中國(guó)水仙鋅指蛋白NtPLATZ1的克隆與表達(dá)分析

林江波，王偉英，李海明，吳水金，鄒　暉，李躍森，戴藝民

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所，福建 漳州363005)

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中國(guó)水仙鋅指蛋白NtPLATZ1的克隆與表達(dá)分析

林江波，王偉英，李海明，吳水金，鄒暉，李躍森，戴藝民

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 甘蔗研究所，福建 漳州363005)

【目的】 克隆中國(guó)水仙植物AT富集序列鋅結(jié)合蛋白基因(NtPLATZ1)，為研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。【方法】 利用RACE技術(shù)克隆了NtPLATZ1 cDNA全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)方法分析其核苷酸及氨基酸序列,將NtPLATZ1與原核表達(dá)載體pGEX-4T-3連接，轉(zhuǎn)化BL21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)半定量PCR分析用多效唑處理后該基因在中國(guó)水仙不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】NtPLATZ1的cDNA全長(zhǎng)1 024 bp，包含1個(gè)642 bp的完整閱讀框架，編碼213個(gè)氨基酸；編碼蛋白具有PLATZ superfamily蛋白保守區(qū)，與大豆(Glycinemax, AII19314.1)PLATZ蛋白序列的同源性最高，為81%。原核表達(dá)結(jié)果表明，NtPLATZ1在大腸桿菌中能有效表達(dá)。半定量RT-PCR分析表明，噴霧多效唑后，NtPLATZ1基因在中國(guó)水仙不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的表達(dá)量先上升后下降，抽葶期葉片的表達(dá)量最高；噴霧清水后NtPLATZ1基因表達(dá)量先下降后又有所回升，抽葶期和始花期的表達(dá)量低于長(zhǎng)葉期和盛花期。【結(jié)論】 成功克隆了中國(guó)水仙NtPLATZ1基因，多效唑處理能明顯誘導(dǎo)該基因的表達(dá)。

中國(guó)水仙；PLATZ；基因表達(dá)；鋅指蛋白

鋅指蛋白(zinc finger protein)是一類具有“手指狀”結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)結(jié)合Zn2+來(lái)穩(wěn)定一種很短的可自我折疊成“手指”的蛋白結(jié)構(gòu)[1]。根據(jù)半胱氨酸(C)和組氨酸(H)殘基數(shù)目、位置的不同，鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子可分為 C2H2、C2HC、C2C2、C3H、C3HC4(RING finger)和 C2HC5(LIM finger)等亞類[2]。根據(jù)鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)特征或功能差異，又可以分為WRKY型蛋白、GATA型蛋白、PHD型蛋白、DOF型蛋白和TFⅢA型蛋白等[3-4]。鋅指蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，對(duì)植物種子發(fā)育[3]、花發(fā)育[5]、側(cè)根和分枝發(fā)育[6]以及環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[7-8]起重要作用。

PLATZ是一類新型的鋅指蛋白，其具有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域:一個(gè)是C-X2-H-X11-C-X2-C-X(4～5)-C-X2-C-X(3～7)-H-X2-H，其半胱氨酸和組氨酸殘基(CHC4H2)的數(shù)量與RING finger(C3HC4)和LIM finger(C2HC5)相同，但屬于不同類型的鋅指結(jié)構(gòu)域；另一個(gè)是 C-X2-C-X(10～11)-C-X3-C，與GATA finger(C2C2)相似，但不同于GATA finger(C-X2-C-X(17～18)-C-X2-C)；PLATZ結(jié)合于DNA序列的AT富集區(qū)域起轉(zhuǎn)錄抑制作用，是鋅依賴的DNA結(jié)合蛋白[9]。有關(guān)中國(guó)水仙PLATZ基因的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

