激（有效的低溫和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間）能使細(xì)胞有足夠強(qiáng)烈的防御響應(yīng)，誘導(dǎo)其加強(qiáng)合成DHA，同時(shí)對(duì)球等鞭金藻細(xì)胞本身的損傷較小。為此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)了不同溫度和時(shí)間誘導(dǎo)下球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，以確定適合DHA積累的最佳溫度和時(shí)間。

2.3 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的ROS水平

ROS為具有化學(xué)活性的含氧分子，主要包括超氧陰離子自由基、過(guò)氧化氫和羥自由基，因?yàn)楹送馕磁鋵?duì)電子的存在，ROS具有很強(qiáng)的化學(xué)反應(yīng)活性[13]。伴隨著機(jī)體正常呼吸代謝過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生一定量的ROS，這些ROS很快被細(xì)胞中的抗氧化酶或還原性物質(zhì)清除掉。然而，當(dāng)細(xì)胞受到外界環(huán)境（例如低溫）影響時(shí)，ROS的生成量會(huì)急劇增多，超過(guò)機(jī)體自身的清除能力，過(guò)多的ROS可以使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞。圖7是球等鞭金藻細(xì)胞在18 ℃條件下誘導(dǎo)4、20 h時(shí)ROS的產(chǎn)生狀況。而球等鞭金藻在不同的低溫條件下誘導(dǎo)不同時(shí)間，其細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化情況見表1。當(dāng)受到較短時(shí)間的低溫誘導(dǎo)（少于12 h）時(shí)，低溫處理組與對(duì)照組（24 ℃處理組）的ROS水平差異不顯著。隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，ROS水平呈現(xiàn)出不同程度地增加，21 ℃處理組的球等鞭金藻ROS含量緩慢增加，在24 h時(shí)出現(xiàn)最大值為（9.18±0.52）%；15、18 ℃處理組誘導(dǎo)16 h時(shí)出現(xiàn)明顯的ROS水平爆發(fā)，與對(duì)照組相比具有顯著差異（P＜0.05），這兩組在20 h時(shí)球等鞭金藻的ROS水平出現(xiàn)最大值分別為（14.11±0.11）%和（14.74±0.58）%。

圖7 18 ℃誘導(dǎo)4 h（a）和20 h（b）球等鞭金藻3011的DCFH-DA染色熒光結(jié)果Fig.7 DCFH-DA staining fluorescence of Isochrysis galbana 3011 induced at 18 ℃ for 4 (a) and 20 h (b)

表1 溫度對(duì)球等鞭金藻3011 ROS水平的影響Table 1 Effect of low temperature on ROS level of Isochrysis galbana 3011

2.4 低溫誘導(dǎo)下球等鞭金藻的DHA產(chǎn)量

18 ℃誘導(dǎo)24、48 h后，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA水平分別為0.105、0.092 mg/g，而對(duì)照組（24 ℃，24 h）的DHA水平為0.045 mg/g。即經(jīng)過(guò)18 ℃誘導(dǎo)24 h后球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)的DHA含量比對(duì)照組高出1 倍多。因此，低溫誘導(dǎo)是提高球等鞭金藻DHA產(chǎn)量的十分有效的方法。

3 結(jié)論與討論

正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除是處于平衡狀態(tài)的，此時(shí)機(jī)體ROS含量較低，對(duì)機(jī)體不會(huì)造成任何傷害。當(dāng)受到環(huán)境脅迫（如低溫）時(shí)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，并產(chǎn)生大量ROS，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA的積累。最初ROS被認(rèn)為是氧化代謝中具很強(qiáng)毒性作用的副產(chǎn)物[14]，但隨著研究的深入發(fā)現(xiàn)ROS在動(dòng)植物的許多生理代謝過(guò)程中均具有害和有利的雙重功能[15]，適量的ROS可以作為生物開啟防御機(jī)制的重要信號(hào)，誘導(dǎo)許多參與防衛(wèi)功能的次生代謝產(chǎn)物的生物合成及相關(guān)基因的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)低溫誘導(dǎo)后，球等鞭金藻的抗氧化酶系統(tǒng)和抗氧化的還原性物質(zhì)（GSH）水平均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，且酶活性以及含量均高于對(duì)照組，此結(jié)果與他人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[16-21]。短時(shí)間低溫條件下，這些酶的活性和抗氧化物質(zhì)含量迅速增加，通過(guò)協(xié)同作用減輕由于ROS含量增加所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化，維持細(xì)胞的正常代謝。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化物質(zhì)能量逐漸減小，酶活性逐漸下降，引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用。因此，過(guò)量的ROS較長(zhǎng)時(shí)間地作用于細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞而言是一種傷害。因此，當(dāng)在恰當(dāng)?shù)牡蜏貤l件下作用適當(dāng)?shù)臅r(shí)間時(shí)，一方面可以誘導(dǎo)細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生ROS，另一方面ROS作用于逆境信號(hào)，激活機(jī)體的防御響應(yīng)，同時(shí)通過(guò)提高抗氧化酶的活性和還原性物質(zhì)的含量來(lái)消除ROS對(duì)機(jī)體自身的不良影響。已有實(shí)驗(yàn)表明，適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢源龠M(jìn)多不飽和脂肪酸的積累[22-23]。但長(zhǎng)時(shí)間的低溫誘導(dǎo)會(huì)導(dǎo)致ROS的過(guò)度積累，使多不飽和脂肪酸的雙鍵發(fā)生過(guò)氧化作用[24]，產(chǎn)生MDA。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，球等鞭金藻經(jīng)過(guò)18 ℃誘導(dǎo)24 h后，其細(xì)胞內(nèi)DHA水平比對(duì)照組提高了0.06 mg/g，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或是降低誘導(dǎo)溫度均會(huì)導(dǎo)致DHA含量下降，這也與他人的研究結(jié)果相似[25]。

