高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)分析沼液中4種喹諾酮類抗生素

賀南南，管永祥，梁永紅，吳昊，羅朝暉*，趙海燕*，顧祖麗

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095；2.江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站，南京210036；3.江蘇省農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)與保護(hù)站，南京210036）

高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)分析沼液中4種喹諾酮類抗生素

賀南南1，管永祥2，梁永紅2，吳昊3，羅朝暉1*，趙海燕1*，顧祖麗1

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京210095；2.江蘇省耕地質(zhì)量與農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)站，南京210036；3.江蘇省農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)與保護(hù)站，南京210036）

通過對(duì)沼液樣品預(yù)處理過程優(yōu)化、提取劑與洗脫劑的篩選和檢測(cè)色譜條件優(yōu)化，建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法分析沼液中4種喹諾酮類抗生素（FQs）的檢測(cè)方法。該方法選用Na2EDTA溶液作為提取劑，調(diào)節(jié)樣品pH=4，漩渦混勻后經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，選用6 mL甲醇為洗脫劑，濃縮后用高效液相色譜-熒光分析法（HPLC-FLD）檢測(cè)，采用乙腈/0.01 mol·L-1四丁基溴化銨作為流動(dòng)相，外標(biāo)法定量。4種FQs在0.002～5.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，R2均大于0.990。樣品在0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·L-16個(gè)添加水平下的平均回收率在80.4%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～5.1%，方法的檢出限為0.004～0.01 mg·L-1。應(yīng)用該方法對(duì)南京地區(qū)分別以雞糞、豬糞、牛糞為發(fā)酵原料的3個(gè)大中型沼氣工程的沼液樣品進(jìn)行分析，4種喹諾酮類抗生素均被檢出，檢測(cè)濃度為5～204 μg·L-1，表明沼液中抗生素污染問題值得關(guān)注。

喹諾酮類抗生素；固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（SPE-HPLC-FLD）；沼液；分析方法

近年來(lái)，在集約化、規(guī)?；男笄蒺B(yǎng)殖過程中，喹諾酮類抗生素（FQs）是迅速發(fā)展起來(lái)的一類人工合成的藥物［1］，因其具有抗菌譜廣、抗菌力強(qiáng)、低毒、組織穿透力強(qiáng)、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、給藥方便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用來(lái)促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)和減少畜禽疾?。?-3］。目前，中國(guó)是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)［4］，每年約生產(chǎn)210 000 t抗生素，其中48%用于農(nóng)業(yè)和畜牧產(chǎn)業(yè)［5］。由于許多種類抗生素藥物在動(dòng)物體內(nèi)不能被吸收利用，造成30%～90%的抗生素會(huì)以原形和活性代謝產(chǎn)物的方式排泄到環(huán)境中［6］。據(jù)研究報(bào)道，環(huán)境中殘留的抗生素會(huì)影響陸地生物、改變土壤中微生物活動(dòng)和種群組成［7］，促進(jìn)細(xì)菌耐藥性抗性基因發(fā)展，并逐步演變成新型環(huán)境有機(jī)污染物，進(jìn)而給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅［8］。

目前，國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)FQs的檢測(cè)分析主要集中于畜禽糞便，關(guān)于沼液中FQs的檢測(cè)鮮見報(bào)道。沼液是以畜禽糞便為主要發(fā)酵原料，并經(jīng)過甲烷菌厭氧消化后生成［9］，因?yàn)槠浠|(zhì)復(fù)雜且殘留藥物濃度較低（痕量或超微量）［10］，對(duì)沼液中的FQs的分析造成了較大干擾。

針對(duì)環(huán)境中FQs的檢測(cè)分析技術(shù)主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS），但該分析方法儀器設(shè)備昂貴，分析成本高，難以普及應(yīng)用［11］。因?yàn)镕Qs在靈敏度較高而成本相對(duì)較低的熒光檢測(cè)器（FLD）下響應(yīng)良好，所以高效液相色譜-熒光分析法（HPLC-FLD）檢測(cè)技術(shù)受到眾多研究者歡迎。He等［12］使用HPLCFLD對(duì)廢水中的11種FQs進(jìn)行殘留檢測(cè)，該方法檢測(cè)限在5～30 ng·L-1；Gao等［13］建立了HPLC-FLD對(duì)牛奶、雞蛋、蜂蜜的6種FQs同時(shí)檢測(cè)分析方法，方法檢測(cè)限在70～530 ng·L-1；Sun等［14］利用HPLC-FLD對(duì)魚中的8種FQs進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該方法的檢出限在60～220 ng·L-1；Rodriguez等［15］建立了HPLCFID對(duì)嬰兒產(chǎn)品中5種FQ檢測(cè)分析方法，其最低檢測(cè)限為10 ng·L-1；劉博等［16］利用HPLC-FLD對(duì)雞糞中6種FQ進(jìn)行檢測(cè)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該方法檢出限為0.002～0.022 mg·kg-1；丑亞琴等［17］建立了HPLC-FLD對(duì)水產(chǎn)品中4種FQs藥物殘留檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，其定量限為0.004 mg·kg-1。