中國(guó)水仙(Narcissustazettavar.chinensis)為中國(guó)的十大名花之一，香味獨(dú)特。因室內(nèi)光線較弱，中國(guó)水仙在室內(nèi)水養(yǎng)時(shí)，容易引起徒長(zhǎng)。施用適宜濃度的多效唑能使植株矮化，株形緊湊，提高其觀賞價(jià)值[10]。筆者前期通過(guò)篩選多效唑誘導(dǎo)中國(guó)水仙的SSH文庫(kù)，獲得1個(gè)cDNA片段，該片段編碼的氨基酸與已知植物的PLATZ有較高的同源性。因此，本研究克隆了中國(guó)水仙PLATZ1基因cDNA序列全長(zhǎng)，探討該基因的生物學(xué)信息及其在多效唑處理后不同生長(zhǎng)階段水仙植株中的表達(dá)情況，以期為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

中國(guó)水仙的處理參照林江波等[11]的方法,水養(yǎng)16 d后，每天用150 mg/L的多效唑噴霧1次，連續(xù)噴霧10次，另設(shè)噴霧清水為對(duì)照。取長(zhǎng)葉期、抽葶期、始花期和盛花期葉片，置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌(Esherichiacoli)菌株BL21(DE3)、HB101和載體pGEX-4T-3，由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所實(shí)驗(yàn)室保存；pMD19-T連接試劑盒、ExTaqDNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、PrimeScriptTMReverse Transcriptase、RNAiso Plus和5′-Full RACE Kit，購(gòu)自寶生物公司；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒，購(gòu)自上海生工。

1.2總RNA的提取與cDNA的克隆

參照RNAiso Plus試劑盒說(shuō)明書(shū)提取中國(guó)水仙葉片總RNA，按照PrimeScriptTMReverse Transcriptase試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

用于5′RACE的引物序列為：5PLATZ1.5′-CTC-CCCCATCATAGAAGCACAGA-3′，5PLATZ2.5′-GACGGGCTGAAGCTCTGTATCACATTGCTC-TCGG-3′；用于3′RACE的引物序列為:3PLATZ1.5′-GCTCTCTTTGCCTGGCTTATC-3′,3′adaptor：5′-CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′。

5′ RACE按照5′-Full RACE Kit說(shuō)明操作，3′RACE的PCR擴(kuò)增采用常規(guī)的反應(yīng)程序。PCR產(chǎn)物用12 g/L瓊脂糖凝膠電泳，目的片段經(jīng)切膠回收后克隆并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果的拼接由軟件DNAMAN V6.0完成。

1.3中國(guó)水仙PLATZ1蛋白序列分析

中國(guó)水仙PLATZ1蛋白序列的相似性和氨基酸保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)采用NCBI的BLAST X和BLAST P搜索引擎完成，用ProtParam在線分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，采用在線工具SSPro(http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，以NetPhos 2.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線軟件預(yù)測(cè)氨基酸的磷酸化位點(diǎn)[12]，采用MEGA 6.0軟件NJ法進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)[13]分析。

1.4原核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

根據(jù)中國(guó)水仙PLATZ1序列的拼接結(jié)果設(shè)計(jì)1對(duì)引物(PLATZ1:5′-CGCGGATCCAGGGAGG-AGGTGAGGACAAC-3′；PLATZ2:5′-CGCCTCG-AGCTCCCCCATCATAGAAGCACA-3′)，在引物上、下游下劃線處分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)，用于擴(kuò)增中國(guó)水仙PLATZ1完整開(kāi)放閱讀框。PCR產(chǎn)物與載體pGEX-4T-3經(jīng)酶切、回收、連接和轉(zhuǎn)化后，挑取單克隆擴(kuò)繁，經(jīng)PCR驗(yàn)證后送上海生工測(cè)序。用鑒定為陽(yáng)性的重組原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)，37 ℃下以200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。加入終濃度1 mmol/L IPTG，于37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，取1 mL經(jīng)誘導(dǎo)的菌液于Eppendorf管中，連同誘導(dǎo)前樣品于13 000 r/min離心1 min，棄上清，加入50 μL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)懸浮沉淀；加等體積2×凝膠上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴變性處理10 min；蛋白純化參照Clontech的glutathione resin use manual操作進(jìn)行；將誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)菌樣和純化蛋白各取30 μL經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)R-250染色檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況。

