適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)提取方法的研究

嚴(yán) 冬 劉殿昆 司冬晶 鄭 密 趙曦陽(yáng) 曲冠證 李 瑩

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)提取方法的研究

嚴(yán) 冬 劉殿昆 司冬晶 鄭 密 趙曦陽(yáng) 曲冠證 李 瑩*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

為了獲得分離效果好、清晰度高的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)雙向電泳圖像，本研究以小黑楊、毛果楊和84K楊葉片為材料，采用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法和Tris-三氯乙酸法提取楊樹(shù)葉片總蛋白質(zhì)，分別采用聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，應(yīng)用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對(duì)這3種蛋白質(zhì)提取方法得到的雙向電泳凝膠進(jìn)行分析。結(jié)果表明：Tris-三氯乙酸法最適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取。利用Tris-三氯乙酸法提取蛋白質(zhì)得到的鮮樣中總蛋白質(zhì)平均含量為949.46 μg·g-1，得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)平均數(shù)量為567個(gè)，所得到的雙向電泳凝膠圖譜分離效果好、清晰度高。

楊樹(shù)葉片；Tris-三氯乙酸法，蛋白質(zhì)提取；雙向凝膠電泳

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中分析和分離復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品最有效的手段之一[1]。近年來(lái)雙向電泳技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同植物組織器官中蛋白質(zhì)的差異研究[2～3]、植物病理學(xué)研究[4]，以及植物對(duì)逆境反應(yīng)的分子機(jī)理研究等[5～6]。目前關(guān)于不同材料的蛋白質(zhì)樣品的制備研究已有很多報(bào)道[7～8]，較常見(jiàn)的全蛋白提取方法有尿素—硫脲提取法、Tris-HCl法、酚法、Tris-丙酮-酚法、Trizol沉淀法和TCA丙酮沉淀法等。植物葉片含有大量的多酚、色素、多糖等次生代謝物質(zhì)，直接影響蛋白樣品制備的質(zhì)量，從而導(dǎo)致雙向電泳分離效果不佳[9～10]，因此提取高質(zhì)量且含量豐富的葉片全蛋白是研究植物葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的前提和基礎(chǔ)。

楊樹(shù)(Populus)是世界上廣泛栽培的重要造林樹(shù)種[11]，是林木研究的模式樹(shù)種[12～13]。楊樹(shù)基因組計(jì)劃的完成使其基因組學(xué)研究取得了不斷的進(jìn)步[14～15]，而蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者[16]，蛋白質(zhì)組學(xué)研究也具有很高的價(jià)值。高質(zhì)量蛋白質(zhì)樣品的制備是進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究的前提，因此建立一種適用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)提取的方法是進(jìn)行楊樹(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究首要解決的問(wèn)題。本研究以不同派別楊樹(shù)的3個(gè)無(wú)性系(小黑楊(PopulusX)、毛果楊(P.trichocarpaTorr.& Gray)和84K楊(銀腺楊，P.alba×P.glandulosa))為材料，利用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法及Tris-三氯乙酸法提取這3個(gè)無(wú)性系葉片的蛋白質(zhì)，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向電泳對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，比較3種蛋白質(zhì)提取方法對(duì)楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取效果，并得到Tris-三氯乙酸法是適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片蛋白提取的最佳方法，該方法可獲得高含量高質(zhì)量的葉片總蛋白質(zhì)，可用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究并為其他木本植物葉片蛋白質(zhì)樣品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)材料是東北林業(yè)大學(xué)溫室扦插培養(yǎng)的小黑楊、毛果楊和84K楊，于扦插第3個(gè)月采集自莖尖起第3～5片葉片，葉片采摘下后立刻放入液氮速凍處理，放入-80℃冰箱保存。

1.2 楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)樣品的制備

取3份1 g保存在-80℃冰箱的楊樹(shù)葉片，在預(yù)冷研缽中加入液氮研磨，以研磨到淺色粉末狀為最合適。

1.2.1 三氯乙酸—丙酮沉淀法

將粉末轉(zhuǎn)入到離心管中放在冰上，加入3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巰基乙醇)，震蕩30 min，在-80℃冰箱保存1 h。將沉淀后的樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將沉淀重懸于3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液中(0.07% β-巰基乙醇)，顛倒混勻，在-20℃冰箱保存1 h。再將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將沉淀重懸于3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液中(0.07% β-巰基乙醇)，顛倒混勻，在-20℃冰箱保存1 h。再將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。將樣品真空干燥后，加入200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白質(zhì)。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.2 Tris-飽和酚法

