金紋細蛾Hsp90基因片段的克隆及其表達模式分析

王冠華，李　鑫，郭長寧，于建光，侯　茜，辛　文

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，應(yīng)用昆蟲學(xué)重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

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金紋細蛾Hsp90基因片段的克隆及其表達模式分析

王冠華，李鑫，郭長寧，于建光，侯茜，辛文

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護學(xué)院，應(yīng)用昆蟲學(xué)重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

【目的】 對金紋細蛾Hsp90基因進行生物信息學(xué)和表達模式分析，為深入研究金紋細蛾P(guān)rHsp90與生長發(fā)育和抗逆行為的關(guān)系奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?利用分子克隆技術(shù)獲得金紋細蛾Hsp90基因片段，并對其進行生物信息學(xué)分析。同時利用RT-qPCR技術(shù)檢測Hsp90在金紋細蛾不同組織、不同生長發(fā)育階段和高溫脅迫后的表達情況。【結(jié)果】 獲得了金紋細蛾Hsp90基因的一條長度為942 bp的片段序列，命名為PrHsp90，登錄號為KP671600。序列分析顯示，其對應(yīng)的氨基酸序列與其他昆蟲的相似性很高，與棉鈴蟲(ADP37710.1)、斜紋夜蛾(ADK55516.1)、煙夜蛾(ADM26742.1)等鱗翅目昆蟲的同源性在98%以上，表明Hsp90基因家族具有高度保守性。實時熒光定量結(jié)果表明，PrHsp90在金紋細蛾翅中的相對表達量顯著高于頭、胸、腹和足；金紋細蛾各個生長發(fā)育階段都有PrHsp90表達，但其在成蟲體內(nèi)的相對表達量顯著高于蛹期和幼蟲期。高溫脅迫下PrHsp90的表達水平隨著溫度的升高而升高，且經(jīng)過35，38，41和44 ℃處理后的金紋細蛾，其體內(nèi)PrHsp90相對表達量均顯著提高，約為對照處理表達量的3～15倍?！窘Y(jié)論】 金紋細蛾P(guān)rHsp90的表達具有組織特異性，且在其生長發(fā)育的各個階段和溫度脅迫中均可能起重要作用。

金紋細蛾；熱激蛋白；生長發(fā)育；高溫脅迫

熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)或稱熱休克蛋白，是機體在應(yīng)激情況下細胞內(nèi)迅速合成的一組蛋白質(zhì)。熱激蛋白的誘導(dǎo)表達是昆蟲機體抵抗高溫脅迫的重要形式之一，在昆蟲的抗逆反應(yīng)中起著十分重要的作用[1]。HSPs可以分為5類，包括HSP100、HSP90、HSP70、HSP60和sHSPs[2]。HSP90家族是真核生物必不可少的一類高分子量分子伴侶。熱激蛋白的功能較多，已經(jīng)報道的有分子伴侶、耐熱性、耐冷性以及在昆蟲發(fā)育過程和細胞代謝中起生化作用的特殊功能等[3]。在低溫、高溫、氨基酸類似物、低氧、脫落酸(ABA)、2，4-二氯苯氧乙酸等環(huán)境下，會有熱休克蛋白的生成。溫度(例如高溫)是影響昆蟲生存、發(fā)育和繁殖的最主要因素之一。在長期進化的過程中，昆蟲已經(jīng)演化出很多行為和生理上的策略來應(yīng)對和避免溫度造成的損傷，例如通過調(diào)節(jié)體內(nèi)熱激蛋白(HSPs)的表達來抵抗不良溫度[4]。

金紋細蛾(Phyllonorycterringoniella)屬鱗翅目細蛾科，是蘋果等果樹上一種常見的潛葉性害蟲，為東亞特有種[5]。金紋細蛾每年6月開始在果園大量出現(xiàn)，一直到10月其種群數(shù)量都在持續(xù)增長，即使在三伏天，果園的高溫高濕環(huán)境也難以阻止該蟲的持續(xù)發(fā)生。因此，探索該蟲的耐熱性機理，明確其在惡劣天氣下生存與發(fā)展的情況，對其防治管理有一定指導(dǎo)意義。前人主要從其發(fā)生規(guī)律、空間分布、天敵、綜合防治等方面進行了研究[5-9]，從分子生物學(xué)角度僅見對金紋細蛾幾丁質(zhì)酶基因克隆的報道[10]，而對于金紋細蛾熱激蛋白基因的研究尚未見相關(guān)報道。

