基于量子點熒光探針的高靈敏蛋白質(zhì)檢測方法

吳思敏， 賈春平， 劉莉芬， 郜晚蕾， 景奉香，金慶輝， 張紅鋒， 趙建龍

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上?！?00241；2.中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室，上海　200050）

基于量子點熒光探針的高靈敏蛋白質(zhì)檢測方法

吳思敏1，2， 賈春平2， 劉莉芬2， 郜晚蕾2， 景奉香2，金慶輝2， 張紅鋒1， 趙建龍2

（1.華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200241；2.中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所傳感技術(shù)聯(lián)合國家重點實驗室，上海200050）

通過制備量子點熒光檢測探針，構(gòu)建了一種基于量子點探針和免疫磁珠的蛋白質(zhì)檢測方法，實現(xiàn)了對蛋白腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的高靈敏定量檢測.在該檢測體系中，若存在有靶標(biāo)蛋白，其與量子點檢測探針以及捕獲探針之間會發(fā)生免疫反應(yīng)形成三明治結(jié)構(gòu)，利用磁力分離器對免疫復(fù)合物進行富集后，通過檢測富集在磁珠表面的量子點熒光信號，可實現(xiàn)對靶標(biāo)蛋白的定量.該方法的檢測靈敏度為38 pg/mL，線性范圍為0.39～50 ng/mL，臨床質(zhì)控樣本檢驗結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，可重復(fù)性好，可應(yīng)用于臨床樣本檢測.該量子點探針檢測體系具有靈敏度高、特異性好、樣品消耗量低等優(yōu)點，在疾病早期診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景.

量子點； 免疫熒光分析； 免疫磁珠； 腫瘤標(biāo)志物

0　引　言

腫瘤標(biāo)志物的高靈敏度檢測對于癌癥的早期預(yù)警及其監(jiān)測具有十分重要的意義［1］.研究表明，隨著癌癥的發(fā)生與發(fā)展，血清等體液中蛋白質(zhì)等腫瘤標(biāo)志物的含量會增加.通過分析正常個體與癌癥患者之間存在差異的化學(xué)類物質(zhì)的種類和含量，分子篩查能夠較形態(tài)學(xué)方法更早地檢測到肺癌的發(fā)生與發(fā)展［2-3］.故而，發(fā)展準(zhǔn)確簡便的蛋白質(zhì)定量方法應(yīng)用于腫瘤早期檢測對降低癌癥死亡率具有重大意義.

量子點作為一種新穎的半導(dǎo)體納米材料，所表現(xiàn)出來的獨特光學(xué)特性、理化性質(zhì)以及生物相容性，使其迅速成為一種備受矚目的熒光標(biāo)記物，被廣泛應(yīng)用在生物成像、核酸和蛋白質(zhì)檢測等方面［4-7］.隨著量子點合成、制備工藝的發(fā)展，目前可以獲得量子產(chǎn)率高達90%的量子點，另外，量子點還具有大的摩爾消光系數(shù)（105～107mol-1·cm-1）［8］，這使得其具有傳統(tǒng)熒光染料難以比擬的強熒光性［9-10］.除此之外，量子點還具有吸收譜寬、發(fā)射譜窄（半峰全寬約為25～35 nm）、斯托克斯位移寬、光穩(wěn)定性好、抗光漂白能力以及抗化學(xué)試劑淬滅能力強等特點.這些性質(zhì)都使得量子點成為優(yōu)異的熒光示蹤物，將其應(yīng)用于免疫分析不僅能夠?qū)崿F(xiàn)檢測靈敏度的大幅提高，而且由于量子點具有發(fā)射波長隨尺寸可調(diào)的特性，因此還具備拓展到多通道、多指標(biāo)同步檢測的能力［11-12］.

近年來，利用磁性微球作為固相載體設(shè)計免疫檢測的方法倍受青睞，這主要歸功于磁性微球獨特的物理化學(xué)性質(zhì)［13-15］.首先，磁性微球具有高的體表比，豐富的表面活性基團以及良好的生物相容性，能夠和DNA、酶及抗體等生物物質(zhì)偶聯(lián)，易于實現(xiàn)生物功能化；其次，磁性微球具有好的穩(wěn)定性，能耐受一定酸堿度的溶液，這使其能夠應(yīng)用在多種反應(yīng)中；再次磁性微球的懸浮穩(wěn)定性好，能夠均勻分散在液相溶液中，為免疫識別提供了優(yōu)異的反應(yīng)微環(huán)境，故而能夠獲得更優(yōu)異的動力學(xué)表現(xiàn)；不僅如此，因其具備的超順磁性，可以簡便高效地實現(xiàn)與其他物質(zhì)的分離與純化.

