鴨瘟病毒gB蛋白單克隆抗體的制備

趙丹丹，刁有祥，楊國(guó)平，陳　浩，提金鳳，張　璐

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

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鴨瘟病毒gB蛋白單克隆抗體的制備

趙丹丹，刁有祥，楊國(guó)平，陳浩，提金鳳，張璐

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安 271018)

【目的】 制備鴨瘟病毒(DPV)gB蛋白單克隆抗體，為建立DPV快速診斷方法及進(jìn)一步鑒定DPV的抗原表位奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?克隆DPVgB基因，構(gòu)建其表達(dá)載體并進(jìn)行原核表達(dá)，純化DPV gB蛋白，以其作為抗原免疫8周齡BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，進(jìn)行間接ELISA及亞克隆篩選，并對(duì)單抗亞類及抗原性進(jìn)行鑒定。【結(jié)果】 PCR擴(kuò)增出915 bp的目的基因，成功連接于pET-28a載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得4株穩(wěn)定分泌抗DPV gB蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A8D7、E6C3、H11F8、H6F6，間接ELISA檢測(cè)其腹水效價(jià)分別為1∶103、1∶103、1∶105、1∶103，亞類鑒定結(jié)果分別為IgG2b、IgG2a、IgG2b、IgG1，輕鏈均為kappa鏈。Western blot結(jié)果顯示4株單抗均能與DPV gB蛋白特異性結(jié)合，IFA結(jié)果表明4株單抗是針對(duì)DPV產(chǎn)生的?！窘Y(jié)論】 成功獲得了特異性針對(duì)DPV gB蛋白的單克隆抗體。

鴨瘟病毒；gB蛋白；單克隆抗體

鴨瘟由Baudet于 1923 年首次在荷蘭發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)在許多養(yǎng)鴨國(guó)家暴發(fā)和流行，給養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。鴨瘟病毒(Duck Plague Virus，DPV)又名鴨病毒性腸炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)，是引起鴨、鵝、天鵝等雁形目動(dòng)物急性、熱性、敗血性傳染病的病原[2]。近年來(lái)，鴨瘟?xí)r有發(fā)生，迫切需要提供有效的診斷方法。目前針對(duì)該病毒建立的檢測(cè)方法很多，如PCR、ELISA、間接免疫熒光技術(shù)、微量中和試驗(yàn)等[3]，均為該病的診斷和防治奠定了基礎(chǔ)。單克隆抗體具有性質(zhì)均一穩(wěn)定、特異性高等特點(diǎn)[4]，可以作為病毒診斷方法的一個(gè)很好的工具。作為鴨瘟病毒的高度保守性蛋白之一，gB蛋白的免疫原性良好，高度的特異性和保守性決定了該蛋白能夠?yàn)闄z測(cè)方法的建立提供優(yōu)良的材料。本研究制備針對(duì)鴨瘟病毒gB蛋白的單克隆抗體，旨在為建立具有強(qiáng)特異性、高敏感性的DPV診斷方法提供工具。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株、細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、鴨瘟病毒(SD-Y)、鴨呼腸孤病毒(DRV)、減蛋下降綜合征病毒(EDS-76V)、H9亞型禽流感病毒(AIV-H9N2)、坦布蘇病毒(TMUV)及原核表達(dá)載體 pET-28a、大腸桿菌DH5α和Rosetta，均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。6～8周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠購(gòu)自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2主要試劑DNA 凝膠回收提取試劑盒、T4 DNA連接酶、IPTG、pMD18-T 載體等，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT、HT、PEG4000，購(gòu)自Sigma公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu)自全式金生物技術(shù)(北京)有限公司；Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series，購(gòu)自RayBiotech。

1.2抗原的制備

1.2.1gB基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank發(fā)表的DPVgB基因序列(GenBank登錄號(hào)為：JF999965)，通過(guò)Protean軟件分析，選擇其抗原表位較多的一段序列，利用Primer premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物gB-f ：5′-CCGGAATTCTGGGATTGGATG-CCTAA-3′，下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物gB-r ：5′-CCGCTCGAGTATTGTACCGCCG-TCTTT-3′，下劃線部分為XhoLⅠ酶切位點(diǎn)。