將粉末轉(zhuǎn)入到離心管中放在冰上，加入3倍體積的蛋白質(zhì)提取液(0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，0.4% β-巰基乙醇，0.9 mol·L-1蔗糖)震蕩10 min，加入等體積的Tris-飽和酚，冰浴震蕩30 min。再將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，取酚相(上層液)。余下的沉淀和液體再加入Tris-飽和酚，顛倒混勻。再將樣品放入低溫高速離心機(jī)離心20 min，取酚相，并將酚相收集到同一離心管中。向酚相中加入3倍體積的甲醇(0.1 mol·L-1的醋酸銨)溶液，充分混勻，在-20℃沉淀過(guò)夜。將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清，沉淀用甲醇溶液(0.1 mol·L-1的醋酸銨)洗滌并將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清，重復(fù)洗沉淀1～2次。將沉淀真空干燥，加入200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.2.3 Tris-三氯乙酸法

在預(yù)冷研缽中加入0.1 g pvp-40和葉片混合，液氮研磨葉片，將粉末轉(zhuǎn)入到離心管中放在冰上，并加入3倍體積預(yù)冷的丙酮溶液。將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。沉淀中加入1 mL lysis buffer(50 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，2 mmol·L-1乙二胺四乙酸，10% Triton X-100，0.1% β-巰基乙醇)，超聲波破碎細(xì)胞后，再將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min。蛋白質(zhì)溶液中加入5倍體積預(yù)冷的丙酮溶液(10%三氯乙酸和0.07% β-巰基乙醇)，-80℃保存1 h。將樣品放入低溫高速離心機(jī)，12 000 g，4℃，離心20 min，棄上清。使用1 mL預(yù)冷的丙酮溶液(0.07% β-巰基乙醇)清洗沉淀，重復(fù)1次。將沉淀真空干燥后，使用200 μL雙向電泳裂解液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲，4% CHAPS，1%二硫蘇糖醇)充分溶解蛋白。12 000 g，室溫下離心20 min，取上清，-80℃冰箱保存。

1.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用改良的Bradford法簡(jiǎn)便快速測(cè)定出微量蛋白濃度[17]。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳在Bio-rad Mini-PROTEAN Ⅱ(Bio-rad)上進(jìn)行，電泳條件為：15 mA，30 min；30 mA至溴酚藍(lán)到達(dá)膠底部。采用銀染法對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色。將凝膠置入固定液(40%乙醇，10%冰乙酸)中，于水平搖床上固定30 min。除去固定液，加入致敏液(30%乙醇，0.2%硫代硫酸鈉，6.8%乙酸鈉，0.125%戊二醛)，致敏30 min。除去致敏液，用純水洗滌3次，每次10 min。除去溶液，加入銀染液(0.25%硝酸銀，0.015%甲醛)，染色20 min。除去銀染液，用純水洗滌2次，每次1 min。將膠轉(zhuǎn)入顯色液(2.5%碳酸鈉，0.0075%甲醛)中，待蛋白點(diǎn)顯色至清晰程度時(shí)即可除去顯色液加入終止液(14.6% EDTA-Na2·2H2O)。

1.5 雙向凝膠電泳

第一向等電點(diǎn)聚焦采用24 cm，pH3-10非線性的IPG膠條，上樣體積為450 μL。取300 μg蛋白質(zhì)樣品加入水化槽中，放入膠條，在膠條上覆蓋2 mL礦物油，蓋上水化槽的蓋子并將水化槽放置于等電聚焦電泳儀中，進(jìn)行等電聚焦。等電聚焦程序如表1所示，整個(gè)過(guò)程在20℃下進(jìn)行。

