IL-33誘導(dǎo)的小鼠過敏原非依賴性哮喘樣模型肺組織免疫細(xì)胞及亞群的改變

袁琳潔　陳詩皓　安　高　黃　瓊　易達(dá)委　李　艷　呂　喆　王晶晶　黃克武　王　煒　孫　英*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 北京呼吸疾病研究所，北京 100020)

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· 呼吸疾病基礎(chǔ)與臨床 ·

IL-33誘導(dǎo)的小鼠過敏原非依賴性哮喘樣模型肺組織免疫細(xì)胞及亞群的改變

袁琳潔1陳詩皓1安高1黃瓊1易達(dá)委1李艷1呂喆1王晶晶2黃克武3王煒1孫英1*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，北京 100069；2. 首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 100069； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 北京呼吸疾病研究所，北京 100020)

目的本研究旨在通過對(duì)白細(xì)胞介素-33(interleukin-33,IL-33)誘導(dǎo)的過敏原非依賴性哮喘樣模型小鼠的觀察，探索IL-33對(duì)小鼠肺組織中T、B淋巴細(xì)胞亞群，自然殺傷T(natural killer T, NKT)細(xì)胞和固有淋巴樣2型細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells, ILC2)的生物學(xué)作用。方法采用數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為氯化鈉注射液(normal saline, NS)組和IL-33組，分別將NS、IL-33于1～6 d連續(xù)滴鼻，之后隔天滴鼻至18 d制備小鼠哮喘模型。采用有創(chuàng)肺功能檢測小鼠氣道高反應(yīng)性；肺組織切片染色觀察氣道炎性反應(yīng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠肺組織中T、B細(xì)胞亞群，NKT細(xì)胞和ILC2細(xì)胞數(shù)量及比例變化。結(jié)果與NS組相比，鼻腔給予IL-33刺激可引起小鼠氣道反應(yīng)性增高，氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞增生。IL-33組小鼠肺組織T細(xì)胞(CD3+T)及其亞群細(xì)胞數(shù)增多，Th2細(xì)胞(CD3+CD8-IL-4+)出現(xiàn)優(yōu)勢分化，Th1/Th2細(xì)胞比例下降(P<0.01)；B細(xì)胞(CD19+B)及其亞群(B1a：CD19+CD23-CD5+CD11b+，B1b：CD19+CD23-CD5-CD11b+和B2：CD19+CD23+B220+)以及ILC2細(xì)胞(lineage-ICOS+ST2+)數(shù)出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)；NKT細(xì)胞(CD3+CD8-CD49b+)比例無明顯改變(P>0.05)。結(jié)論IL-33可能通過直接或間接作用造成肺組織T、B淋巴細(xì)胞亞群和ILC2細(xì)胞的數(shù)量及比例改變，打破局部免疫系統(tǒng)平衡，引發(fā)哮喘炎性反應(yīng)。

白細(xì)胞介素-33；哮喘；T淋巴細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞；固有淋巴樣2型細(xì)胞

