泰山螭霖魚線粒體COⅠ基因序列的遺傳多樣性分析

楊 玲，鞏俊霞，付佩勝，李 嫻，張金路

(山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室，農業(yè)部黃河下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，山東省淡水漁業(yè)研究院，山東濟南 250117)

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泰山螭霖魚線粒體COⅠ基因序列的遺傳多樣性分析

楊 玲，鞏俊霞，付佩勝，李 嫻，張金路*

(山東省淡水水產遺傳育種重點實驗室，農業(yè)部黃河下游漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，山東省淡水漁業(yè)研究院，山東濟南 250117)

[目的]通過克隆泰山螭霖魚的COⅠ基因序列，研究其與鯉科幾屬魚類的進化關系，確定泰山螭霖魚的分類地位。[方法]以泰山螭霖魚30個個體為材料，對其線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)的部分序列進行PCR擴增和序列對比，檢測泰山螭霖魚的遺傳多樣性；計算泰山螭霖魚不同單倍型與GenBank中鯉科5個屬魚類的遺傳距離，采用聚類分析方法，構建NJ和UPGMA系統(tǒng)進化樹。[結果]30個個體泰山螭霖魚線粒體COⅠ基因片段長度約1 600 bp，無堿基的插入和缺失，純化并去除引物序列后獲得約1 493 bp的核苷酸序列，存在6種單倍型，共檢測到6個多態(tài)位點，包括4個轉化、2個顛換，其單倍型多樣性(Hd)為0.460，核苷酸多樣性(Pi)為0.000 78，平均核苷酸差異數(shù)(K)1.163。遺傳距離和NJ和UPGMA系統(tǒng)進化樹表明，泰山螭霖魚與多鱗白甲魚的COⅠ序列一致，泰山螭霖魚所在的突吻魚屬與光唇魚屬的親緣關系最近，與金線鲃屬、倒刺鲃屬、華鯪屬的親緣關系較遠。[結論]該研究為其種質資源的管理與保護及遺傳育種提供分子生物學依據(jù)。

泰山螭霖魚；COⅠ；遺傳多樣性

泰山螭霖魚(Varicorhinussp.)屬鯉科鲃亞科突吻魚屬，是生活在泰山海拔270～800 m山澗溪流中的一種小型野生魚類，其肉嫩味美、營養(yǎng)豐富，具有獨特的藥用保健價值[1]，是泰山特有的珍貴生物，也是我國“五大貢魚”之一[2]。對于泰山螭霖魚的研究，自20世紀90年代起，魚類學者們對其生態(tài)習性和生物學特點、人工馴化和繁殖、解剖學、生長性能、染色體核型、同工酶[2-7]進行了研究,近年來，利用分子標記技術對泰山螭霖魚的遺傳多樣性和部分功能基因進行了研究[8-12]，在線粒體DNA的研究方面，陳紅菊[11]對其線粒體Cytb和D-loop進行研究，有關泰山螭霖魚線粒體COⅠ基因的研究鮮見報道。筆者通過克隆泰山螭霖魚的COⅠ基因序列，研究其與GenBank中同源性較高的鯉科幾屬魚類的進化關系，確定泰山螭霖魚的分類地位，以期為其種質資源的管理與保護及遺傳育種提供分子生物學依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料泰山螭霖魚取自泰安市泰山螭霖魚原種場，樣本數(shù)量為30個；PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成；DNA提取試劑盒(SK)購自上海生工生物技術有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2、Marker等為大連寶生物工程有限公司生產；PCR儀為TaKaRa TP650型。

1.2方法

1.2.1基因組DNA的提取。取泰山螭霖魚背部肌肌肉約20 mg，用DNA提取試劑盒(上海生工)提取樣品的基因組DNA，經OD260/OD280和瓊脂糖凝膠電泳來檢測所提取DNA的濃度和純度。

1.2.2引物設計及PCR擴增。根據(jù)GenBank(NC_NC_023799.1)中的相應序列設計引物，用于COⅠ基因序列的擴增，引物序列為CO-S：ACTCGGCTACCTTACCTGTGGC，CO- A： CTCGTTAGTTTGATTGAACT。

PCR擴增體系50 μL，其中, 10×Buffer(TaKaRa)5 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)4 μL，Taq酶(TaKaRa，5 U/μL)0.5μL，上、下游引物(10 μmol/L )各2 μL，模板DNA 2 μL，補足滅菌雙蒸水至50 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 50 s，53 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物技術有限公司，純化后采用上述引物進行雙向測序。