現(xiàn)如今關(guān)于ROS、抗氧化酶以及DHA對(duì)低溫的防御機(jī)理有兩種理論：1）低溫誘導(dǎo)引起ROS水平爆發(fā)，抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行主動(dòng)防御，適量的ROS作為信號(hào)分子引起相關(guān)去飽和酶基因的表達(dá)，提高了脂肪酸的不飽和度，恢復(fù)細(xì)胞膜脂質(zhì)的流動(dòng)性，以保持其正常的生理功能，提高對(duì)低溫的耐受能力；2）DHA作為非酶促小分子抗氧化物質(zhì)，與抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)共同作用，清除低溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS[26-27]。在受到低溫誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞膜首先受到傷害，其通透性下降，并發(fā)生膜相變，同時(shí)引起ROS水平的爆發(fā)，抗氧化系統(tǒng)在短時(shí)間內(nèi)可以進(jìn)行主動(dòng)防御，消除ROS過(guò)量積累引起的傷害，適量ROS的積累可以作為信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞防御基因的表達(dá)，激活信號(hào)通對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行重新修飾[28]，使機(jī)體脂類代謝、次生代謝、激素合成及代謝等相關(guān)基因的表達(dá)有明顯改變[29-30]，保證機(jī)體對(duì)低溫的適應(yīng)性，促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的積累。但是當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，ROS的產(chǎn)生量過(guò)多，且抗氧化酶活性下降，會(huì)造成次生代謝產(chǎn)物的積累下降，同時(shí)MDA含量增加。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，球等鞭金藻細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性與溫度成負(fù)相關(guān)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，溫度越低，MDA越早出現(xiàn)。ROS水平爆發(fā)最早出現(xiàn)在15 ℃和18 ℃誘導(dǎo)16 h時(shí)，18 ℃誘導(dǎo)20 h有（14.74±0.58）%的細(xì)胞發(fā)生ROS水平爆發(fā)，與對(duì)照組比較均具有顯著差異（P＜0.05）。18 ℃誘導(dǎo)24 h的球等鞭金藻DHA產(chǎn)量比24 ℃誘導(dǎo)24 h高0.06 mg/g。

適當(dāng)?shù)牡蜏丨h(huán)境可以作為誘導(dǎo)子引起球等鞭金藻的ROS相關(guān)酶活性的升高，ROS的適量積累可促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物合成。本研究為提高球等鞭金藻細(xì)胞DHA產(chǎn)量和利用球等鞭金藻產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)DHA提供了參考依據(jù)。

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Effect of Low Environmental Temperature on Antioxidant System and DHA Content in Isochrysis galbana 3011

WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing*
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Effects of low environmental temperature on the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), and the contents of glutathione peroxidase (GSH), malondialdehyde (MDA), docosahexaenoic acid (DHA) and reactive oxygen species (ROS) in Isochrysis galbana 3011 were investigated for exploring the relationship among antioxidant enzyme activities, ROS levels and DHA contents at different temperatures. The enzyme activities were determined by corresponding kits. ROS levels were detected by flow cytometry and inverted fluorescence microscope, and DHA contents were determined by gas chromatography (GC). The results showed that activities of SOD, CAT and POD increased firstly and then decreased with increasing culture time at 15, 18 and 21 ℃. Lower temperature could result in earlier and higher enzyme activity peaks followed by a faster decline. The profile of GSH was similar to that of antioxidant enzyme activities, while content of MDA increased continuously. ROS levels showed a complex change with declining temperature, and ROS burst was appeared after induction for 16 h at 15 and 18 ℃, with maximum values of (14.11 ± 0.11)% and (14.74 ± 0.58)% at 20 h, respectively (P ＜ 0.05). DHA was 0.105 mg/g at 18 ℃ for 24 h, which was higher than that at 24 ℃ for 24 h by 0.06 mg/g. Therefore, low environmental temperature can improve the levels of metabolic products by activating microalgae defense responses, increasing ROS-related enzyme activities, ROS levels and DHA contents.

Isochrysis galbana 3011; antioxidant; low temperature; reactive oxygen species (ROS); docosahexaenoic acid

10.7506/spkx1002-6630-201601023

TS207.3

A

1002-6630（2016）01-0126-07

王婷, 趙培, 王雪青. 低溫環(huán)境對(duì)球等鞭金藻3011抗氧化系統(tǒng)和二十二碳六烯酸產(chǎn)量的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 126-132.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

WANG Ting, ZHAO Pei, WANG Xueqing. Effect of low environmental temperature on antioxidant system and DHA content in Isochrysis galbana 3011[J]. Food Science, 2016, 37(1): 126-132. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201601023. http://www.spkx.net.cn

2015-02-11

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20120603）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31270050； 31071522；31171674）

王婷（1989—），女，碩士研究生，主要從事微藻生理生化研究。E-mail：xuantingqian@aliyun.com

*通信作者：王雪青（1964—），女，教授，博士，主要從事天然活性物質(zhì)研究。E-mail：wxqing@tjcu.edu.cn