表1等電聚焦程序

Table1Theprogramofisoelectricfocusingelectrophoresis

步驟Steps電壓Voltage(V)升壓模式Mode時(shí)間Time(h)Step150快速StepandHold15Step2500快速StepandHold5Step31000線性Gradient1Step48000線性Gradient3Step58000快速StepandHold3．75

等電聚焦結(jié)束后，將IPG膠條放入含有10 mg·mL-1DTT的平衡液(75 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.8)，6 mol·L-1尿素，2%二硫蘇糖醇，30%丙三醇，0.002%溴酚藍(lán))平衡30 min，將平衡好的IPG膠條放入含有25 mg·mL-1碘乙酰胺的平衡液中平衡30 min，將平衡好的IPG膠條轉(zhuǎn)移至14%的聚丙烯酰胺凝膠上，用1%瓊脂糖固定，進(jìn)行第二向電泳分離。電泳條件：5 W，40 min；15 W至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部，采用銀染對(duì)電泳膠進(jìn)行染色。

1.6 圖像掃描和分析

凝膠染色后，用GE ImageScanner Ⅲ掃描儀對(duì)凝膠進(jìn)行圖像掃描，分辨率為300 dpi。用Image Master 2D Platinum 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。選取母膠，去除背景，運(yùn)行自動(dòng)斑點(diǎn)檢測(cè)，得出最終的結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析方法

利用SPSS(Statistical Program for Social Sciences)19.0[18]軟件對(duì)3種蛋白質(zhì)提取方法提取的3種楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)總量進(jìn)行方差分析，線性模型為:

xij=μ+Ci+Bj+eij

(1)

式中，μ為總體平均值，Ci為樹(shù)種效應(yīng)，Bj為方法效應(yīng)，eij為環(huán)境誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)提取總量的分析

用三氯乙酸—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法、Tris-三氯乙酸法分別提取小黑楊、毛果楊和84K楊葉片蛋白質(zhì)，利用Bradford法測(cè)定葉片蛋白質(zhì)含量(表2)。通過(guò)對(duì)葉片蛋白質(zhì)總量的計(jì)算表明三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法提取的蛋白質(zhì)總量高于Tris-飽和酚法。利用SPSS 19.0軟件對(duì)所得到的葉片蛋白質(zhì)總量進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同樹(shù)種間(F=41.78**)及不同蛋白質(zhì)提取方法間(F=37.35**)蛋白質(zhì)總量差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法所提取小黑楊葉片蛋白質(zhì)總量為T(mén)ris-飽和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取毛果楊葉片蛋白質(zhì)總量為T(mén)ris-飽和酚法的3.5倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取毛果楊葉片蛋白質(zhì)總量為T(mén)ris-飽和酚法的2倍。利用三氯乙酸—丙酮沉淀法所提取84K楊葉片蛋白質(zhì)總量為T(mén)ris-飽和酚法的1.9倍，利用Tris-三氯乙酸法所提取84K楊葉片蛋白質(zhì)總量為T(mén)ris-飽和酚法的1.2倍。以上結(jié)果說(shuō)明，三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-三氯乙酸法能從等量的楊樹(shù)葉片中獲得的蛋白質(zhì)總量更多，更適用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取。

表2 3種蛋白質(zhì)提取方法提取的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)總量

圖1 3種蛋白質(zhì)提取方法提取的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)總量Fig.1 The protein amount of three extracting methods

2.2 楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)提取質(zhì)量的分析

利用3種方法提取3種楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染染色，通過(guò)圖像掃描得到電泳圖譜。如圖2所示，Tris-三氯乙酸法提取所得到的3種楊樹(shù)葉片蛋白條帶豐富清晰，蛋白質(zhì)主要分布在10～50 kD，50 kD以上的大分子量蛋白清晰分布。三氯乙酸—丙酮沉淀法提取的3種楊樹(shù)葉片蛋白均有降解，特別是大分子量蛋白。Tris-飽和酚法提取的小黑楊葉片蛋白質(zhì)發(fā)生降解，同樣方法提取的毛果楊和84K楊蛋白條帶少，分子量分布不均勻?？傊琓ris/三氯乙酸法所提取的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)質(zhì)量最高，電泳圖蛋白條帶最清晰，蛋白質(zhì)種類(lèi)最豐富。因此，利用Tris/三氯乙酸法可以獲得更完整的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)，該方法最適用于雙向電泳的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的提取。