為了從分子水平上了解金紋細蛾對高溫環(huán)境的適應(yīng)性，明確Hsp90基因在金紋細蛾抵抗高溫脅迫中的作用，本研究利用分子克隆技術(shù)獲得金紋細蛾Hsp90基因片段，并對其進行生物信息學(xué)分析，同時利用RT-PCR技術(shù)檢測Hsp90在金紋細蛾不同組織、不同生長發(fā)育階段和高溫脅迫后的表達情況，以期為深入研究金紋細蛾的溫度耐受性機制奠定基礎(chǔ)，并為進一步科學(xué)合理地制定該蟲的綜合防治策略提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1供試蟲源

金紋細蛾1～5齡幼蟲、蛹和成蟲均采自西北農(nóng)林科技大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)重點實驗室溫室。飼養(yǎng)條件為(26±1) ℃、光周期為16 h光/8 h暗、相對濕度(70±10)%。2014年7月，收集健康蟲源制備樣品。

1.2樣品制備

根據(jù)試驗設(shè)計共制備3組樣品，每組樣品均重復(fù)3次。第1組樣品為：金紋細蛾成蟲不同組織樣品。選取羽化后2日齡的金紋細蛾成蟲，解剖頭、胸、腹、足和翅5種組織后放入RNA保存液內(nèi)保存，以備后續(xù)使用。第2組樣品為：金紋細蛾不同發(fā)育階段的樣品。選取1～5齡金紋細蛾幼蟲、蛹和剛羽化的成蟲，每個階段取個體35個用于試驗。第3組樣品為：熱激處理后的樣品。每個處理選取4齡金紋細蛾幼蟲各30頭，轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，然后將離心管放入水浴鍋內(nèi)進行高溫?zé)峒ふT導(dǎo)，于29，32，35，38，41和44 ℃下分別處理1 h，26 ℃下恢復(fù)1 h，然后用液氮處理后置于-80 ℃冰箱中備用，以常溫26 ℃下的金紋細蛾4齡幼蟲為對照。

1.3金紋細蛾Hsp90基因的克隆與鑒定

利用GenBank數(shù)據(jù)庫下載近源昆蟲的Hsp90序列，ClustalW比對后，在保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并引物F1、R1(表1)。根據(jù)Trizol reagent kit試劑盒說明書提取金紋細蛾成蟲的總RNA?？俁NA的品質(zhì)和濃度在Maestro-NANO UV spectrophotometer核酸儀上用分光光度法測定。用SMARTerTMRACE cDNA (Clontech，美國)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板構(gòu)建普通PCR反應(yīng)體系，擴增金紋細蛾Hsp90目的基因片段。獲得目的片段，再設(shè)計3′端特異性引物(表1)，構(gòu)建普通PCR反應(yīng)體系，獲得目的基因全長。試驗中獲得的PCR產(chǎn)物均由上海生物工程有限公司測序。

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：12.5 μL 2×Mixture，cDNA及上、下游引物(10 μmol /L)各1 μL，9.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表 1　Hsp90基因片段擴增和實時熒光定量PCR所用到的引物序列Table 1　Primer sequences used for partial cDNA cloning of Hsp90 and real-time quantitative PCR

1.4序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用NCBI中的ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具，分析Hsp90可能的開放閱讀框并翻譯為氨基酸。用NCBI的Blastx比較Hsp90與其他昆蟲Hsp90基因的同源性，同時對其進行系統(tǒng)發(fā)育分析。從NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫下載其他不同物種的Hsp90氨基酸序列，利用ClastalW軟件對所有下載的Hsp90氨基酸序列和金紋細蛾的氨基酸序列進行比對，然后用Mega 5.02分析其演化關(guān)系，采用Neighbor-joining算法構(gòu)建進化樹，置信度設(shè)置為1 000[11]。

1.5總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

根據(jù)試驗設(shè)計，本次試驗共制備了3組樣品(見1.2節(jié))。對于每個樣品，均用Trizol reagent kit提取總RNA?？俁NA的品質(zhì)和濃度在Maestro-NANO UV spectrophotometer核酸儀上用分光光度法測定。合成第一鏈cDNA時各取每個樣品1 μg的RNA構(gòu)建20 μL的反應(yīng)體系，使用Oligo (dT)18引物和Moloney Murine Leukemia virus (M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶進行(TIANGEN公司)合成。