哮喘(asthma)是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅公眾健康的常見疾病。近年來哮喘發(fā)病率有明顯增高的趨勢，全球患者則達(dá)3億之眾，給家庭和社會(huì)造成了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。多種免疫細(xì)胞和分子參與了哮喘的發(fā)生過程，近年來認(rèn)為Th2細(xì)胞和固有淋巴樣2型細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)是介導(dǎo)哮喘發(fā)生發(fā)展的主要細(xì)胞，細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4 (interleukin-4，IL-4)、IL-5、IL-13、IL-25、IL-33、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)，趨化因子如eotaxin、CCL1，炎性反應(yīng)介質(zhì)如組胺、白三烯、前列腺素D2等分子發(fā)揮了主要的生物學(xué)效應(yīng)[1]。其中上皮源性細(xì)胞因子IL-33在哮喘中發(fā)揮的作用備受矚目。IL-33屬于IL-1家族成員，在細(xì)胞損傷或壞死時(shí)作為一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)向免疫系統(tǒng)釋放，因此被認(rèn)為是一種警報(bào)素[2-4]。IL-33與其受體ST2結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，后者在多種免疫細(xì)胞及氣道結(jié)構(gòu)細(xì)胞上均有表達(dá)，因此IL-33能夠通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答?；诒菊n題組前期研究[3]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，即慢性呼吸道暴露IL-33可引起小鼠哮喘樣氣道炎性反應(yīng)，筆者提出IL-33/ST2可能通過直接和/或間接作用于多種免疫細(xì)胞，在哮喘炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本課題擬通過研究IL-33誘導(dǎo)的哮喘樣模型小鼠肺組織T、B淋巴細(xì)胞及其亞群以及自然殺傷T(natural killer T, NKT)細(xì)胞、固有淋巴樣2型細(xì)胞(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)的變化，進(jìn)一步探討IL-33在誘導(dǎo)哮喘發(fā)生中的免疫學(xué)機(jī)制及其相關(guān)的作用環(huán)節(jié)。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡(18～20 g)SPF級(jí)近交系BALB/c雌性小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：AEEI-2015-013)，于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔房飼養(yǎng)，溫度21℃～23℃，濕度50%～60%，晝夜 12 h節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。本研究通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1建立IL-33誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型

BALB/c小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(normal saline, NS)組和IL-33組。在IL-33組，采用重組小鼠IL-33(rmIL-33,美國R&D 公司； 100 ng IL-33/50 μL)連續(xù)滴鼻6 d(1次/d)，之后隔天滴鼻至第18天，第19天殺鼠取材；NS組按等量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液處理(見圖1A所示)。

1.2.2小鼠肺力學(xué)參數(shù)及氣道反應(yīng)性的測量

在造模第19天，2組小鼠均注射戊巴比妥麻醉(80 mg/kg)，氣管插管與小動(dòng)物肺功能測量儀( 加拿大FlexiVent公司)相連接，以不同質(zhì)量濃度乙酰甲膽堿(Mch)溶液(0、3、6、12、24、48 mg/mL)霧化激發(fā)10 s，測量呼吸系統(tǒng)阻力(airway respiratory system resistance，Rrs)。

1.2.3肺組織石蠟切片染色

小鼠左肺用4%(體積分?jǐn)?shù))甲醛溶液4 ℃固定過夜，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度為5 μm)。分別進(jìn)行HE染色、剛果紅染色，PAS染色，觀察炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤特別是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤及黏液分泌等氣道炎性反應(yīng)指標(biāo)變化[3]。

1.2.4肺組織單細(xì)胞懸液制備

小鼠斷頸處死后，于75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中浸泡2 min，開胸取全肺置于培養(yǎng)皿中，取200目無菌篩網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液。4 ℃、300 g離心8 min收集細(xì)胞，進(jìn)一步裂解紅細(xì)胞后洗滌，用1640培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)獲得單細(xì)胞懸液。

1.2.5肺組織免疫細(xì)胞的鑒定

為進(jìn)行細(xì)胞膜表面分子染色，取肺組織單細(xì)胞懸液3×106個(gè)細(xì)胞，加入Fc受體阻斷劑CD16/CD32抗體室溫孵育10 min，之后加入相應(yīng)膜抗體室溫避光孵育30 min，1 mL PBS洗滌1次。PBS重懸上機(jī)( LSRFortessaTM，美國BD公司)。為進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，首先加入離子霉素、PMA和高爾基體阻斷劑(Leuko Act Cktl With GolgiPlug,美國BD公司)37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱孵育4～6 h。收集細(xì)胞，加入Fc受體阻斷劑室溫孵育10 min，再加入細(xì)胞膜表面分子抗體避光孵育30 min，1 mL PBS洗滌1次。繼而加入破膜固定劑(Fix&Perm,美國BD公司)4 ℃ 20 min，2 mL PBS洗滌。加入胞內(nèi)細(xì)胞因子抗體室溫避光孵育40 min，PBS洗滌后重懸上機(jī)。細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體詳見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞標(biāo)記熒光抗體