圖2 3種蛋白質(zhì)提取方法提取的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖 1,4,7. TCA丙酮沉淀法；2,5,8. Tris-飽和酚法；3,6,9. Tris/三氯乙酸法Fig.2 The SDS-PAGE image of the proteins extracted by three extracting methods 1,4,7. TCA/Acetone precipitation; 2,5,8. Tris/saturated phenol; 3,6,9. Tris/TCA

2.3 楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳結(jié)果的分析

利用3種方法提取3種楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)IPG膠條等電聚焦后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳以及銀染染色，通過(guò)圖像掃描得到電泳圖譜如圖3所示。由圖3可見(jiàn)，Tris-三氯乙酸法的背景比三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法的背景淺，橫向縱向條紋少，得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)也多。通過(guò)Image Master 2D Platinum 6.0軟件對(duì)蛋白質(zhì)電泳圖進(jìn)行分析，得到了3種方法提取的蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量(表3)。在以小黑楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質(zhì)點(diǎn)為三氯乙酸—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法的1.5倍。在以毛果楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質(zhì)點(diǎn)為三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.8倍，是Tris-飽和酚法的3.2倍。在以84K楊葉片為材料得到的電泳圖中，Tris-三氯乙酸法所得蛋白質(zhì)點(diǎn)為三氯乙酸—丙酮沉淀法的2.4倍，是Tris-飽和酚法的1.9倍。Tris-三氯乙酸法所得的3種楊樹(shù)蛋白質(zhì)的雙向電泳圖譜都非常清晰，分離效果好，且蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量多。因此，Tris-三氯乙酸法最適用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳，能夠有效的對(duì)楊樹(shù)蛋白質(zhì)組研究提供支持。

圖3 3種蛋白質(zhì)提取方法提取的楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳圖 a～c.小黑楊；d～f.毛果楊；g～i. 84K楊 a,d,g. 三氯乙酸—丙酮沉淀法；b,e,h. Tris-飽和酚法；c,f,i. Tris-三氯乙酸法Fig.3 The 2-DE images of the proteins extracted by three extracting methods a-c.Populus X; d-f.P.trichocarpa Torr. & Gray; g-i.P.alba×P.glandulosa a,d,g. TCA/Acetone precipitation; b,e,h. Tris/saturated phenol; c,f,i. Tris/TCA

表33種蛋白質(zhì)提取方法提取的楊樹(shù)葉片蛋白的雙向電泳圖蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)量

Table3Thenumberofproteinspotsextractedbythreeextractingmethodsinthe2-DEimages

品種Varieties三氯乙酸—丙酮沉淀法TCA/AcetoneprecipitationmethodTris?飽和酚法Tris/saturatedphenolmethodTris?三氯乙酸法Tris/TCAmethod小黑楊PopulusX296297435毛果楊P．trichocarpaTorr．&Gray20618457384K楊P．Alba×P．glandulosa293360694

3 討論

植物蛋白質(zhì)提取技術(shù)一直是植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究中需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題，不同的植物組織結(jié)構(gòu)及成分不同，適用的蛋白質(zhì)提取方法也不相同。本研究利用三氯乙酸法—丙酮沉淀法、Tris-飽和酚法和Tris-三氯乙酸法分別提取小黑楊、毛果楊和84K楊葉片總蛋白質(zhì)，結(jié)果表明，不同方法提取的相同質(zhì)量楊樹(shù)葉片的總量有很大差異，所得樣品的電泳結(jié)果差異很明顯。