1.6Hsp90的RT-qPCR(實時熒光定量)表達分析

在完成每個樣品第一鏈cDNA的合成后，采用RT-qPCR技術(shù)在Bio-rad IQ5儀器上測定Hsp90的表達量。染料選用SYBR Green Mix (CWBIO，北京)。根據(jù)實驗室前期對內(nèi)參基因的篩選結(jié)果[12]，內(nèi)參基因選用β-actin(引物見表1)。每對定量引物通過5×稀釋的模板建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

RT-qPCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL 2×UltraSYBR Mixture，1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL，9.5 μL RNase-Free water。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,50個循環(huán)。65～95 ℃時每攝氏度保持10 s用于記錄熔解曲線，以確定擴增條帶的特異性。

1.7數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用相對定量法(2-ΔΔCt)[13]計算。對金紋細蛾Hsp90在不同組織和各發(fā)育階段的相對表達量進行分析時，分別以Hsp90在不同組織和各發(fā)育階段內(nèi)的表達量最低值作為參照；對不同溫度脅迫下Hsp90的相對表達量進行分析時，以常溫26 ℃下的表達量為參照，設(shè)為1。試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0數(shù)據(jù)處理軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性差異分析采用Tukey’s法，最后用Origin 8.5軟件制圖。

2　結(jié)果與分析

2.1金紋細蛾Hsp90基因的克隆與序列分析

通過測序和序列拼接，得到1條長度為942 bp的cDNA序列，在NCBI中通過Blastx比對，發(fā)現(xiàn)該序列屬于Hsp90家族。將翻譯所得的氨基酸序列在該數(shù)據(jù)庫中進行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)其與棉鈴蟲(ADP37710.1)、斜紋夜蛾(ADK55516.1)、煙夜蛾(ADM26742.1)等鱗翅目昆蟲的同源性在98%以上?？梢?，所得序列正是金紋細蛾Hsp90基因序列，將其命名為PrHsp90。該基因序列已提交至GenBank，獲得登錄號為KP671600。對金紋細蛾Hsp90序列的分析結(jié)果(圖1)表明，其對應(yīng)編碼211個氨基酸。

圖 1　PrHsp90基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列 金紋細蛾Hsp90基因C末端保守區(qū)域(MEEVD)用下劃線標(biāo)出， polyA尾的加尾信號序列(AATAAA)用方框標(biāo)出，終止密碼子用“*”號標(biāo)出Fig.1　Nucleotide sequence of PrHsp90 and its predicted amino acid sequence The cytoplasm Hsp90 C-terminal region (MEEVD) is underlined.A possible consensus signal sequence for ployadenylation (AATAAA) is indicated with box. The asterisk indicates the translational termination codon

2.2金紋細蛾Hsp90氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖2)表明，所選取物種的Hsp90氨基酸序列在進化樹上分為2個獨立的進化支，即昆蟲和脊椎動物。鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)物種的Hsp90氨基酸序列各自聚成一類，并共屬于昆蟲綱。從目以下的分類單元看，鱗翅目夜蛾科、菜蛾科、粉蝶科能各自聚成一族，枯葉蛾科的油松毛蟲與夜蛾科的棉鈴蟲、斜紋夜蛾先聚為一支，之后與金紋細蛾以平行的方式匯入一支。說明金紋細蛾的Hsp90基因與鱗翅目中同屬夜蛾科的棉鈴蟲、斜紋夜蛾和枯葉蛾科粘蟲的基因遺傳距離最近，與鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)物種的Hsp90基因遺傳距離較近，而與脊椎動物進化支中的智人、小家鼠的Hsp90基因遺傳距離較遠。

2.3Hsp90在金紋細蛾不同組織和各發(fā)育階段的表達

利用RT-qPCR技術(shù)研究了PrHsp90基因在金紋細蛾頭、胸、腹、足和翅5種組織中的表達水平，結(jié)果見圖3-A。由圖3-A可知，PrHsp90在所有檢測的組織中均有表達，但是其相對表達量在不同組織中差別較大，并表現(xiàn)出一定的特異性。PrHsp90在翅中的相對表達量最高，約是足中的842倍，且遠遠高于其他組織，并在統(tǒng)計學(xué)上與其他組織內(nèi)的相對表達量差異顯著。PrHsp90在頭、胸、腹和足中的相對表達量相差不大，在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著。

圖 2　昆蟲Hsp90氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹 分支間的數(shù)值是基于bootstrap驗證的自展檢驗值(1 000次重復(fù))；刻度標(biāo)尺表示0.02%的進化差異Fig.2　Phylogenetic tree of amino acid sequence of Hsp90 constructed by neighbor-joining The bootstrap test (1 000 replicates) is shown next to branch.The scale bar represents the 0.02% estimated phylogenetic divergence