本研究通過對磁性微球進行功能化制備成捕獲探針，將量子點作為示蹤物標(biāo)記在檢測抗體上形成檢測探針，以癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）為靶標(biāo)物質(zhì)［6］，構(gòu)建了一種新型蛋白質(zhì)熒光免疫分析方法.當(dāng)靶標(biāo)CEA存在時，會發(fā)生免疫識別反應(yīng)形成免疫夾心結(jié)構(gòu)磁珠—抗體—抗原—抗體—量子點，通過對被限制在磁性微球表面的量子點進行熒光成像分析，可實現(xiàn)對CEA的高靈敏的檢測.該方法不僅特異性好、檢測范圍寬，而且操作簡便、樣品消耗量低、設(shè)備要求低，極具臨床應(yīng)用前景.

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑

牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）、2-嗎啉乙磺酸（2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid，MES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylamino）-propyl-3-ethylcarbodiimide-hydrochloride，EDC）和 N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysulfosuccinimide，NHS）均購自Sigma-Aldrich公司；癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）相應(yīng)的捕獲及檢測單克隆抗體對購自美國Fitzgerald公司；羧基修飾的磁珠（粒徑6.5μm）購自美國Spherotech公司；量子點（QD-605）、琥珀酰亞胺-4-環(huán)已烷-1-碳酸酯（succinimidyl trans-4-（N-maleimidomethyl）cyclohexane-1-carboxylate，SMCC）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol）購自中國武漢珈源量子點公司.血清稀釋液（serumdiluent）購自美國Immunochemistry公司.其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水（Millipore，Milli-Q）.磁珠儲存液（10 mmol/L PBS，pH 7.4，0.1%BSA，0.02%Tween 20），洗液（10 mmol/L PBS，pH 7.4，0.05%Tween 20）.

1.1.2儀器

熒光顯微鏡（OLYMPLUS，BX51）；高速離心機（Eppendorf，5804R）；分子雜交儀（興化市儀器分析廠，F(xiàn)YY-3）.

1.2方法

1.2.1免疫磁珠捕獲探針的制備與表征

EDC與羧基反應(yīng)形成O-?；惲螂逯虚g體，在NHS存在下，該中間體可以轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邪被磻?yīng)活性的活性酯，從而實現(xiàn)對羧基和氨基的共價偶聯(lián).按照磁珠說明書中的方法用癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen，CEA）捕獲抗體標(biāo)記免疫磁珠.首先，吸取磁珠儲存液后，依次用dH2O和磷酸二氫鈉（100 mmol/L，pH 6.2）溶液對磁性微球進行清洗；依次加入10 μL的NHS（50 mg/mL）和EDC（50 mg/mL）溶液，室溫下孵育20 min，進行活化；去上清后吸取250 μL MES（50 mmol/L，pH 5.0），清洗2遍后加入單克隆CEA捕獲抗體，于25℃雜交儀中孵育1 h；隨后用磁珠儲存液清洗2遍后重懸，并儲存于4℃?zhèn)溆?

免疫磁珠探針制備完成后，吸取4 μL和空白對照組同時與0.5 μL標(biāo)記有綠色熒光的二抗（Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG；2 mg/mL）于37℃孵育1 h，結(jié)果如圖1所示，表明磁珠上已標(biāo)記上捕獲抗體.

1.2.2量子點檢測探針的制備

SMCC一端為NHS酯基團，另一端為馬來酰亞胺基團，有NHS酯基團的一端可以與氨基量子點上的伯氨反應(yīng)形成穩(wěn)定的酰胺鍵，另外一端可以與經(jīng)還原的抗體上的巰基發(fā)生特異性交聯(lián)［16-17］.按照武漢珈源量子點公司提供的操作說明進行如下操作：首先，取10 μL 10 mmol/L SMCC對100 μL的氨基量子點（CdSe）進行活化，25℃，60 min；隨后采取脫鹽柱的方法進行純化；用20 mmol/L DTT對300 μL CEA抗體進行還原，25℃，30 min；待脫鹽柱去除未反應(yīng)的抗體和其他雜質(zhì)后，將其與純化后的活化量子點于雜交儀中孵育，25℃，1 h；加入10 μL β-巰基乙醇終止反應(yīng)，分離純化后保存于10 mmol/L PBS（pH 7.2）中，4℃?zhèn)溆?