三氯乙酸—丙酮沉淀法在動(dòng)物、植物蛋白提取上有廣泛應(yīng)用，是常用的植物葉片提取方法，但是難以清除樣品當(dāng)中的酚類(lèi)、醛類(lèi)物質(zhì)，使得電泳圖像上產(chǎn)生縱向條帶，從而掩蓋部分蛋白質(zhì)點(diǎn)與條帶，導(dǎo)致電泳時(shí)蛋白點(diǎn)與條帶缺失較多[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，此方法耗時(shí)較長(zhǎng)，提取的得到的蛋白質(zhì)發(fā)生降解，并且在雙向電泳圖像上產(chǎn)生嚴(yán)重的橫向和縱向條帶，蛋白質(zhì)分離效果差。Tris-飽和酚法的實(shí)驗(yàn)步驟相對(duì)復(fù)雜，所得蛋白總量少，對(duì)葉片蛋白的提取效果差。Tris-三氯乙酸法法實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)單，耗時(shí)較少，提取蛋白條帶豐富清晰，雙向電泳的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)量最多也最清晰。

同時(shí)，相對(duì)于三氯乙酸法—丙酮沉淀法和Tris-飽和酚法，Tris-三氯乙酸法在研磨葉片時(shí)加入了pvp-40，其可以絡(luò)合多酚類(lèi)物質(zhì)，防止多酚類(lèi)物質(zhì)氧化成醌類(lèi)物質(zhì)，具有一定的抗氧化作用，也有報(bào)道認(rèn)為pvp在去除多糖方面有一定功效[20～21]。之后應(yīng)用了超聲波破碎的技術(shù)對(duì)樣品粉末進(jìn)行了處理，使樣品粉末更加細(xì)致，使樣品可以與溶液更充分的接觸，從而提高了樣品的提取質(zhì)量。在先前，Islam等人發(fā)現(xiàn)，提取成熟水稻葉片蛋白質(zhì)時(shí)，使用超聲處理可以改善樣品質(zhì)量和雙向電泳的分離效果[22]。該方法與趙相濤、袁坤等人使用的改良三氯乙酸法相比[23～24]，先使用了蛋白裂解液溶解蛋白，能更好的保護(hù)蛋白，防止蛋白損失。以上研究結(jié)果表明，Tris-三氯乙酸法可以有效去除干擾電泳效果的各類(lèi)雜質(zhì)，從而從相同質(zhì)量的葉片樣品中提取出品質(zhì)更優(yōu)于其他兩種方法的蛋白質(zhì)，是最適合楊樹(shù)葉片雙向電泳蛋白質(zhì)提取的方法，可用于楊樹(shù)葉片蛋白質(zhì)組學(xué)的研究并為其他木本植物葉片蛋白質(zhì)樣品的制備提供參考。

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Fund program of science fund project of returned overseas of Heilongjiang(LC2013C09);Research Funds for the Central Universities(DL13BA09)

introduction：YAN Dong(1991—),male,Master,major in proteomics of poplar and tamarix chinensis.

date:2015-12-03

OptionalProteinExtractingMethodsofPoplarLeavesforTwo-dimensionalGelElectrophoresis

YAN Dong LIU Dian-Kun SI Dong-Jing ZHENG Mi ZHAO Xi-Yang QU Guan-Zheng LI Ying*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

In order to obtain the two-dimensional gel electrophoresis images with better separation and definition of poplar leaves, thePopulusX,P.trichocarpaTorr. & Gray andP.alba×P.glandulosawere selected to study the optional extracting methods of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis by using TCA/acetone precipitation, Tris/saturated phenol and Tris/TCA method, respectively. The proteins of poplar leaves were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and two-dimensional gel electrophoresis respectively and the images of two-dimensional gel electrophoresis were analyzed by Image Master 2D Platinum 6.0. Tris/TCA method was more appropriate for the protein extraction of poplar leaves for two-dimensional gel electrophoresis. The average protein content of the fresh sample extracted by Tris/TCA method was 949.46 μg·g-1and the average quantity of protein spots was 567 in the two-dimensional gel electrophoresis images which had better separation and definition.

poplar leaves;protein extraction;Tris/TCA method;two-dimensional gel electrophoresis

黑龍江省留學(xué)歸國(guó)科學(xué)基金項(xiàng)目(LC2013C09)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(DL13BA09)

嚴(yán)冬(1991—)，男，碩士研究生，主要從事楊樹(shù)、檉柳蛋白組學(xué)研究工作。

* 通信作者：E-mail:xlbtdl@163.com

2015-12-03

* Corresponding author：E-mail:xlbtdl@163.com

S792.11

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2016.03.022