1.5NtPLATZ1基因的表達(dá)特性分析

以中國(guó)水仙不同生長(zhǎng)時(shí)期的葉片 cDNA為模板，actin為內(nèi)參[14]，PCR檢測(cè)NtPLATZ1的表達(dá)特性。NtPLATZ1引物為PLATZ1和PLATZ2，產(chǎn)物長(zhǎng)度747 bp，PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，20個(gè)循環(huán)；actin的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，25個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增均重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1中國(guó)水仙PLATZ1基因的5′RACE和3′RACE

以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄的水仙葉片cDNA為模板，用引物3PLATZ1和3′adaptor進(jìn)行PCR；參照5′-Full RACE Kit的方法合成cDNA第1鏈；再用引物5PLATZ1、5PLATZ2和試劑盒提供的5′RACE Outer Primer、5′RACE Inner Primer進(jìn)行兩輪PCR；3′RACE在850 bp左右有一條亮帶(圖1-A)，5′RACE在630 bp左右有一條亮帶(圖1-B)。

圖 1　中國(guó)水仙PLATZ1基因的 PCR電泳結(jié)果M.分子質(zhì)量標(biāo)記(100～2 000 bp)；A.3′RACE；B.5′RACEFig.1　Electrophoresis products for PLATZ1 fromNarcissus tazetta var.chinensis by PCRM.DNA Marker (100-2 000 bp);A.3′RACE;B.5′RACE

用DNAMAN V6.0對(duì)NtPLATZ1基因3′RACE和5′RACE的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接，并進(jìn)行開(kāi)放閱讀框分析,結(jié)果(圖2)表明，所獲得的cDNA全長(zhǎng)為1 024 bp，包含1個(gè)642 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼213個(gè)氨基酸，5′末端非翻譯區(qū)48 bp，3′末端非翻譯區(qū)334 bp。

圖 2中國(guó)水仙PLATZ1基因及其推導(dǎo)的氨基酸序列

Fig.2Complete cDNA sequence ofPLATZ1 fromNarcissustazettavar.chinensis

2.2中國(guó)水仙PLATZ1基因開(kāi)放閱讀框的克隆

以隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄的中國(guó)水仙PLATZ1基因cDNA為模板，用引物PLATZ1和PLATZ2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后用DNAMAN V6.0比對(duì)，結(jié)果與拼接得到的中國(guó)水仙PLATZ1開(kāi)放閱讀框完全一致，獲得了帶BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的中國(guó)水仙PLATZ1基因。

2.3中國(guó)水仙PLATZ1基因序列的同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用BLAST X對(duì)中國(guó)水仙PLATZ1基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果表明，其所編碼的氨基酸序列與大豆(Glycinemax,AII19314.1)、可可(Theobromacacao,XP_007039480.1)、陸地棉(Gossypiumhirsutum,AFH57272.1)的PLATZ氨基酸序列的相似度分別為81%，75%和75%；通過(guò)NCBI的BLAST P在線搜索蛋白保守區(qū)，相匹配的有1個(gè)(圖3)，為PLATZ superfamily，E值為1.77×10-45。因此，推斷該基因?yàn)橹袊?guó)水仙的PLATZ基因，命名為NtPLATZ1。

圖 3　中國(guó)水仙PLATZ1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3　Putative conserve domains for PLATZ1 protein from Narcissus tazetta var.chinensis

采用MEGA 6.0軟件將NtPLATZ1推導(dǎo)的氨基酸序列與其他12個(gè)具有PLATZ結(jié)構(gòu)域的物種進(jìn)行NJ聚類分析，結(jié)果(圖4)表明，單子葉植物和雙子葉植物的PLATZ分別處于兩個(gè)獨(dú)立進(jìn)化的分支中，單子葉植物又分為兩類，其中禾本科的玉米與日本稻聚為一類，中國(guó)水仙單獨(dú)聚為一類。

圖 4　中國(guó)水仙和其他植物PLATZ的分子進(jìn)化樹(shù)Fig.4　Molecular phylogenetic tree of NtPLATZ1 and PLATZ from other plants

2.4NtPLATZ1序列的生物信息學(xué)分析

ProtParam在線分析結(jié)果表明，NtPLATZ1蛋白的分子質(zhì)量為23.817 ku，理論等電點(diǎn)為9.12，具有19個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)，28個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)。不穩(wěn)定系數(shù)54.11，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)70.94，總平均疏水性為-0.463。