采用酚氯仿法提取病毒DNA[5]，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物 P1、P2 各 1 μL (25 μmol/L)，HiFi DNA Polymerase 0.3 μL，模板 2 μL，ddH2O 14.2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，利用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.2.2目的蛋白的表達(dá)及純化利用EcoRⅠ和XhoLⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物和pET-28a分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段，T4 DNA 連接酶連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-gB,進(jìn)行EcoRⅠ和XhoLⅠ雙酶切鑒定。將重組質(zhì)粒pET-28a-gB轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-gB。按照包涵體純化法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化[6]，備用。

1.2.3目的蛋白的鑒定將純化的gB蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，50 g/L 脫脂乳封閉過(guò)夜，以鴨瘟陽(yáng)性血清為一抗，以 HRP 標(biāo)記的羊抗鴨IgG(1∶5 000)為二抗，用DAB 試劑盒顯色，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.3動(dòng)物免疫

將純化好的gB蛋白用滅菌生理鹽水稀釋至 0.5 mg/mL，加入等量的弗氏完全佐劑，乳化完全后腹腔注射7周齡BALB/c小鼠，0.2 mL/只；2周后，用同樣方法稀釋gB蛋白，加入等量的弗氏不完全佐劑，腹腔注射進(jìn)行第2次免疫，0.2 mL/只；再過(guò)2周進(jìn)行第3次免疫，方法同第2次免疫；10 d后，尾靜脈采血，分離血清，測(cè)定其抗體效價(jià)。選取抗體效價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，0.6 mL/只，3 d后取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4細(xì)胞融合及陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選

取免疫鼠脾細(xì)胞與培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在融合劑PEG4000作用下，以5∶1～10∶1的比例按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合[7]。融合細(xì)胞經(jīng)HAT及HT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)至長(zhǎng)滿培養(yǎng)孔孔底面積1/10時(shí)，用間接ELISA對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選出的陽(yáng)性孔再經(jīng)過(guò)3次有限稀釋法進(jìn)行亞克隆[8]，待陽(yáng)性率達(dá)到100%時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)留待制備腹水并保存于液氮。

1.5腹水的制備與純化

取10周齡BALB/c小鼠,腹腔注射滅菌液體石蠟0.5 mL/只，7～10 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106～3×106個(gè)/只，待小鼠腹部膨大抽取腹水，離心取上清，采用辛酸-硫酸銨法對(duì)腹水進(jìn)行純化[9]。

1.6單抗的鑒定

1.6.1效價(jià)的測(cè)定將制備的腹水從1∶100開(kāi)始倍比稀釋，采用間接ELISA方法檢測(cè)腹水效價(jià)。

1.6.2亞類的鑒定按照Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series說(shuō)明書(shū)對(duì)單抗的亞類進(jìn)行鑒定。

1.6.3Western blot 鑒定將純化的gB蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，50 g/L脫脂乳封閉過(guò)夜，以陽(yáng)性單克隆細(xì)胞上清為一抗，以 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，用DAB 試劑盒顯色，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.6.4間接免疫熒光(IFA)鑒定按照常規(guī)方法制備鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)，傳代后將其轉(zhuǎn)到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)成單層且面積為底部面積的70%～80%時(shí)，用DPV感染DEF細(xì)胞，并設(shè)未加病毒的空白對(duì)照。待出現(xiàn)細(xì)胞病變后，用丙酮-甲醇(體積比1∶1)固定，以鑒定為陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為二抗，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6.5單抗的穩(wěn)定性分別在雜交瘤細(xì)胞凍存后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，取出凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，以確定陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞是否丟失。

1.6.6單抗的特異性分別用DPV、TMUV、AIV-H9N2、EDS-76V、DRV作為抗原包被酶標(biāo)板，以雜交瘤細(xì)胞上清液為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀釋)為二抗，利用間接ELISA方法檢測(cè)單克隆抗體細(xì)胞上清。

2　結(jié)果與分析

2.1gB基因的PCR擴(kuò)增

提取鴨瘟病毒DNA，PCR擴(kuò)增其gB基因，凝膠電泳結(jié)果(圖1)顯示，在約915 bp處可見(jiàn)到特異性條帶。

2.2重組表達(dá)載體pET-28a-gB的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ、XhoLⅠ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見(jiàn)到約915 bp的目的片段及大于5 000 bp的載體片段(圖2)。

圖 1　DPV gB基因的PCR鑒定M.DL2000 Marker;1.陰性對(duì)照；2.gB基因Fig.1　PCR identification of gB gene of DPVM.DL2000 Marker;1.Negative control;2.The gB gene圖 2　重組質(zhì)粒pET-28a-gB的雙酶切鑒定M.DL5000 Marker；1.pET-28a-gBFig.2　Restriction enzyme analysis of pET-28a-gBM.DL5000 Marker；1.pET-28a-gB