圖 3　Hsp90基因在金紋細蛾不同組織和不同發(fā)育階段的表達情況 1st-5th代表1～5齡幼蟲。柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05，Tukey’s多重比較檢驗)Fig.3　Relative expression levels of PrHsp90 gene in different tissues and at different life stages 1st-5th.1st-5th lava.Different letters above bars represent significant difference (P<0.05，Tukey’s multiple comparison test)

采用RT-qPCR方法研究PrHsp90基因在金紋細蛾1～5齡幼蟲、蛹和剛羽化成蟲中的表達情況，結(jié)果見圖3-B。由圖3-B可見，在金紋細蛾的各個發(fā)育階段都有PrHsp90的表達，但是其在剛羽化成蟲體內(nèi)的相對表達量顯著高于蛹期和幼蟲期，約是蛹期的203倍，約是表達量最低的2齡幼蟲期的5 785倍。PrHsp90在蛹期的表達低于成蟲期，高于幼蟲期，但與幼蟲期的相對表達量在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著。PrHsp90在幼蟲期各齡期的表達相對穩(wěn)定，相互之間差異均不顯著。

2.4PrHsp90 mRNA的高溫誘導(dǎo)表達

由圖4可以看出，高溫脅迫對金紋細蛾4齡幼蟲PrHsp90表達具有明顯的誘導(dǎo)作用。PrHsp90在常溫26 ℃(對照)下的相對表達量最低，在29和32 ℃下處理后相對表達量未顯著提高，但隨著處理溫度的提高，4齡幼蟲在35,38,41和44 ℃下處理后，其體內(nèi)PrHsp90相對表達量顯著提高，約為對照處理的3～15倍。其中44 ℃下處理后幼蟲體內(nèi)PrHsp90相對表達量最高，41 ℃次之，且均顯著高于其他溫度處理。不同溫度處理下的PrHsp90表達水平隨著溫度的升高而升高的現(xiàn)象充分表明，PrHsp90為熱誘導(dǎo)型的熱激基因，且表達量與脅迫程度呈正相關(guān)。

圖 4　PrHsp90在不同溫度脅迫下的相對表達量Fig.4　Relative expression levels of PrHsp90 mRNA

3　討　論

熱激蛋白是進化上高度保守的蛋白[14]。本研究以家蠶、斜紋夜蛾、粘蟲等物種HSP90的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計簡并引物，成功克隆了金紋細蛾P(guān)rHsp90 cDNA片段，經(jīng) NCBI 比對后發(fā)現(xiàn)其cDNA序列、氨基酸序列均與其他昆蟲的Hsp基因序列具有很高的同源性，與棉鈴蟲(ADP37710.1)、斜紋夜蛾(ADK55516.1)、煙夜蛾(ADM26742.1)等鱗翅目昆蟲的同源性在98%以上，更加證實了Hsp90基因家族的高度保守性?？寺〉玫降慕鸺y細蛾P(guān)rHsp90氨基酸片段C末端還具有Hsp90基因特有的MEEVD保守序列，表明此片段就是金紋細蛾的一條Hsp90基因。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，金紋細蛾的Hsp90與同為鱗翅目的夜蛾科Hsp90遺傳距離最近，與昆蟲綱中鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、同翅目(Homoptera)物種的遺傳距離較近，而與脊椎動物(Vertebrates)進化支中的智人、小家鼠的遺傳距離較遠。每個目類昆蟲的Hsp90都能很好地聚在一起，說明Hsp90可以用來研究物種的系統(tǒng)分化。

金紋細蛾Hsp90基因在其不同組織中表達的研究結(jié)果顯示，PrHsp90在頭、胸、腹、足、翅中均有表達，但其表達豐度在不同組織中差別較大，并表現(xiàn)出一定的組織特異性，其中PrHsp90在翅中的相對表達量最高，約是足中的842倍，且遠遠高于其他組織，在頭、胸、腹和足中的相對表達量差異不顯著。依據(jù)PrHsp90基因在翅中的大量表達，推測熱激蛋白基因可能與昆蟲的飛行能力、生殖等行為相關(guān)。而且昆蟲作為無脊椎動物中唯一有翅的生物，飛行使其在覓食、求偶、避敵和擴大分布范圍等方面都比陸地動物要技高一籌，并成為昆蟲綱繁榮興旺的基礎(chǔ)。熱激蛋白與昆蟲的飛行能力、生殖等行為的具體相關(guān)性還需進一步研究。PrHsp90基因在金紋細蛾不同生長發(fā)育階段均有表達，但是其在成蟲體內(nèi)的相對表達量顯著高于蛹期和幼蟲期，在蛹期的表達僅高于幼蟲期。PrHsp90在成蟲期和蛹期的顯著表達，可能與昆蟲生長發(fā)育變化相關(guān)，也是其對不良環(huán)境的一種適應(yīng)機制。前期研究表明，PrHsp90基因不僅在對抗外界壓力中起作用，而且在昆蟲的生長發(fā)育分化，甚至在生殖上均可能起作用[15-20]。