本研究借鑒了Vázquez等［18］的SPE-HPLC-FID檢測(cè)地下水8種FQs的研究技術(shù)，考慮到沼液基質(zhì)的復(fù)雜性，在此基礎(chǔ)上對(duì)樣品的前處理過程進(jìn)行優(yōu)化，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、低成本、可靠、同時(shí)檢測(cè)沼液中4種喹諾酮類抗生素殘留量的方法。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)的研究方法，提取抗生素的過程簡(jiǎn)單；不需要增加復(fù)雜的超聲、離心等過程；不需要添加復(fù)雜的提取劑；固相萃取后的洗脫液不經(jīng)過氮?dú)獯蹈啥抢眯D(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干，顯著節(jié)約時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本。另外，基于本實(shí)驗(yàn)采用的液相條件得到的部分FQs的檢出限顯著高于Ni等［19］和Urraca等［20］的文獻(xiàn)報(bào)告，適合對(duì)沼液中4種FQs的分析，為研究和治理復(fù)雜介質(zhì)環(huán)境中FQs污染提供支撐，以期為沼液的農(nóng)業(yè)安全利用把關(guān)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（附FLD檢測(cè)器、標(biāo)準(zhǔn)型自動(dòng)進(jìn)樣器、四元泵、柱溫箱），美國(guó)安捷倫公司；Shim-Pack，VP-ODS色譜柱（250 mm×4.6mm，5 μm），日本島津公司；真空泵、十二孔固相萃取裝置，東康科技有限公司；超聲波清洗儀，昆山禾超聲儀器有限公司；Oasia HLB固相萃取柱（3 mL/60 mg），月旭科技股份有限公司；抽濾裝置，南京壽德有限公司；0.7 μm玻璃纖維微膜，昀冠生物科技有限公司；0.45 μm聚四氟乙烯微孔濾膜，上海鼎杰生物科技有限公司；pH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；超純水器，南京易普易達(dá)發(fā)展有限公司；萬(wàn)分之一天平，SHIMADAU公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國(guó)BUCHI公司。

氧氟沙星（FOL）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）、諾氟沙星（NOR）均購(gòu)于上海瑞永生物科技有限公司，純度均為98%；四丁基溴化銨購(gòu)于Aladdin公司，純度99%；甲醇、乙腈均為色譜純；氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸、鹽酸等為分析純，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 溶液配制

Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液：稱取一定量的

Na2EDTA、Na2HPO4和檸檬酸，分別配制成0.1、0.2、0.4 mol·L-1的溶液。按照3∶2的比例混合Na2HPO4和檸檬酸，配制成McIIvaine溶液。將0.1 mol·L-1Na2EDTA溶液與McIIvaine緩沖溶液按照1∶1的比例混合，配制成Na2EDTA-McIIvaine緩沖溶液（混合后pH值約為4）。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取OFL、CIP、ENR、NOR標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g溶于0.03 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，用高純水稀釋定容至100 mL，配成100 mg·L-1的工作母液，在4℃避光保存?zhèn)溆?，保質(zhì)期為2個(gè)月。

1.3 樣品采集與前處理

沼液樣品采自南京市郊區(qū)3個(gè)大中型沼氣工程。以牛糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市浦口區(qū)永寧鎮(zhèn)友聯(lián)村（118°32′16″E，32°10′47″N）；以豬糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市浦口區(qū)大林養(yǎng)殖場(chǎng)（118°34′32″E，32°1′16″N）；以雞糞為發(fā)酵原料的沼液采自南京市江寧區(qū)新洲蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)（118°35′8″E，31°53′34″N）。多點(diǎn)收集新鮮沼液并混合均勻成為一個(gè)沼液樣品，避光密封，帶回實(shí)驗(yàn)室在室溫條件下保存。