2.3gB蛋白的鑒定

將表達(dá)及純化后的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，用鴨瘟陽(yáng)性血清進(jìn)行 Western blot 鑒定。結(jié)果(圖3)顯示，表達(dá)的蛋白在約34 ku處可見(jiàn)特異性條帶，而陰性對(duì)照無(wú)條帶，表明表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)性。

2.4陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選

對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行觀察可知，細(xì)胞融合率達(dá)90%以上；經(jīng)間接ELISA檢測(cè)后，對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行有限稀釋法克隆，陽(yáng)性率達(dá)100%時(shí)，共獲得4株穩(wěn)定分泌抗gB蛋白的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為A8D7、E6C3、H11F8和H6F6。

2.5單抗效價(jià)的測(cè)定及亞類鑒定

用間接ELISA方法測(cè)定腹水的效價(jià)，結(jié)果A8D7為1∶103，E6C3為1∶103，H11F8為1∶105，H6F6為1∶103。

用Rapid Mouse Isotyping Kit-Gold Series測(cè)定4株單抗的亞類，結(jié)果顯示A8D7(IgG2b)、E6C3(IgG2a)、H11F8(IgG2b)、H6F6(IgG1)的輕鏈均為kappa鏈。

2.6單抗的Western blot 檢測(cè)

圖4顯示，4株單抗均可特異性識(shí)別gB蛋白，在約34 ku處出現(xiàn)特異性條帶，而不與含空質(zhì)粒的菌體蛋白反應(yīng)，表明4株單抗均具有良好的反應(yīng)性。

圖 3誘導(dǎo)表達(dá)DPV gB蛋白的SDS-PAGE(A)及Western blot (B)分析

M.蛋白Marker；1,2.純化的DPV gB蛋白；3.DPV gB蛋白的Western blot分析結(jié)果；4.陰性對(duì)照

Fig.3SDS-PAGE(A)and Western blot(B) analysis of DPV gB protein

M.Protein Marker;1,2.purified DPV gB protein;3.Western blot analysis of DPV gB protein;4.Negative control

圖 4DPV gB蛋白4株單抗的Western blot 分析

M.蛋白Marker；1.A8D7單抗；2.E6C3單抗；3.H11F8單抗；4.H6F6單抗；5.陰性對(duì)照

Fig.4Western blot analysis of four monoclonal antibodies against gB protein of DPV

M.Protein Marker;1.Monoclonal antibody of A8D7;2.Monoclonal antibody of E6C3;3.Monoclonal antibody of H11F8;4.Monoclonal antibody of H6F6;5.Negative control

2.7單抗的IFA鑒定

DPV感染DEF細(xì)胞出現(xiàn)病變后，對(duì)4株單抗進(jìn)行IFA檢測(cè)，結(jié)果(圖5)顯示，4株單抗均可顯現(xiàn)特異性的綠色熒光，未感染的細(xì)胞不顯現(xiàn)綠色熒光。表明這4株單抗均可以與DPV發(fā)生反應(yīng)。

圖 5　DPV gB蛋白單抗與感染DPV的DEF細(xì)胞的IFA試驗(yàn)結(jié)果 A.A8D7單抗；B.H6F6單抗；C.E6C3單抗；D.H11F8單抗；E.陰性對(duì)照Fig.5　Indirect immunofluorescence assay of DPV in DEF cells with the four monoclonal antibodies against gB protein of DPV A.Monoclonal antibody of A8D7；B.Monoclonal antibody of H6F6； C.Monoclonal antibody of E6C3；D.Monoclonal antibody of H11F8；E.Negative control

2.8單抗的穩(wěn)定性和特異性檢測(cè)

在雜交瘤細(xì)胞凍存后3個(gè)月和6個(gè)月時(shí)，取出凍存的細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇，并對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，凍存后的雜交瘤細(xì)胞仍能穩(wěn)定地分泌抗體。

分別以DPV、TMUV、AIV-H9N2、EDS-76V、DRV為抗原對(duì)雜交瘤細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，本試驗(yàn)制備的單抗僅與DPV反應(yīng)，而不與TMUV、AIV-H9N2、EDS-76V、DRV發(fā)生反應(yīng)。