NKT：natural killer T; ILC2: type 2 innate lymphoid cells.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1IL-33誘導(dǎo)的小鼠哮喘樣模型的建立

在實(shí)驗(yàn)第19天，采用有創(chuàng)肺功能儀檢測肺動(dòng)力學(xué)參數(shù)，隨著Mch質(zhì)量濃度增加，IL-33組呼吸系統(tǒng)阻力(Rrs)與NS組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明IL-33組小鼠存在氣道高反應(yīng)性(圖1B)。小鼠肺組織病理學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)：NS對(duì)照組未見明顯異常(圖1C、1D、1E)，IL-33滴鼻可誘導(dǎo)氣道周圍炎性細(xì)胞浸潤(圖1F，HE染色)、尤以嗜酸性粒細(xì)胞為主(圖1G，剛果紅染色)，杯狀細(xì)胞增生、黏液分泌增多(圖1H，PAS染色)。綜上，IL-33組小鼠出現(xiàn)哮喘典型氣道高反應(yīng)性及氣道炎性病理學(xué)改變，表明IL-33組小鼠哮喘樣模型成功建立。

圖1　IL-33誘導(dǎo)的小鼠哮喘樣模型的建立

Schedule of experiments (A) and airway respiratory system resistance(Rrs，B)of mice challenged with NS or IL-33 (n=5 for each group). Representative photomicrographs of haematoxylin& eosin-staining (HE, C and F, 200×), Congo red+ eosinophils staining (D and G,400×) and periodic acid-Schiff staining (PAS, E and H，200×) stained in lung sections from NS- and IL-33-challenged mice. IL-33:interleukin-33; NS:normal saline.

2.2IL-33組小鼠肺組織中T細(xì)胞總數(shù)和Th2細(xì)胞數(shù)量及百分比增加

與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中總細(xì)胞、CD3+T(總T)細(xì)胞、CD3+CD8-T(Th)細(xì)胞、CD3+CD8+T (Tc)細(xì)胞數(shù)均顯著增加(P<0.01)；盡管CD3+CD8-IFN-γ+和CD3+CD8-IL-4+細(xì)胞數(shù)都有所增多，但Th1/Th2比例呈明顯下降(P<0.01)，Th細(xì)胞比例失衡，結(jié)果如圖2所示。

圖2　流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織中T細(xì)胞及其亞群改變

2.3IL-33組小鼠肺組織中B細(xì)胞及其亞群細(xì)胞數(shù)量增加

與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中CD19+B 細(xì)胞(總B 細(xì)胞)、B1 B細(xì)胞(CD19+CD23-)和B2 B 細(xì)胞(CD19+CD23+B220+)數(shù)量均顯著增加(P<0.01)，同時(shí)B1細(xì)胞亞群中B1a(CD19+CD23-CD5+CD11b+)和B1b(CD19+CD23-CD5-CD11b+)細(xì)胞亦明顯增加(P<0.01)，且B1b較B1a細(xì)胞變化更為顯著，結(jié)果如圖3所示。

2.4IL-33組小鼠肺組織中NKT細(xì)胞的檢測

為檢測CD3+CD8-細(xì)胞中可能存在的NKT細(xì)胞的改變，采用CD49b對(duì)該群細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中NKT細(xì)胞(CD3+CD8-CD49b+)數(shù)量有所增加(P<0.05)，但其在CD3+CD8-細(xì)胞中所占比例并無改變，結(jié)果見圖4所示。

2.5IL-33組小鼠肺組織中ILC2細(xì)胞數(shù)量增加

ILC2是除Th2細(xì)胞外，可介導(dǎo)哮喘發(fā)生發(fā)展的一類固有免疫細(xì)胞，與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中ILC2(lineage-ICOS+ST2+)細(xì)胞數(shù)顯著增加(P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果如圖5所示。