圖1　磁珠探針標(biāo)記前后的熒光顯微鏡照片F(xiàn)ig.1　Fluorescence microscope photos of the labled immune magnetic beads

按照上述步驟制備好的量子點熒光探針利用瓊脂糖凝膠電泳圖進行表征.結(jié)果如圖2所示：量子點熒光探針由于結(jié)合了抗體，分子量變大，其遷移速率變慢.這表明，量子點熒光探針制備成功.

圖2　量子點熒光探針標(biāo)記前后瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2　Photoimages of gel electrophoresis of IgG-QDs and SMCC-QDs

1.2.3免疫檢測

用1%BSA封閉免疫磁珠探針15 min后（雜交儀，25℃，輕搖），加入2 μL CEA抗原及量子點檢測探針，雜交儀37℃輕搖孵育1 h；基于免疫特異性識別，磁珠捕獲探針、CEA、量子點檢測探針形成免疫夾心結(jié)構(gòu)；隨后，用洗液清洗2遍，去除未結(jié)合的抗原以及量子點探針；磁珠重懸后吸取0.5 μL滴至清潔后載玻片上，選擇5個以上視野進行熒光顯微拍照，對所得圖片進行灰度值分析.

圖3　量子點探針檢測蛋白原理圖Fig.3　Schematic of the basic principles of the proposed assay

1.2.4熒光成像分析

所有熒光圖像均用Gray Quantifier分析軟件進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計磁珠（100＜n＜300）表面結(jié)合的量子點產(chǎn)生的熒光強度，分析結(jié)果用平均數(shù)（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示.

2　結(jié)　果

2.1量子點探針加入量的優(yōu)化

磁珠探針量確定后，量子點檢測探針加入量的不同，會影響方法的分析效果［18］.當(dāng)量子點探針數(shù)目過少時，會造成檢測范圍受限，信號強度變低，易漏檢；而過多，不僅背景信號或非特異性信號增強，信噪比下降，損耗最低檢測限，而且還存在經(jīng)濟上的浪費.

實驗結(jié)果如圖4所示.磁珠個數(shù)為7 500顆，量子點探針的終濃度在0.312 5～5 nmol/L時，熒光強度呈增加趨勢，在5 nmol/L時已獲得最大熒光強度，即免疫反應(yīng)程度已達最大化，此后再增加量子點探針的加入量，熒光強度變化平緩，進入飽和期.故而在接下來的實驗中，磁珠數(shù)目為7 500時，選擇5 nmol/L作為量子點探針的最適加入量.

圖4　量子點探針加入量對熒光強度結(jié)果的影響Fig.4　Effect of QD probes quantity on the detection results

2.2免疫反應(yīng)檢測CEA

圖5是基于2.1優(yōu)化的實驗條件下，用本方法檢測不同濃度的CEA標(biāo)準(zhǔn)品獲得的熒光圖片，可以看出，隨著CEA濃度的升高，單個磁珠上的平均熒光強度隨之增強.將熒光圖像用Gray Quantifier分析軟件進行統(tǒng)計分析，繪得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示，表明CEA濃度在0. 39～50 ng/mL范圍進行線性擬合，方程為lgy=0.586 9lgx+3.572 23（R2=0.988），線性關(guān)系良好.將檢測信號高于空白對照（不含CEA的緩沖液作為樣品）信號的平均值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差定義為檢測限，算得該方法的檢測限為38 pg/mL，遠(yuǎn)低于CEA的臨床閾值（5 ng/ mL）［6］，滿足臨床應(yīng)用需求.

掃描電子顯微鏡（SEM）照片（見圖7）可以看出，磁珠表面粗糙程度增加，表明磁珠上免疫反應(yīng)進行順利.

