響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥莖中蘆丁的提取工藝

李白存

(陜西學(xué)前師范學(xué)院 生物工程研究所，陜西 西安 710100)

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響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥莖中蘆丁的提取工藝

李白存

(陜西學(xué)前師范學(xué)院 生物工程研究所，陜西 西安 710100)

以蕎麥莖為原料，研究蘆丁的最佳提取工藝。通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)考察了料液比、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間4個(gè)因素對(duì)蘆丁提取量的影響。結(jié)果表明，各因素對(duì)蘆丁提取量的影響大小依次為：料液比>提取溫度>乙醇體積分?jǐn)?shù)>提取時(shí)間；蕎麥莖中蘆丁的最佳提取工藝條件為：料液比1∶22(g∶mL)、提取溫度65 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取時(shí)間2.0 h，在該條件下，蘆丁提取量達(dá)到6.752 mg·(100 g)-1。

蕎麥莖；蘆丁；提取工藝；響應(yīng)面法；優(yōu)化

蕎麥(buckwheat)是蓼科(polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)植物，主要有苦蕎和甜蕎兩個(gè)栽培品種,具有生長(zhǎng)周期短、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，是很好的救災(zāi)補(bǔ)種及填閑作物[1]。蕎麥營(yíng)養(yǎng)豐富，其籽粒、莖、葉、花中的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)元素的含量都高于小麥、大米和玉米等大宗作物。此外，蕎麥中還含有其它禾谷類作物含量少或不含的蘆丁物質(zhì)等[2-3]。

蘆丁，又名蕓香甙、紫槲成甙，廣泛存在于植物中。如蕓香、苦蕎麥、槐花蕾、楸樹葉、蒲公英、番茄莖、赤豆等均含有豐富的蘆丁，尤以槐花蕾和苦蕎麥中含量最高[4]。蘆丁屬黃酮類化合物，具有涼血止血、清肝瀉火、消炎抑菌、抗氧化及降血壓等作用[5]，能降低毛細(xì)血管通透性和脆性，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性[6]。

邵美紅等[7]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥莖葉中也含有較高的蘆丁類物質(zhì)。我國(guó)蕎麥資源豐富，在部分地區(qū)已成為優(yōu)勢(shì)農(nóng)作物之一。但是，長(zhǎng)期以來僅有傳統(tǒng)蕎麥?zhǔn)称芳庸どa(chǎn)，蕎麥莖葉一直被作為飼料和稈肥，甚至丟棄，未得到高價(jià)值利用。鑒于此，作者以蕎麥莖為原料，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蕎麥莖中蘆丁的提取工藝，以期為蕎麥莖資源化利用提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)

1.1材料、試劑與儀器

蕎麥莖，陜西淳化?；r(nóng)業(yè)科技貿(mào)易有限責(zé)任公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，上海滬宇生物試劑有限公司；無水乙醇、甲醇，天津富宇精細(xì)化工有限公司；亞硝酸鈉、硝酸鋁，重慶吉元化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，天津紅巖試劑廠。以上試劑均為分析純。

FW177型高速粉碎機(jī)，鄭州中原華通機(jī)械廠；電子分析天平，上海安亭電子儀器廠；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，上海光學(xué)儀器廠。

1.2方法

1.2.1材料預(yù)處理

挑選干凈的蕎麥莖于60 ℃下烘干，用高速粉碎機(jī)粉碎，過50目篩后備用。

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1最大吸收波長(zhǎng)的選擇

分別配制濃度(mg·mL-1)為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用紫外可見分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描。以試劑空白為對(duì)照，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果顯示：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在510 nm處有最大吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)以510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)[8]。

1.2.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2.000 mg于100 mL容量瓶中，加入60%乙醇2.0 mL溶解，定容至刻度，即為0.20 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液2.0 mL，再加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min。在510 nm處測(cè)定吸光度，以蘆丁濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3蘆丁提取量的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取提取液1.0 mL，放入10 mL容量瓶中，加入60%乙醇2.0 mL、5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻后靜置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，再加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min。于510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取液中蘆丁濃度，按下式計(jì)算蘆丁的提取量[mg·(100 g)-1]。

式中：c為提取液中蘆丁的濃度，mg·mL-1；V為提取液的定容體積，mL；m為蕎麥莖樣品質(zhì)量，g。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1料液比對(duì)蘆丁提取的影響

準(zhǔn)確稱取蕎麥莖樣品5.000 g，放入具塞三角瓶中，分別按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g∶mL，下同)加入60%乙醇，60 ℃水浴浸提1 h后于510 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁提取量，考察料液比對(duì)蘆丁提取的影響。

1.2.4.2提取溫度對(duì)蘆丁提取的影響

準(zhǔn)確稱取蕎麥莖樣品5.000 g，放入具塞三角瓶中，按料液比1∶20加入60%乙醇，分別放入55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃、75 ℃水浴浸提1 h后于510 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁提取量，考察提取溫度對(duì)蘆丁提取的影響。

1.2.4.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘆丁提取的影響

準(zhǔn)確稱取蕎麥莖樣品5.000 g，放入具塞三角瓶中，按料液比1∶20加入體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，60 ℃水浴浸提1 h后于510 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁提取量，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘆丁提取的影響。