采集的沼液先通過濾紙過濾除去懸浮物，再通過0.7 μm的玻璃纖維過濾后，準(zhǔn)確量取濾液50 mL到燒杯中，加入0.25 g乙二胺四乙酸二鈉抑制重金屬的螯合，然后用鹽酸調(diào)節(jié)樣品pH=4左右。濾液經(jīng)過漩渦均質(zhì)后保持以1 mL·min-1的速率通過Oasis HLB固相萃取柱進(jìn)行富集［Oasis HLB固相萃取柱使用前，依次用3×2 mL甲醇、3×2 mL超純水、3×2 mL鹽酸（pH=4）進(jìn)行預(yù)處理］，萃取富集后，用6 mL超純水清洗固相萃取柱，并真空干燥30 min。最后用6 mL甲醇緩慢洗脫到10 mL離心管中，將收集的洗脫液在40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用2 mL超純水復(fù)溶，超聲5 min促溶。以上溶液均過0.22 μm水系濾膜后放入2 mL的棕色玻璃瓶待測(cè)。

1.4 色譜條件

色譜柱Shim-Pack，VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動(dòng)相為0.01 mol·L-1四丁基溴化銨/乙腈混合液（95∶5，V∶V），（用磷酸調(diào)節(jié)pH=3，用前過0.45 μm的聚四氟乙烯微孔濾膜、乙腈使用前超聲脫氣30 min），流速1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量20 μL；熒光檢測(cè)器（FLD）檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水稀釋，配制成濃度為0.002、0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.1、1、2、5 mg·L-1的 FQs混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.6 回收率的計(jì)算過程

根據(jù)文獻(xiàn)［21］的規(guī)定，對(duì)添加抗生素的樣品與未添加抗生素的空白樣品同時(shí)執(zhí)行SPE-HPLC測(cè)試抗生素濃度，按以下公式計(jì)算回收率：

加標(biāo)回收率（%）=（加標(biāo)樣品中抗生素濃度-空白樣品中抗生素濃度）/加標(biāo)量×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE過程優(yōu)化

2.1.1 提取劑的選擇

從環(huán)境樣品中提取FQs物質(zhì)，提取劑的選擇非常重要，目前常用的提取劑為Na2EDTA-McIIvaine緩沖液。本研究比較了Na2EDTA-McIIvaine緩沖液（pH= 4）和單獨(dú)使用Na2EDTA溶液提取沼液各目標(biāo)物的回收率，結(jié)果見表1。分別使用Na2EDTA溶液、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液提取液時(shí)，均可以從沼液中提取出目標(biāo)物，但單獨(dú)使用Na2EDTA溶液時(shí)ENR和NOR的提取效果與使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液相比存在顯著性差異。同時(shí)Na2EDTA-McIIvaine實(shí)驗(yàn)使用量較大，配制過程繁瑣、易堵塞SPE裝置、前處理后的樣品上機(jī)檢測(cè)時(shí)檢出的雜質(zhì)也較多。綜合考慮本實(shí)驗(yàn)使用Na2EDTA溶液作為沼液中FQs的提取劑。

2.1.2 樣品待測(cè)液pH的影響

表1 不同提取劑條件下4種FQs的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）Table 1 Percent recoveries and relative standard deviation（RSD）under different extraction agents（%）

FQs在水溶液酸性條件下（通常pH＜5）是陽(yáng)離子形式，在對(duì)FQs樣品預(yù)處理中大多將樣品pH調(diào)節(jié)為酸性，將其轉(zhuǎn)化為陽(yáng)離子形式有利于提?。?2-23］。選擇Na2EDTA溶液作為提取劑，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)樣品pH為2～7，對(duì)樣品進(jìn)行提取過SPE柱后上機(jī)測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3次，比較樣品在不同pH條件下

的提取效果。由表2可知，各目標(biāo)物回收率受樣品pH變化影響非常顯著，在一定范圍內(nèi)，抗生素回收率隨著pH的降低而提高。pH=5時(shí)，目標(biāo)物回收率較低均小于68.3%，而當(dāng)pH=4時(shí)，4種FQs回收率最佳，達(dá)87.5%～101.9%。因此，選擇Na2EDTA溶液作為提取劑，樣品pH調(diào)至4時(shí)，提取效率最佳。

表2 樣品在不同pH值條件下4種FQs的回收率（%）Table 2 Percent recoveries of 4 FQs in samples at different pH values（%）