2.3特異性

圖5　量子點探針檢測CEA的熒光圖像Fig.5　Fluorescence images for the detection of CEA

圖6　量子點探針檢測CEA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Standard curve for the detection of CEA

圖7　磁珠探針（a）標(biāo)記前、（b）標(biāo)記后及（c）反應(yīng)完成后的掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.7　SEM images of（a）the carboxylic magnetic beads（MBs），（b）MBs-Ab1，and（c）MBs-Ab1/CEA/Ab2-QDs

為了考察基于量子點檢測探針的免疫方法對CEA檢測的特異性，用這個方法同時檢測了非特異性抗原細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin-19 fragments，CYRFA 21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）和牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）.結(jié)果（見圖8）表明，在沒有靶標(biāo)CEA的情形下，即使非特異性抗原濃度很高（62.5 ng/mL）也不能引起免疫夾心結(jié)構(gòu)的形成，確定了該方法對靶標(biāo)CEA檢測的特異性［19］.

圖8　CEA檢測特異性Fig.8　Specificity analysis of the immunoassay

2.4準(zhǔn)確度和可重復(fù)性的驗證

取3份已知CEA濃度的質(zhì)量控制血清用該方法進行檢測，計算出相對誤差與差異系數(shù)分別用以衡量檢測方法的可重復(fù)性與準(zhǔn)確度.每份樣本檢測3次，結(jié)果如表1所示，表明該方法具有穩(wěn)定的可重復(fù)性和良好的準(zhǔn)確度，具有臨床應(yīng)用價值［20］.

表1　血清CEA含量檢測Tab.1　Detection of CEA in human serum

3　討　論

本方法通過綜合利用量子點和磁性微球這兩種材料，實現(xiàn)了對腫瘤標(biāo)志物CEA特異性好、靈敏度高的檢測.結(jié)果顯示，檢測靈敏度為38 pg/mL，而傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA）方法檢測CEA的靈敏度為1.6 ng/mL［21］，提高了約40倍.這主要是由于以下原因：①量子點優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)；②以免疫磁珠作為固相支持物能夠獲得更好的動力學(xué)表現(xiàn)，免疫反應(yīng)更充分；③免疫反應(yīng)發(fā)生在免疫磁珠表面，量子點信號被限制在一個小的區(qū)域，而且易于富集；④實驗過程中一系列為降低非特異性吸附采取的措施.具體分析如下.

免疫分析的基本原理是通過監(jiān)測由抗原、抗體之間的特異性識別引發(fā)的光學(xué)、電學(xué)、機械學(xué)以及磁性等信號的改變對靶標(biāo)腫瘤標(biāo)志物進行定性定量［22］.因而標(biāo)記物的信號強度及其檢測手段與免疫分析的表現(xiàn)密切相關(guān).作為一種新型熒光納米材料，量子點具有傳統(tǒng)熒光染料不可比擬的優(yōu)勢［23］.首先，量子點具有更高的熒光強度且抗光淬滅能力強，能夠得到更穩(wěn)定、更強的光學(xué)信號，實現(xiàn)靈敏度更高的檢測；其次，量子點具有寬的斯托克斯（Stocks）位移，激發(fā)光對發(fā)射光的干擾較小，能夠提高檢測的準(zhǔn)確度.

另外，以磁性微球作為免疫反應(yīng)的固相支持物對蛋白質(zhì)檢測方法也具有重要意義.因其具備的超順磁性，無需復(fù)雜的設(shè)備（如離心機），僅借助磁鐵，便可簡便高效地實現(xiàn)與其他物質(zhì)的分離與純化，故而被廣泛應(yīng)用于免疫檢測、細(xì)胞分離和生物大分子純化等領(lǐng)域.不僅如此，磁性微球具有的高體表比，使其表面能結(jié)合大量抗體，伴隨著輕微震蕩，磁性微球能夠均勻地分散在體系中，大大提高了抗原與抗體的結(jié)合效率，具有較以平板作為支持物更佳的動力學(xué)表現(xiàn)［13-14］.

目前針對量子點信號的讀取方式主要有兩種，光譜分析和熒光圖像分析.光譜分析主要是通過記錄量子點發(fā)射峰的峰值來實現(xiàn)定量的目的，此方法對樣本體積量要求大，導(dǎo)致量子點產(chǎn)生的熒光信號會被分散在一個較大的體積內(nèi)（通常是0.1～1 mL），故而需要更多的量子點才能產(chǎn)生區(qū)別于背景信號的信號強度［24］.而本方法是通過熒光成像分析方法對富集在磁珠表面的量子點熒光信號進行直接讀取.量子點信號被富集在直徑為6.5 μm的磁珠表面，靈敏度得到較大的提升.此外，量子點具有寬吸收窄發(fā)射、發(fā)射波長隨尺寸可調(diào)性等優(yōu)異光學(xué)特性，不同尺寸量子點在單一激發(fā)光源的激發(fā)下，能夠發(fā)射出不同波長也即不同顏色的熒光，通過對熒光圖像中諸如顏色、面積和強度等特征進行分析，可以同時實現(xiàn)對靶標(biāo)物質(zhì)的定性與定量的雙重目的，從而實現(xiàn)對多種標(biāo)志物的聯(lián)合檢測.