采用SSPro在線工具進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在NtPLATZ1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)中，含有146個(gè)形成無(wú)規(guī)則卷曲的氨基酸殘基，占68.55%；24個(gè)形成α螺旋的氨基酸殘基，占11.27%；43個(gè)形成β折疊的氨基酸殘基，占20.18%。

以NetPhos 2.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)NtPLATZ1氨基酸的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)果表明該蛋白中有19個(gè)絲氨酸(serine,S)殘基參與磷酸化,酪氨酸(Tyrosine,Y)和蘇氨酸(Threonine,T)各有2個(gè)參與磷酸化。

圖 5　NtPLATZ1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 大寫(xiě)字母為氨基酸序列；小寫(xiě)字母為二級(jí)結(jié)構(gòu)組成:c.無(wú)規(guī)則卷曲，h.α螺旋，e.β折疊Fig.5　Predicted secondary structure of NtPLATZ1 Capital letters show amino acid sequence;small letters show structure of amino acid chain，c.Random coil，h.α-helix，e.β-extended

2.5NtPLATZ1蛋白的原核表達(dá)

將重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-NtPLATZ1轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)BL21(DE3)，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h后，經(jīng)SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，NtPLATZ1蛋白的分子質(zhì)量為23.817 ku，融合蛋白分子質(zhì)量為49.817 ku。試驗(yàn)結(jié)果(圖6)表明，與攜帶質(zhì)粒pGEX-4T-3的菌體相比，攜帶重組質(zhì)粒pGEX-NtPLATZ1的E.coil菌株中出現(xiàn)1條約49.817 ku的條帶，蛋白經(jīng)純化后同樣獲得1條約49.817 ku的條帶，說(shuō)明NtPLATZ1能在大腸桿菌中有效表達(dá)。

圖 6　NtPLATZ1蛋白在大腸肝菌中表達(dá)的 SDS-PAGE電泳結(jié)果M. 分子質(zhì)量標(biāo)記；1.誘導(dǎo)前；2.誘導(dǎo)后；3.純化Fig.6　SDS-PAGE of NtPLATZ1 expressed in Esherichia coliM.Protein Marker;1.Before induction; 2.After induction;3.Purification

2.6NtPLATZ1基因的表達(dá)特性

用半定量RT-PCR法，分析經(jīng)多效唑處理后，中國(guó)水仙不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中NtPLATZ1基因的表達(dá)情況，結(jié)果(圖7)顯示，NtPLATZ1在中國(guó)水仙抽葶期和始花期葉片中的表達(dá)量較噴霧清水(對(duì)照)高，長(zhǎng)葉期與盛花期表達(dá)量基本一致；從整個(gè)生長(zhǎng)期來(lái)看，噴霧多效唑后，NtPLATZ1的表達(dá)量先上升后下降，抽葶期的表達(dá)量達(dá)到最高，后開(kāi)始下降；噴霧清水后NtPLATZ1的表達(dá)量先下降后又有所回升，抽葶期和始花期的表達(dá)量低于長(zhǎng)葉期和盛花期。actin基因在各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量基本一致。

圖 7　經(jīng)多效唑處理后中國(guó)水仙不同生長(zhǎng)時(shí)期 葉片中NtPLATZ1基因的表達(dá)分析 1～4.噴霧多效唑，5～8.噴霧清水；1,5.長(zhǎng)葉期； 2,6.抽葶期；3,7.始花期；4,8.盛花期Fig.7　Expression analysis of NtPLATZ1 gene at different growth stages in response to paclobutrazol 1-4.Sprayed with paclobutrazol，5-8.Sprayed with water; 1,5.Leaf stage;2,6.Scape stage;3,7.Early flowering stage;4,8.Full-bloom stage

3　討　論

本研究從多效唑處理的中國(guó)水仙葉片中克隆到了NtPLATZ1基因，其推導(dǎo)的氨基酸序列具有一個(gè)PLATZ superfamily，E值為1.77×10-45。所編碼的氨基酸與大豆、可可、陸地棉PLATZ氨基酸序列的相似度分別為81%，75%和75%，推斷該基因?yàn)橹袊?guó)水仙的PLATZ基因。