3　討論

IL-33屬于IL-1家族成員，可由多種結(jié)構(gòu)細(xì)胞和免疫細(xì)胞表達(dá)[2-3]，并通過與ST2-IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)復(fù)合體結(jié)合，招募MyD88、MAL，繼而激活NF-κB、MAPK(JNK、ERK及p38 MAPK)等下游信號(hào)通路[4]，在哮喘、自身免疫病、自發(fā)性肺間質(zhì)纖維化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-7]。

圖3　流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織中B細(xì)胞及其亞群改變

圖4　流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織中NKT細(xì)胞的改變

圖5　流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠肺組織中ILC2細(xì)胞的改變

已有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道哮喘患者較健康個(gè)體，其血清、痰液，支氣管活檢標(biāo)本上皮細(xì)胞、培養(yǎng)后的上皮細(xì)胞中可溶性ST2、IL-33表達(dá)均上調(diào)；小鼠鼻內(nèi)給予IL-33刺激能引起肺內(nèi)IL-4、IL-5、IL-13增高，誘使小鼠出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性[3]；在IL-33缺陷型小鼠(IL-33-/-)和ST2缺陷型小鼠(ST2-/-)中，吸入性過敏原引發(fā)的以Th2細(xì)胞分化、嗜酸性粒細(xì)胞增多為主的肺部炎性反應(yīng)明顯減弱[10-12]，提示IL-33引起的哮喘炎性反應(yīng)改變存在Th2型免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)證明IL-33誘導(dǎo)的哮喘模型小鼠出現(xiàn)以Th2應(yīng)答為主的氣道炎性反應(yīng)，其肺組織中Th1/Th2細(xì)胞比例失衡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中T 細(xì)胞數(shù)量明顯增加，提示Th1/Th2比值降低可能是由Th2細(xì)胞出現(xiàn)優(yōu)勢分化而非僅Th2細(xì)胞數(shù)的增加，從而造成T細(xì)胞亞群在數(shù)量、功能方面發(fā)生改變[13]。盡管有文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道NKT細(xì)胞在哮喘發(fā)病過程中也發(fā)揮重要作用，但在本實(shí)驗(yàn)中，IL-33滴鼻后小鼠肺組織NKT的比例與NS組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，盡管如此，IL-33介導(dǎo)下NKT細(xì)胞在哮喘中作用仍有待進(jìn)一步探討。值得注意的是，IL-33除能直接誘導(dǎo)Th2細(xì)胞發(fā)生分化增生外，還能夠通過多種途徑調(diào)節(jié)Th2型免疫應(yīng)答，如誘導(dǎo)ILC2細(xì)胞分泌IL-5和IL-13[16]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IL-33滴鼻后ILC2細(xì)胞在小鼠肺內(nèi)出現(xiàn)明顯聚集，提示該種細(xì)胞在哮喘中具有重要作用。

目前，人們對(duì)哮喘發(fā)生時(shí)B細(xì)胞表型的改變關(guān)注較少。B細(xì)胞主要包括B1 B細(xì)胞、B2 B細(xì)胞及Breg 3種亞群[17]，其中小鼠B1 B細(xì)胞又可進(jìn)一步分為CD5+B1a、CD5-B1b B細(xì)胞。B1a細(xì)胞能自發(fā)分泌IgM，為機(jī)體抵抗某些莢膜類細(xì)菌提供第一防線；B1b細(xì)胞產(chǎn)生抗體則需要被某些因素誘導(dǎo)，在機(jī)體長效保護(hù)方面起重要作用[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)與NS組相比，IL-33組小鼠肺組織中B細(xì)胞總數(shù)顯著增加，且B1細(xì)胞較B2細(xì)胞更為明顯。目前研究[20]普遍認(rèn)為活化的B1細(xì)胞可穩(wěn)定表達(dá)ST2，而B2細(xì)胞并不表達(dá)ST2，故IL-33/ST2可能直接促進(jìn)B1細(xì)胞的增生，本研究結(jié)果也提示這一點(diǎn)。而對(duì)所增加的B2細(xì)胞，其作用可能是間接的，這與Komai-Koma[20]的結(jié)果相一致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)B1b細(xì)胞較B1a細(xì)胞有更高的反應(yīng)性，有研究[20]顯示B1a及B1b細(xì)胞雖表達(dá)相似水平的ST2，但B1b細(xì)胞較B1a細(xì)胞表達(dá)較高密度的IL-1RAcp，這也許可合理解釋該現(xiàn)象的發(fā)生，鑒于此，B1b細(xì)胞在哮喘中的作用需進(jìn)行深入研究。