2.1.3 洗脫溶劑和洗脫體積

由于沼液基質(zhì)的復(fù)雜性，洗脫溶劑類型會(huì)影響喹諾酮類抗生素的提取效果，需選擇適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑盡可能洗脫目標(biāo)物，同時(shí)避免將干擾雜質(zhì)洗脫下來(lái)影響目標(biāo)物的檢測(cè)。目前常用洗脫液中抗生素的溶劑主要是甲醇、乙腈［24-25］。將1 mL各目標(biāo)物濃度均為2 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用50 mL超純水稀釋后過HLB柱，分別以甲醇、乙腈為洗脫劑，進(jìn)行洗脫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。甲醇的洗脫效果最理想為91.9%～101.8%，乙腈的洗脫能力比甲醇低，而且甲醇洗脫實(shí)際樣品后產(chǎn)生的雜質(zhì)峰并不會(huì)對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾，所以對(duì)沼液實(shí)際樣品洗脫選用甲醇。分別用4、5、6、7、8 mL甲醇洗脫吸附在固相萃取柱上的目標(biāo)物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2，發(fā)現(xiàn)6 mL時(shí)目標(biāo)物洗脫效率已達(dá)最高值，最終確定最佳洗脫體積為6 mL。

2.2 色譜分離條件

2.2.1 流動(dòng)相

喹諾酮抗生素化合物具有兩性基團(tuán)，在水溶液中呈離子狀態(tài)，會(huì)因色譜柱的吸附形成拖尾，從而導(dǎo)致諾氟沙星與環(huán)丙沙星很難在較短時(shí)間內(nèi)基線分離。結(jié)合其最大吸收波長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)確定了激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，加入磷酸作為改性劑對(duì)拖尾現(xiàn)象有較大改善。使用磷酸調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，考察pH在2.0～4.0范圍內(nèi)的色譜分離效果，發(fā)現(xiàn)pH在2.5～3.0時(shí)，4種FQs可以在合適時(shí)間得到基線分離。流動(dòng)相中乙腈的含量對(duì)保留時(shí)間影響4種FQs藥物的出峰時(shí)間在17～38 min，而樣品中的雜峰集中在14 min之前，不會(huì)形成干擾。標(biāo)準(zhǔn)樣品（1.0mg·L-1）、加標(biāo)樣品（以豬糞為發(fā)酵原料的沼液樣品添加濃度為0.5mg·L-1）、沼液樣品中4種FQs的色譜分離圖見圖3。

圖1不同洗脫劑對(duì)回收率的影響Figure 1 Effects of different elution solutions on recoveries of FQs

圖2不同洗脫量對(duì)回收率的影響Figure 2 Effects of different volume of elution solutions on recoveries of FQs

2.2.2 色譜柱

不同型號(hào)的色譜柱因其鍵合工藝和填料方法的不同，同樣條件下分析同樣物質(zhì)時(shí)會(huì)有不同的色譜行為。本實(shí)驗(yàn)考查了安捷倫公司的AgilentXDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和日本島津公司的Shim-Pack，VP-ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相0.01 mol·L-1四丁基溴化銨（用磷酸調(diào)pH至2.5～3）/乙腈調(diào)制為95∶5，其余色譜條件不變。圖4為使用AgilentXDB-C18色譜柱時(shí)的色譜圖，圖5為Shim-Pack，VP-ODS色譜柱的色譜圖。比較可知，圖5明顯優(yōu)于圖4，所以本研究采用Shim-Pack，VP-ODS進(jìn)行分析。

2.2.3 流速、柱溫

流速和柱溫對(duì)樣品保留時(shí)間和峰型都有影響。流速增加、柱溫升高都會(huì)使保留時(shí)間減少，峰寬變窄，峰

型更加尖銳，但是如果流速太大、柱溫太高，會(huì)造成峰重疊。本研究考察了0.6、0.8、1.0 mL·min-13個(gè)流速，20、25、30、35℃4個(gè)柱溫，結(jié)果表明流速1.0 mL·min-1、柱溫30℃時(shí)效果最佳。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)樣品、加標(biāo)樣品、沼液樣品中FQs的色譜圖Figure 3 Chromatograms of FQs in a standard sample，a spikedsample and biogas slurry samples