本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫對金紋細蛾4齡幼蟲PrHsp90表達具有明顯的誘導(dǎo)作用。PrHsp90表達水平隨溫度升高而升高的現(xiàn)象充分表明，PrHsp90為熱誘導(dǎo)型的熱激基因，且表達量與脅迫程度呈正相關(guān)。大量研究證明，HSPs的合成與生物體耐熱性的獲得呈正相關(guān)。例如，蘋果蠹蛾Hsp90 mRNA的相對表達量在32～44 ℃高溫脅迫下隨溫度升高而顯著升高，證實CpHsp90是誘導(dǎo)型熱激基因，且mRNA相對表達量與脅迫程度呈正相關(guān)[21]。還有研究證明，在較低溫度下熱激處理誘導(dǎo)生物體內(nèi)HSPs合成，會使得生物體在更高溫度下的存活率上升，如非洲蝗蟲在50 ℃熱激處理2 h后全部死亡，但在39～45 ℃預(yù)處理后，可以增加其在更高溫度下的存活率[22]。在PrHsp90的表達模式中，溫度預(yù)處理是否會影響金紋細蛾的存活率，溫度與PrHsp90的表達量有何關(guān)系，有待進一步研究。

本研究通過分子克隆技術(shù)得到了金紋細蛾Hsp90的片段序列，進行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，并測定了PrHsp90在不同組織、不同生長發(fā)育階段和高溫脅迫刺激下的表達情況，為下一步深入研究金紋細蛾Hsp90與其生長發(fā)育和抗逆行為的相互關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and expression analysis ofHsp90 gene fragment fromPhyllonorycterringoniella(Lepidoptera:Gracilariidae)

WANG Guanhua，LI Xin，GUO Changning，YU Jianguang，HOU Qian，XIN Wen

(CollegeofPlantProtection,KeyLaboratoryofAppliedEntomology,NorthwestA&FUniversity,Yangling，Shaanxi712100,China)

【Objective】 The fragment ofHsp90 gene fromPhyllonorycterringoniellawas cloned and its biological information and expression patterns under different treatments were analyzed to provide basis for further study about the relationships betweenPrHsp90 and the development and heat resistance ofP.ringoniella.【Method】 TheHsp90 fragment was cloned using RACE-PCR technology.The expression patterns ofHsp90 in different tissues at developmental stages under different heat treatments were analyzed using RT-qPCR.【Result】 TheHsp90 gene fragment with length of 942 bp was obtained,which was namedPrHsp90 and the access number in GenBank was KP671600.Sequence analysis showed that its amino acid sequence shared high homology with Hsp90 from other insects.It had 98% and higher homology with Hsp90 fromHeliothisarmigera(ADP37710.1),Spodopteralitura(ADK55516.1) andHelicoverpaassulta(ADM26742.1).Expression analysis ofPrHsp90 in different tissues indicated its expression level was significantly higher in wing than in head,thorax,abdomen and foot.ThePrHsp90 transcript was detectable at all developmental stages with dramatically higher expression in adults than in larvae and pupae.Under heat treatments,the expression ofPrHsp90 increased with the increase of temperature.After heat treatments at 35,38,41 and 44 ℃,its expression increased significantly to 3-15 times of that in control.【Conclusion】 Expression ofPrHsp90 is tissue-specified and it plays key roles in development and heat resistance ofP.ringoniella.

Phyllonorycterringoniella；HSP；developmental stages；thermal stress

時間:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.016

2015-03-27

陜西省農(nóng)業(yè)廳重點農(nóng)業(yè)科技示范推廣項目(ZDKJ-2014-32)

王冠華(1990-)，女，山東聊城人，碩士，主要從事園藝生態(tài)系統(tǒng)有害生物調(diào)控研究。E-mail：guanhuaplant@126.com

李鑫(1957-)，男，陜西岐山人，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹害蟲管理與農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化研究。

E-mail：lixin57@hotmail.com

S436.611.2+9；Q78

A

1671-9387(2016)10-0114-07

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