本方法通過綜合利用量子點和磁性微球這兩種材料，實現(xiàn)了對CEA特異性好、靈敏度高的檢測.除此之外，在實驗過程中選用特異性高的單克隆抗體對完成免疫識別，對進行磁珠探針表面未結(jié)合的位點進行封閉，用含有0.05%TWEEN 20的洗液對免疫復(fù)合物進行兩遍清洗，這些操作都能有效降低非特異性吸附，提高信噪比，進而獲得實驗的檢測靈敏度.

除靈敏度外，分析檢測范圍、特異性、準(zhǔn)確度和可重復(fù)性也是衡量一個分析方法優(yōu)劣的基本參數(shù).實驗結(jié)果表明，該方法的特異性優(yōu)，準(zhǔn)確度和可重復(fù)性表現(xiàn)好，這與篩選的單克隆抗體對具有高的特異性有關(guān).而對于分析檢測范圍，本實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍在0.39～50 ng/mL之間，滿足肺癌早期預(yù)警的臨床需求.當(dāng)樣本中CEA含量過高時，可通過稀釋樣本或者增多磁珠數(shù)目進行調(diào)節(jié)，反之，也可以通過減少磁珠的量或者增大樣品體積進行調(diào)節(jié).

4　結(jié)　論

本文介紹了一種基于量子點探針和磁性微球的蛋白質(zhì)檢測方法，該方法利用量子點作為熒光標(biāo)記物，同時利用磁性微球作為固相支持物，實現(xiàn)了通過普通光學(xué)儀器對CEA特異性好、靈敏度高、樣品消耗量少的定量檢測.該方法操作步驟簡單，所需儀器設(shè)備普及，對蛋白質(zhì)檢測具有普遍適用性，在疾病早期診斷領(lǐng)域具有廣闊的前景.

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（責(zé)任編輯：張晶）

Ultrasensitive detection of protein biomarker using fluorescent quantum dot probes

WU Si-min1，2， JIA Chun-ping2， LIU Li-fen2， GAO Wan-lei2， JING Feng-xiang2，JIN Qing-hui2， ZHANG Hong-feng1， ZHAO Jian-long2
（1.School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai200241，China；2.State Key Laboratory of Transducer Technology，Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology，Chinese Academy of Sciences，Shanghai200050，China）

In this study，based on the unique properties of quantum dots（QDs）and immune magnetic beads，an fluorescent assay was built to detect low concentration carcinoembryonic antigen（CEA）.The assay was carried out in a sandwich formation in which two antibodies simultaneously recognized two separate binding sites on the same target CEA.After enrichment with magnetic separator，the fluorescent intensities produced by the QDs，which were confined to the surface of the beads，could be read efficiently to quantify the concentration of the CEA.For this assay，the limit of detection was 38 pg/mL with the linear range was from 0.39 to 50 ng/mL，and it has been proved with high accuracy and repeatability in tumor marker control.With the high sensitivity，specificity and low sample consumption，this method takes a big step to the early diagnosis of diseases.

quantum dots； immunofluorescence assay； magnetic beads； tumor marker

N39；Q71；R730.45

A

10.3969/j.issn.1000-5641.2016.02.016

1000-5641（2016）02-0144-09

2015-03

國家重點基礎(chǔ)發(fā)展計劃（2012CB933303）；國家自然科學(xué)基金（81101645，61271162，81472751，21405167）；上海市科委項目（12nm0503702，11JC1414400，BRC2012002）；東南大學(xué)生物電子學(xué)國家重點實驗室開放研究項目

吳思敏，女，碩士研究生，研究方向為腫瘤生物學(xué).E-mail：wusimin_mail@163.com.

張紅鋒，女，副教授，碩士研究生，研究方向為腫瘤生物學(xué). E-mail：hfzhang@bio.ecnu.edu.cn.賈春平，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向為生物傳感器.E-mail：jiachp@mail.sim.ac.cn.