圖4 Agilent XDB-C18色譜柱Figure 4 Agilent XDB-C18 chromatographic column

圖5 Shim-Pack，VP-ODS色譜柱Figure 5 Shim-Pack，VP-ODS chromatographic column

2.3 線性范圍和檢出限

配制0.002、0.005、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mg·L-1的系列混合工作曲線，按照前述的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以色譜峰面積對(duì)抗生素質(zhì)量濃度作校正曲線后得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)，采用3倍信噪比計(jì)算檢出限，結(jié)果見表3。4種FQs濃度（C）與峰面積（S）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.990）。

2.4 添加回收率

分別在50 mL沼液樣品中添加0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平取3個(gè)平行樣，按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并計(jì)算各目標(biāo)物平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表4。4種FQs的平均回收率為81.3%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合樣品分析要求。

表3 4種FQs標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 3 Calibration equations and correlation coefficients of developed method

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用上述所建立的分析方法，對(duì)南京市以豬糞、牛糞、雞糞為發(fā)酵原料的沼液樣品中4種FQs進(jìn)行了檢測(cè)，分析結(jié)果見表5。檢測(cè)結(jié)果表明，以豬糞、牛糞、雞糞為發(fā)酵原料的沼液樣品中均檢測(cè)到4種FQs。沼液樣品中以豬糞為發(fā)酵原料的沼液中4種抗生素總含量為475 μg·L-1；以牛糞為發(fā)酵原料的沼液中4種抗生素總含量為188.8 μg·L-1；以雞糞為發(fā)酵原料的沼液中4種抗生素總含量為204 μg·L-1。這可能與獸藥使用量最大和豬的消化系統(tǒng)有關(guān)。沼液樣品中氧氟沙星濃度范圍為16.8～103 μg·L-1，環(huán)丙沙星為濃度范圍為5～17 μg·L-1、恩諾沙星濃度范圍為67～151 μg·L-1，諾氟沙星濃度范圍為56～204 μg·L-1，沼液樣品中4種FQs的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜10%，諾氟沙星的含量較高，環(huán)丙沙星的含量較低。這可能是因?yàn)槌酥Z氟沙星使用比較廣泛以外，還由于諾氟沙星水溶性比較好，易于以糞尿的形式排出。沼液樣品中諾氟沙星和恩諾沙星的含量比較高，應(yīng)該加強(qiáng)監(jiān)管。

表4 4種FQs的添加回收率（n=3）Table 4 Percent recoveries of developed method for 4 FQs（n=3）

表5 沼液樣品中4種FQs含量（μg·L-1）Table 5 Content of 4 FQs in different biogas slurry samples measured by developed method（μg·L-1）

3 結(jié)論

建立了基于固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法（SPE-HPLC-FLD）分析沼液中4種喹諾酮類藥物的方法。4種FQs的檢測(cè)限范圍為0.004～0.01μg·mL-1，外標(biāo)法定量準(zhǔn)確性較好。應(yīng)用該方法對(duì)南京郊區(qū)沼液樣品中4種FQs進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)諾氟沙星在以豬糞為發(fā)酵原料的沼液中含量最高，恩諾沙星在以牛糞為發(fā)酵原料的沼液中含量最高，氧氟沙星在以雞糞為發(fā)酵原料的沼液中含量最高。沼液樣品中恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星的含量較高，環(huán)丙沙星含量最低。

［1］Meng Z，Shi Z，Liang S，et al.Residues investigation of fluoroquinolones and sulphonamides and their metabolites in bovine milk by quantifica-

tion and confirmation using ultra-performance chromatography-tandem mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2015，174：597-605.

［2］Herranz S，Moreno-Bondi M C，Marazuela M D.Development of a new sample pretreatment procedure based on pressurized liquid extraction for the determination of fluoroquinolone residues in table eggs［J］.Journal of Chromatography A，2007，1140（1/2）：63-70.

［3］孟磊，楊兵，薛南冬，等.高溫堆肥對(duì)雞糞中氟喹諾酮類抗生素的去除［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（2）：377-383.

MENG Lei，YANG Bing，XUE Nan-dong，et al.Effect of high temperature composing on removal of fluoroquinolones in chicken manures［J］. Journal of Agro-Environment Science，2015，34（2）：377-383.

［4］Cepurnieks G，Rjabova J，Zacs D，et al.The development and validation of a rapid method for the determination of antimicrobial agent residues in milk and meat using ultra performance liquid chromatography coupled to quadrupole-Orbitrap mass spectrometry［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2015，102：184-192.