1.2.3序列分析。測序結果經DNASTAR軟件拼接并輔以人工校對，利用MEGA 6.06軟件，與從GenBank中查到的多鱗鏟頜魚相應序列(NC_NC_023799.1)用Clustal W進行比對分析，統(tǒng)計序列的堿基組成和轉換/顛換比率(Ts/Tvratios)、變異位點，采用Kimura 2-parameter模型計算個體間的遺傳距離，鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建單倍型分子系統(tǒng)樹，自舉檢測(bootstrap)1 000次計算各分支置信度；采用DNASP v5.10軟件計算單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)和平均核苷酸差異數(shù)(K)。

2　結果與分析

2.1PCR擴增結果采用引物CO-S和CO-A對30尾泰山螭霖魚的基因組DNA進行PCR擴增，結果均擴增出一條約1 600 bp的條帶(圖1)。

2.2COⅠ基因片段的序列分析

2.2.1序列分析。泰山螭霖魚30個樣本線粒體COⅠ基因的測序結果經DNASTAR軟件拼接并輔以人工校對，去除部分端序列后，獲得1 493 bp的片段。采用MEGA 6.06軟件經BLAST分析，該片段與GenBank中多鱗白甲魚(KF999680.1)的COⅠ基因片段同源性高達100%，確定該產物為泰山螭霖魚COⅠ基因的部分序列。

注：1～24為泰山螭霖魚個體；M為DL2000 Marker。Note：1-24.V.macrolepis individuals，M.DL2000 Marker.圖1　COⅠ基因PCR產物電泳結果Fig.1　Electrophoresis map of COⅠ gene PCR products of V.macrolepis

用MGEA 6.06 軟件對測得序列進行比對分析，在測定的1 493 bp片段中，無堿基的插入與缺失，其中，保守位點1 487個，變異位點6個，占整個序列的0.4%，簡約信息位點4個，占整個序列的0.27%。變異位點包括4個轉換(transition)、2個顛換(transversion)，轉換顛換比(Ts/Tv)為2∶1，堿基替換均發(fā)生在第3位密碼子上，所編碼的氨基酸無變化。

用DNASP v5.10 軟件分析30個樣本COⅠ序列，共檢測到6種單倍型(表1)，絕大多數(shù)個體為單倍型Hap-1，其余5種單倍型出現(xiàn)的頻率較低，分別為 1～3個樣本。

表1　泰山螭霖魚COⅠ序列的核苷酸變異位點及各單倍型的分布

2.2.2堿基組成和遺傳距離。采用MGEA 6.06軟件統(tǒng)計泰山螭霖魚COⅠ基因片段的堿基含量，其平均為T 28.5%、C 26.9%、A 26.8%、G 17.8%。G+C含量(44.7%)略低于A+T含量(55.3%)，其中，堿基G在1、2、3位的含量變化很大，分別為30.3%、14.9%和8.3%?；贙imura-2-parameter計算遺傳距離，自舉檢測(bootstrap)1 000次計算各分支置信度，30個樣品的相對遺傳距離為0～0.403。

泰山螭霖魚COⅠ基因6種單倍型與GenBank中的鯉科部分魚類的遺傳距離見表2。由表2可知，泰山螭霖魚6個單倍型間的遺傳距離在0.07～0.41，泰山螭霖魚單倍型(Hap-1)與多鱗白甲魚(O.macrolepis)的遺傳距離為0，與鏟頜魚屬的遺傳距離也較近，為10.37，其次是光唇魚屬，再次是倒刺鲃屬，與華鯪屬和金線鲃屬的遺傳距離最遠。

2.2.3遺傳多樣性分析。利用DNASP v5.10軟件分析30個泰山螭霖魚樣品COⅠ基因的遺傳多樣性，結果表明，其單倍型數(shù)為6，單倍型多樣性(Hd)為0.460，核苷酸多樣性(Pi)為0.000 78，平均核苷酸差異數(shù)(K)為1.163，遺傳多樣性處于較低水平。