綜上所述，IL-33參與了哮喘發(fā)生發(fā)展中主要的免疫應(yīng)答過程，對(duì)T、B淋巴細(xì)胞和ILC2細(xì)胞均有明顯生物學(xué)效應(yīng)，故有望成為哮喘治療的新靶點(diǎn)。

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編輯孫超淵

， E-mail：ying.sun@ccmu.edu.cn

Changes of immune cells and their subsets in lungs of interleukin (IL)-33-induced allergen-independent murine model of asthma

Yuan Linjie1, Chen Shihao1, An Gao1, Huang Qiong1, Yi Dawei1, Li Yan1, Lyu Zhe1, Wang Jingjing2, Huang Kewu3, Wang Wei1,Sun Ying1*

(1.DepartmentofImmunology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China；2.DepartmentofLaboratoryAnimalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069，China；3.DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity，BeijingInstituteofRespiratoryMedicine,Beijing100020，China)

ObjectiveTo explore effects of IL-33 on subsets of T cells and B cells, type 2 innate lymphoid cells (ILC2) and natural killer T (NKT) cells in lungs in IL-33-induced murine model of asthma.MethodsMice were randomly distributed into two groups including normal saline(NS, control group) and IL-33-challenged groups. Nasal challenges with recombinant mouse IL-33 or saline were daily performed from the day 1-6，followed by every 2 days for a further 12 days. Lung functions and histological staining of lung tissue sections were used to measure airways hyperresponsiveness and inflammation．Flow cytometry was employed to determine the changes of total and phenotypes of subsets of pulmonary T cells and B cells，NKT cells and ILC2 cells, compared with those of lung. ResultsCompared with the NS group intranasal challenge with IL-33 induced airways hyperresponsiveness, infiltrating inflammatory cells and goblet cell hyperplasia. IL-33-challenge also increased total pulmonary numbers of cells, total CD3+T cells and type 2 helper cells (CD3+CD8-IL-4+) which leading to decrease of Th1/Th2 ratio (P<0.01). In addition, nasal challenge with IL-33 increased total number of CD19+B cells and their subsets (B1a: CD19+CD23-CD5+CD11b+, B1b:CD19+CD23-CD5-CD11b+and B2 B cells: CD19+CD23+B220+) as well as ILC2(lineage-ICOS+ST2+) (P<0.01), but not NKT cells (CD3+CD8-CD49b+) (P>0.05).ConclusionLocal challenge with IL-33 may play role in the pathogenesis of asthma through acting directly and/or indirectly on T cells, B cells and ILC2 cells, breaking the balance of immune system and causing immune dysfunction.

interleukin-33, asthma; T lymphocytes; B lymphocytes; type 2 innate lymphoid cells

國家自然科學(xué)基金(81373177，81471594)，北京市教育委員會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201410025006)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81373177，81471594)，Science and Technology Project of the Beijing Municipal Education Commission(KM201410025006)。

時(shí)間：2016-10-1611∶00

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20161016.1100.052.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2016.05.001]

R 392

2016-06-30)