［5］Dorival-García N，Junza A，Zafra-Gómez A，et al.Simultaneous determination of quinolone and β-lactam residues in raw cow milk samples using ultrasound-assisted extraction and dispersive-SPE prior to UHPLC-MS/MS analysis［J］.Food Control，2016，60：382-393.

［6］Tang J，Shi T，Wu X，et al.The occurrence and distribution of antibiotics in Lake Chaohu，China：Seasonal variation，potential source and risk assessment［J］.Chemosphere，2015，122：154-161.

［7］Chen H，Liu S，Xu X，et al.Antibiotics in the coastal environment of the Hailing Bay region，South China Sea：Spatial distribution，source analysis and ecological risks［J］.Marine Pollution Bulletin，2015，95（1）：365-373.

［8］Yao L，Wang Y，Tong L，et al.Seasonal variation of antibiotics concentration in the aquatic environment：A case study at Jianghan Plain，Central China［J］.Science of the Total Environment，2015，527-528：56-64.

［9］李祎雯，曲英華，徐奕琳，等.不同發(fā)酵原料沼液的養(yǎng)分含量及變化［J］.中國(guó)沼氣，2012，30（3）：17-20.

LI Yi-wen，QU Ying-hua，XU Yi-lin，et al.Change of nutrition contents of biogas slurry with different fermentation raw materials［J］.China Biogas，2012，30（3）：17-20

［10］趙揚(yáng)，鄭志明，金社勝，等.液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定豬糞便中16種（氟）喹諾酮類藥物殘留［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（6）：1248-1253.

ZHAO Yang，ZHENG Zhi-ming，JIN She-sheng，et al.Simultaneous determination of sixteen fluoroquinol ones residues in pig faces by liquid chromatography-mass spectrometry［J］.Journal of Agro-Environment Science，2011，30（6）：1248-1253.

［11］Cheng W，Li J，Wu Y，et al.Behavior of antibiotics and antibiotic resistance genes in eco-agricultural system：A case study［J］.Journal of Hazardous Materials，2016，304：18-25.

［12］He K，Blaney L.Systematic optimization of an SPE with HPLC-FLD method for fluoroquinolone detection in wastewater［J］.Journal of Hazardous Materials，2015，282：96-105.

［13］Gao M，Wang H，Ma M，et al.Optimization of a phase separation based magnetic-stirring salt-induced liquid-liquid microextraction method for determination of fluoroquinolones in food［J］.Food Chemistry，2015，175：181-188.

［14］Sun X，Wang J，Li Y，et al.Novel dummy molecularly imprinted polymers for matrix solid-phase dispersion extraction of eight fluoroquinolones from fish samples［J］.Journal of Chromatography A，2014，1359：1-7.

［15］Rodriguez E，Villoslada F N，Moreno-Bondi M C，et al.Optimization of a pressurized liquid extraction method by experimental design methodologies for the determination of fluoroquinolone residues in infant foods by liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217（5）：605-613.

［16］劉博，薛南冬，楊兵，等.高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)分析雞糞中六種氟喹諾酮類抗生素［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（5）：1050-1056.

LIU Bo，XUE Nan-dong，YANG Bing，et al.Simultaneous determination of six fluoroquinolons in chicken manures by high performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］.Journal of Agro-Environment Science，2014，33（5）：1050-1056.

［17］丑亞琴，唐巍，盧艷芬，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中四種氟喹諾酮類藥物殘留前處理?xiàng)l件的優(yōu)化［J］.水產(chǎn)養(yǎng)殖，2013，34（1）：21-27.

CHOU Ya-qin，TANG Wei，LU Yan-fen，et al.Optimization of pretreatmet for determination of four fluoroquinolones in aquatic product by high performance liquid chromatography［J］.Journal of Aquaculture，2013，34（1）：21-27.

［18］Vázquez M M P，Vázquez P P，Galera M M，et al.Determination of eight fluoroquinolones in groundwater samples with ultrasound-assisted ionic liquid dispersive liquid-liquid microextraction prior to highperformance liquid chromatography and fluorescence detection［J］.Analytica Chimica Acta，2012，748：20-27.

［19］Ni Y，Wang Y，Kokot S.Simultaneous determination of three fluoroquinolones by linear sweep stripping voltammetry with the aid of chemometrics［J］.Talanta，2006，69（1）：216-225.