2.2.4聚類分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。利用MGEA 6.06構建了泰山螭霖魚30個樣品的UPGMA系統(tǒng)樹(圖2)。由圖2可知，30個樣品可聚為2個主要分支。將泰山螭霖魚COⅠ基因6個單倍型序列與GenBank中同源性較高的鯉科突吻魚屬(白甲魚屬)(Varicorhinus、Onychostoma)、光唇魚屬(Acrossocheilus)、倒刺鲃屬(Spinibarbus)、華鯪屬(Sinilabeo)、金線鲃屬(Sinocyclocheilus)的幾種魚類同源序列進行聚類分析，采用雙參數(shù)模型(Kimura 2-parameter)作為距離參數(shù)，分別以鄰接法(neighber-joining，NJ)和UPGMA法構建分子系統(tǒng)樹，自舉檢測(bootstrap)1 000次計算各分支置信度(圖3、4)。由圖3、4可知，5個屬的魚類可分為2個大的分支，突吻魚屬與光唇魚屬聚為一大類，倒刺鲃屬、金線鲃屬、華鯪屬魚類聚為一大類。泰山螭霖魚的6個單倍型先與多鱗白甲魚聚在一起，再與粗須白甲魚、小口白甲魚聚在一起，然后與臺灣鏟頜魚聚在一起；與稀有白甲魚、高體白甲魚及光唇魚屬幾種魚類的親緣關系次之，與倒刺鲃屬、金線鲃屬、華鯪屬的親緣關系較遠。

表2　泰山螭霖魚6種單倍型與鯉科魚類的遺傳距離

圖2　30個泰山螭霖魚個體的UPGMA系統(tǒng)樹Fig.2　UPGMA dendrogram of 30 individuals of V.macrolepis

注：O.macrolepis.多鱗白甲魚；O.barbatum.粗須白甲魚；O.lini.小口白甲魚；V.barbatulus.臺灣鏟頜魚；A.barbodon.光唇魚；O.alticorpus.高體白甲魚；A.yunnanensis.云南光唇魚；O.rara.稀有白甲魚；A.monticola.寬口光唇魚；A.stenotaeniatus.窄條光唇魚；A.fasciatus.光唇魚；A.sparallens.側條光唇魚；A.hemispinus.半刺光唇魚；Si.rhinocerous.犀角金線鲃；Sp.sinensis.中華倒刺鲃；Bangana tungting.洞庭華鯪；S.denticulatus.倒刺鲃；S.caldwelli.黑脊倒刺鲃。圖3　基于COⅠ序列構建的NJ系統(tǒng)樹 Fig.3　Molecular phylogenetic tree of V.macrolepis based on COⅠ sequence(NJ)

注：O.macrolepis.多鱗白甲魚；O.barbatum.粗須白甲魚；O.lini.小口白甲魚；V.barbatulus.臺灣鏟頜魚；A.barbodon.光唇魚；O.alticorpus.高體白甲魚；A.yunnanensis.云南光唇魚；O.rara.稀有白甲魚；A.monticola.寬口光唇魚；A.stenotaeniatus.窄條光唇魚；A.fasciatus.光唇魚；A.sparallens.側條光唇魚；A.hemispinus.半刺光唇魚；Si.rhinocerous.犀角金線鲃；Sp.sinensis.中華倒刺鲃；Bangana tungting.洞庭華鯪；S.denticulatus.倒刺鲃；S.caldwelli.黑脊倒刺鲃。圖4　基于COⅠ序列構建的UPGMA系統(tǒng)樹Fig.4　Molecular phylogenetic tree of V.macrolepis based on COⅠ sequence(UPGMA)

3　討論

(1)線粒體DNA具有進化速度快、變異性大、母系遺傳及易于擴增等優(yōu)點，是研究種內和種間進化關系和遺傳多樣性的有效分子標記，而線粒體COⅠ基因進化速度較快，適合種群水平差異的檢測，也可用于種間分析。彭士明等[13]、馬凌波等[14]、姜虎成等[15]、朱立靜等[16]通過分析銀鯧、青蟹、日本沼蝦、四角蛤喇等物種群體的線粒體COⅠ基因序列差異，研究其遺傳結構和系統(tǒng)演化。該研究通過分析泰山螭霖魚COⅠ基因序列的差異及其與鯉科幾屬魚類同源序列的進化關系，探討其遺傳結構、遺傳分化和系統(tǒng)演化關系。

(2)種群的遺傳多樣性水平是反映物種遺傳背景的資料，該研究表明，泰山螭霖魚30個樣本擴增的COⅠ基因1 493 bp片段中，有6個突變位點，存在6種單倍型，核苷酸多樣性(Pi)為0.000 78，平均核苷酸差異數(shù)(K)為1.163，其單倍型多樣性(Hd)為0.460，表明泰山螭霖魚群體具有較低的遺傳多樣性水平。這與公維華等[8]及郭金峰[9]的研究結果相似，他們分別利用微衛(wèi)星標記研究了泰山螭霖魚的遺傳多樣性，結果表明，泰山螭霖魚野生群體和養(yǎng)殖群體遺傳結構無差異，是一個非常純合的群體。這是由泰山螭霖魚生存環(huán)境和生活習性所決定的，它生存于泰山，分布在海拔270～800 m的山澗中，不與外界水域交流，加之群體數(shù)量小，經長期的近交繁殖和瓶頸效應，多數(shù)基因已純合，另外，環(huán)境的選擇壓力對其影響不大，形成基因突變和重組的概率很小，故出現(xiàn)遺傳多樣性降低的現(xiàn)象。