3　討　論

本研究成功制備了4株針對(duì)DPV gB蛋白的特異性單克隆抗體，為DPV快速檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。DPV gB蛋白是病毒表達(dá)的最為保守的囊膜蛋白之一，具有良好的免疫原性及免疫保護(hù)性[10]。單克隆抗體具有高度均一、生物活性單一和與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11]，可以為建立更加快速、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法提供有力的工具。因此，制備針對(duì)DPV gB蛋白的單克隆抗體，在臨床診斷、疾病預(yù)防、快速檢測(cè)方法建立等方面具有重要意義，也為進(jìn)一步鑒定DPV的抗原表位奠定了基礎(chǔ)。

董廣闊[12]利用質(zhì)粒pGEX-6Pl作為載體，對(duì)DPV gB和gC主要抗原域的編碼區(qū)進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，研制了針對(duì)gB和gC的單克隆抗體。本研究將DPVgB基因連接到原核表達(dá)載體pET-28a上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliRosetta(DE3)進(jìn)行原核表達(dá)，通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間及IPTG濃度的摸索，成功表達(dá)出了DPV-gB蛋白。

本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)RosettaE.coli表達(dá)DPV gB蛋白，原核表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、操作簡(jiǎn)便、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)[13]，并且省去了傳統(tǒng)方法中的繁瑣步驟，可大大節(jié)省時(shí)間。在載體的選擇上，本試驗(yàn)采用了原核表達(dá)載體pET-28a，該載體由T7啟動(dòng)子、lac結(jié)構(gòu)基因和卡那霉素抗性基因等構(gòu)成，能夠表達(dá)融合蛋白，性質(zhì)更加穩(wěn)定，且能保持表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)活性，使其具備抗原性[14]，為單抗的制備提供了便利。因此，本研究中，先利用生物學(xué)軟件分析gB蛋白氨基酸殘基的抗原性、親水性等，選擇了一段抗原性強(qiáng)的區(qū)域進(jìn)行克隆表達(dá)，以期得到具有診斷價(jià)值的免疫原，結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體具有較好的反應(yīng)性。

本研究以原核表達(dá)的DPV gB蛋白作為抗原，制備DPV的單克隆抗體，腹水效價(jià)在1∶103～1∶105，其與以全毒免疫小鼠產(chǎn)生的效價(jià)[15]相比較低，可能是全毒引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)較全面，但是用蛋白進(jìn)行免疫能夠提高反應(yīng)的特異性。

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Preparation and identification of monoclonal antibodies against gB protein of duck plague virus

ZHAO Dandan,DIAO Youxiang,YANG Guoping，CHEN Hao,TI Jinfeng, ZHANG Lu

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an,Shandong271018,China)

【Objective】 This study prepared monoclonal antibodies against gB protein of duck plague virus to provide basis for establishing diagnosis method of DPV infection and identifying antigen epitope of DPV.【Method】 The DPVgBgene was cloned to establish its expression vector and conduct prokaryotic expression.DPV gB protein was purified and used to immunize 8 weeks old BALB/c mice,whose splenocytes were fused with SP2/0 myeloma cells for indirect ELISA and sub-clone screening. 【Result】 PCR amplification obtained the aim gene of 915 bp and it was connected to pET-28a vector before being transformed to Rosetta for expression.Four hybridoma cell lines that stably secreted monoclonal antibody against gB protein of DPV named A8D7,E6C3,H11F8,and H6F6 were obtained with indirect ELISA determined ascitic fluid titers of 1∶103,1∶103,1∶105,and 1∶103,respectively.The immunoglobulin subtypes of the monoclonal antibodies were IgG2b,IgG2a,IgG2b,and IgG1,with the light chain of kappa. Western blot showed the four monoclonal antibodies were able to specifically recognize gB protein of DPV and IFA showed that the four monoclonal antibodies were specific to DPV.【Conclusion】 Specific monoclonal antibodies against gB protein of duck plague virus were obtained.

duck plague virus;gB protein;monoclonal antibody

時(shí)間:2016-09-0709:02DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.002

2015-04-20

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-43)

趙丹丹(1989-)，女，山東乳山人，碩士，主要從事禽病學(xué)研究。E-mail:zhaodandan_0925@163.com

刁有祥(1962-)，男，山東膠州人，教授，博士，主要從事禽病學(xué)研究。E-mail:yxdiao@126.com

S852.65+7

A

1671-9387(2016)10-0007-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0902.004.html