［20］Urraca J L，Castellari M，Barrios C A，et al.Multiresidue analysis of fluoroquinolone antimicrobials in chicken meat by molecularly imprinted solid-phase extraction and high performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2014，1343：1-9.

［21］閭幸.生豬養(yǎng)殖廢水及地表水中獸用抗生素污染現(xiàn)狀與處理技術(shù)研究［D］.上海：上海師范大學(xué)，2013.

Lü Xing.Veterinary antibiotics in swine wastewater and groundwater and processing technology［D］.Shanghai：Shanghai Normal University，2013.

［22］Zhang H，Zhou Y，Huang Y，et al.Residues and risks of veterinary antibiotics in protected vegetable soils following application of different manures［J］.Chemosphere，2016，152：229-237.

［23］Seifrtová M，Nováková L，Lino C，et al.An overview of analytical methodologies for the determination of antibiotics in environmental waters［J］.Analytica Chimica Acta，2009，649（2）：158-179.

［24］Panasiuk O，Hedstr?m A，Marsalek J，et al.Contamination of stormwater by wastewater：A review of detection methods［J］.Journal of Environmental Management，2015，152：241-250.

［25］Pan X，Qiang Z，Ben W，et al.Simultaneous determination of three classes of antibiotics in the suspended solids of swine wastewater by ultrasonic extraction，solid-phase extraction and liquid chromatographymass spectrometry［J］.Journal of Environmental Sciences，2011，23（10）：1729-1737.

Simultaneous determination of four fluoroquinolones in biogas slurry by high Performance liquid chromatograPhy with fluorescence detection

HE Nan-nan1，GUAN Yong-xiang2，LIANG Yong-hong2，WU Hao3，LUO Zhao-hui1*，ZHAO Hai-yan1*，GU Zu-li1
（1.College of Resources and Environmental Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.Jiangsu Station of Cultivateland Qualitative and Agro-Environmental Protection，Nanjing 210036，China；3.Jiangsu Station of Agro-Environmental Monitoring and Protection，Nanjing 210036，China）

An analytical method for simultaneous determination of four fluoroquinolones（FQs）in biogas slurry based on solid-phase extraction and high performance liquid chromatography with a fluorescence detection（HPLC/FLD）was developed in this study.The homogenized sample adjusted to pH=4 was extracted with Na2EDTA solution，purified by Oasis HLB solid phase extraction after vortexing，and eluted with 6 mL methanol solvent.The FQs in the extract were determined by HPLC/FLD with acetonitrile and 0.01 mol·L-1tetrabutylammonium bromide as mobile phases.Quantitation was carried out using an external standard method.The standard curves for all the compounds were linear over the concentration ranges of 0.002 mg·L-1to 5.0 mg·L-1with all correlation coefficients above 0.990.The spiked recoveries at six levels of 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg·L-1and 5.0 mg·L-1were ranged from 80.4%to 105.7%，and the relatives standard deviations（RSD）were in the ranges of 1.0%to 5.1%.The limits of detection were from 0.004 mg·L-1to 0.01 mg·L-1.This method was used to analyze four FQs in biogas slurry samples fermented with chicken dung，pig dung，and cow dung collected from 3 large and medium-sized biogas projects in Nanjing.Four FQs were detected in all samples，with concentrations ranging from 5 μg·L-1to 204 μg·L-1，four kinds of FQs were detected. Therefore，antibiotic pollution problems in biogas slurry deserve attention.

fluoroquinolones；solid-phase extraction-high performance liquid chromatography with fluorescence detection；biogas slurry；analytical method

X502

A

1672-2043（2016）10-2034-07

10.11654/jaes.2016-0442

賀南南，管永祥，梁永紅，等.高效液相色譜-熒光檢測(cè)法同時(shí)分析沼液中4種喹諾酮類抗生素［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，35（10）：2034-2040.

HE Nan-nan，GUAN Yong-xiang，LIANG Yong-hong，et al.Simultaneous determination of four fluoroquinolones in biogas slurry by high performance liquid chromatography with fluorescence detection［J］.Journal of Agro-Environment Science，2016，35（10）:2034-2040.

2016-04-01

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)（2012ZX07101-009）；國(guó)家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303089）

賀南南（1991—），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橛袡C(jī)污染物環(huán)境行為與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)。E-mail：2014103026@njau.edu.cn

*通信作者：羅朝暉E-mail：lzhui@niau.edu.cn；趙海燕E-mail：haiyanzhao@njau.edu.cn