(3)關于突吻魚屬的分類地位，有學者認為突吻魚屬是白甲魚屬的同物異名，伍獻文等[17]研究了我國的標本后，認為白甲魚亞屬(Onychostoma)和鏟頜魚亞屬(Scaphesthes)是突吻魚屬(Varicorhinus)的2個亞屬。

關于泰山螭霖魚的分類地位，有學者認為是多鱗鏟頜魚，該研究通過對泰山螭霖魚與同亞科其他屬魚類基于COⅠ基因的聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析，結果表明，泰山螭霖魚6個單倍型中，絕大多數(shù)個體COⅠ序列單倍型為Hap1，與突吻魚屬(白甲魚屬)的多鱗白甲魚(O.macrolepis)的COⅠ序列完全一致，在突吻魚屬內，泰山螭霖魚先與多鱗白甲魚聚在一起，然后與粗須白甲魚、小口白甲魚聚在一起，再與臺灣鏟頜魚聚為一類。泰山螭霖魚所在的突吻魚屬與鯉科幾屬魚類的親緣關系：與光唇魚屬的關系最近，與金線鲃屬、倒刺鲃屬、華鯪屬的親緣關系較遠。

該研究結果與陳紅菊[11]的研究結果有所不同，陳紅菊[11]通過對泰山螭霖魚線粒體Cytb序列分析，發(fā)現(xiàn)泰山螭霖魚和多鱗鏟頜魚聚在一起，確定泰山螭霖魚為多鱗鏟頜魚。泰山螭霖魚與光唇魚屬的關系最近，其次是倒刺鲃屬，與四須鲃屬和金線鲃屬的關系較遠。

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Study on Genetic Diversity ofVaricorhinusmacrolepisBased onCOⅠ Gene Sequences

YANG Ling, GONG Jun-xia,FU Pei-sheng,ZHANG Jin-lu*

(Key Laboratory of Genetic and Breeding of Freshwater Aquaculture in Shandong Province, The Yellow River Downstream Fishery Resources and Environmental Scientific Observing Station of Ministry of Agriculture, Freshwater Fishery Research Institute of Shandong Province, Jinan, Shandong 250117)

[Objective] Through cloningCOⅠ gene sequence ofVaricorhinusmacrolepis, its evolutionary relationship with other genus fish in Cyprinidae was studied, the classification status ofV.macrolepiswas determined. [Method] 30V.macrolepiswere used as experimental materials, mitochondrial cytochrome oxidase subunit Ⅰ(COⅠ) gene fragment was amplified using PCR technique and aligned of sequence, genetic diversity ofV.macrolepiswas detected,and genetic distance between different haplotypes ofV.macrolepiand 5 genus of Cyprinidae in GenBank was calculated. Clustering analysis was used to build NJ and UPGMA phylogenetic tree. [Result] The results showed that theCOⅠgene fragment PCR products of 30V.macrolepiswere about 1 600 bp, and no insertion/deletionwas observed, 1 493 bp nucleotide sequences were determined after being purified and excluded the primer sequence. There were 6 haplotypes, and 6 polymorphic sites were detected, including 4 transition sites and 2 transversion sites. Haplotype diversity (Hd) ofV.macrolepiswas 0.460, nucleotide diversity (Pi) was 0.000 78, average number of nucleotide differences (K) was 1.163. Genetic distance and NJ UPGMA phylogenetic trees showed that the sequences ofV.macrolepisandO.macrolepisare the same. The genetic relationship betweenVaricorhinusandAcrossocheiluswas the closest, while the genetic relationship betweenVaricorhinusandSpinibarbus,Sinilabeo,Sinocyclocheiluswere far. [Conclusion] The study can provide molecular biology basis for management, protection and genetic breeding of germplasm resources.

Varicorhinusmacrolepis;COⅠ Gene; Genetic diversity

山東省農業(yè)良種工程項目“水產經濟生物種質資源收集保護與評價”子課題三“淡水水產經濟生物種質資源收集、保護與評價”；山東省現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)體系魚類創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-12-04)。

楊玲(1967- )，女，山東濟南人，研究員，從事魚類遺傳育種研究。*通訊作者，高級工程師，從事生態(tài)漁業(yè)研究。

2016-07-15

S 917；Q958.1

A

0517-6611(2016)27-0127-04