光敏色素參與了植物種子的萌發(fā)、葉的擴(kuò)展、光周期和開(kāi)花的誘導(dǎo)等生理功能，并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。豌豆的GTPase基因pra2主要在上胚軸表達(dá)，但光照會(huì)抑制其表達(dá)[15]。PLATZ1能與pra2基因中12 bp的順式作用元件DE1上游的A/T-rich DNA序列結(jié)合，下調(diào)pra2基因的表達(dá)；PLATZ1基因在豌豆的根尖及頂芽中的表達(dá)量較高，而在幼葉、成熟葉及莖中的表達(dá)量都很低，推測(cè)其可能與組織的細(xì)胞分化有關(guān)[9]。抽葶期和始花期是中國(guó)水仙室內(nèi)水養(yǎng)葉片徒長(zhǎng)最快的階段，噴霧多效唑后，能克服弱光引起的葉片徒長(zhǎng)。半定量RT-PCR分析結(jié)果表明，從長(zhǎng)葉期到盛花期的中國(guó)水仙葉片中都能檢測(cè)到NtPLATZ1的表達(dá)，在抽葶期和始花期，噴霧清水時(shí)NtPLATZ1表達(dá)量較低，噴霧多效唑則能明顯上調(diào)NtPLATZ1的表達(dá)。因此，PLATZ可能參與了光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中基因表達(dá)的調(diào)控。

PLATZ1與A/T-rich DNA序列的結(jié)合是非特異的。豌豆petE基因的增強(qiáng)子含有A/T-rich DNA序列[16]，蛋白HMG-1和HMG-I/Y與增強(qiáng)子結(jié)合可提升petE基因的表達(dá)[17],PLATZ1能與petE基因增強(qiáng)子的A/T rich DNA序列結(jié)合，減弱該增強(qiáng)子的功能，下調(diào)petE基因的表達(dá)[9]。而對(duì)于中國(guó)水仙NtPLATZ1能調(diào)控哪些基因的表達(dá)及其機(jī)制，均有待進(jìn)一步研究。

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Cloning and expression analysis ofNtPLATZ1 gene fromNarcissustazettavar.chinensis

LIN Jiangbo,WANG Weiying,LI Haiming,WU Shuijin,ZOU Hui,LI Yuesen,DAI Yimin

(SugarcaneResearchInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Zhangzhou,Fujian363005,China)

【Objective】 This study aimed to clone plant AT-rich sequence and zinc-binding protein gene fromNarcissustazettavar.chinensis(NtPLATZ1) for studying its biological function.【Method】 RACE and RT-PCR technique were used to clone NtPLATZ1,the bioinformatics analysis was conducted to analyze its sequence,and semi-quantitative RT-PCR was used to detect its expression.NtPLATZ1 was inserted into pGEX-4T-3,the prokaryotic expression vector was transformed into BL21,and protein expression was induced.【Result】 The full length ofNtPLATZ1 cDNA was 1 024 bp with an 642 bp ORF,which encoded a protein of 213 amino acids with a conservative domain of PLATZ superfamily.NtPLATZ1 shared 81% identity with PLATZ ofGlycinemax(AII19314.1).NtPLATZ1 was predicted an unstable protein.Prokaryotic expression showed that recombinant pGEX-NtPLATZ1 had high expression inE.coliBL21.Semi-quantitative RT-PCR revealed thatNtPLATZ1 expression was enhanced at scape stage and decreased hereafter after it was sprayed with paclobutrazol,while it was decreased at scape and early flowering stages without paclobutrazol. 【Conclusion】NtPLATZ1 was clone and its expression was enhanced significantly by paclobutrazol.

Narcissustazettavar.chinensis;PLATZ;gene expression;zinc finger protein

時(shí)間:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.023

2015-03-27

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01098)

林江波(1976-)，男，福建永春人，副研究員，碩士，主要從事觀賞植物生物技術(shù)研究。E-mail:linjiangbo1976@qq.com

戴藝民(1969-)，男，福建長(zhǎng)泰人，研究員，博士，主要從事觀賞植物生物技術(shù)研究。E-mail:dymttcn@163.com

Q78；S682.2+1

A

1671-9387(2016)10-0165-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0903.046.html