1.2.4.4提取時(shí)間對(duì)蘆丁提取的影響

準(zhǔn)確稱取蕎麥莖樣品5.000 g，放入具塞三角瓶中，按料液比1∶20加入60%乙醇，在60 ℃水浴分別浸提1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h后于510 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蘆丁提取量，考察提取時(shí)間對(duì)蘆丁提取的影響。

1.2.5響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇提取時(shí)間(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、料液比(C)、提取溫度(D)4個(gè)因素，以蘆丁提取量為響應(yīng)值，用Design Expert 8.0軟件，按Box-Behnken設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定最優(yōu)提取工藝。響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

2　結(jié)果與討論

2.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

由圖1可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.02611c-0.002707，R2=0.99974。

表1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1Factors and levels of response surface methodology

水平因素A.提取時(shí)間hB.乙醇體積分?jǐn)?shù)%C.料液比g∶mLD.提取溫度℃-11.5501∶156002.0601∶206512.5701∶2570

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

2.2單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1料液比對(duì)蘆丁提取的影響(圖2)

圖2　料液比對(duì)蘆丁提取的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on extraction of rutin

由圖2可知，蕎麥莖中蘆丁提取量隨著提取溶劑用量的增加先升高后降低，在料液比達(dá)到1∶20時(shí)，蘆丁提取量達(dá)到最高。這是因?yàn)?，乙醇用量過多，乙醇與蕎麥莖有效接觸率降低，影響了有效成分溶出，導(dǎo)致蘆丁提取量降低，且增加乙醇用量會(huì)增加提取成本。故選擇料液比1∶20作為響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.2.2提取溫度對(duì)蘆丁提取的影響(圖3)

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，蘆丁提取量先升高后降低，在提取溫度達(dá)到65～70 ℃時(shí)，提取量較高。這是因?yàn)?，提取溫度升高加速了蘆丁的擴(kuò)散及溶解，提取量相應(yīng)升高；但提取溫度過高會(huì)導(dǎo)致蘆丁氧化，

圖3　提取溫度對(duì)蘆丁提取的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on extraction of rutin

提取量相應(yīng)降低。因此，選擇提取溫度65～70 ℃作為響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.2.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘆丁提取的影響(圖4)

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蘆丁提取的影響Fig.4　Effect of ethanol volume fraction on extraction of rutin

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，蘆丁提取量先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)蘆丁提取量達(dá)到最高。這是因?yàn)?，?dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到一定值后，一些脂溶性有機(jī)物溶出量相應(yīng)增加，抑制了蘆丁的浸出。因此，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%作為響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.2.4提取時(shí)間對(duì)蘆丁提取的影響(圖5)

圖5　提取時(shí)間對(duì)蘆丁提取的影響Fig.5　Effect of extraction time on extraction of rutin

由圖5可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，蘆丁提取量先升高后降低，在提取時(shí)間為1.5～2.0 h時(shí)蘆丁提取量較高。因此，選擇提取時(shí)間2.0 h作為響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)的中心條件。

2.3響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1二次響應(yīng)面回歸模型與分析

響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果

Tab.2 Design and results of Box-Behnken

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蘆丁提取量(Y)與4個(gè)因素的擬合方程為：Y=6.70-1.66×10-3A-0.087B+0.22C-0.13D-0.057AB-0.22AC-0.59AD-5.0×10-3BC-0.11BD+0.08CD-0.63A2-0.37B2-0.25C2-0.77D2。

該回歸模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型的方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression model

注：**：P<0.05，差異顯著；***：P<0.001，差異極顯著。

2.3.2兩因素交互作用比較分析

根據(jù)響應(yīng)面曲線的陡峭程度及等高線的形狀可分析因素間交互作用和影響程度。曲面越陡，等高線呈橢圓形，表明兩因素間交互作用顯著；反之，曲面平緩，等高線接近于圓形則交互作用不明顯[10]。各因素間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖如圖6所示。

圖6各因素間的交互作用對(duì)蘆丁提取量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖

Fig.6Response surface plots and contour plots for the effects of the interaction between each factors on extraction amount of rutin

由圖6可知，料液比與提取時(shí)間、提取溫度與提取時(shí)間、提取溫度與乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度與料液比之間有顯著的交互作用；而乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間、料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的交互作用不明顯。蘆丁提取量隨著提取溫度的升高和提取時(shí)間的延長(zhǎng)均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)(圖6c)。這是因?yàn)?，根?jù)費(fèi)克定律，適當(dāng)延長(zhǎng)提取時(shí)間有利于蘆丁的浸出和擴(kuò)散，升高提取溫度有利于蘆丁擴(kuò)散與吸附。但是提取溫度過高或提取時(shí)間過長(zhǎng)，蘆丁會(huì)發(fā)生氧化分解，導(dǎo)致提取量降低。

由圖6f可知，隨著提取溫度的升高提取量先升高后降低。隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，蘆丁提取量不斷升高；但是提取溶劑用量增加到一定程度后，蘆丁提取量升幅減小，說明有效物質(zhì)基本達(dá)到了分配平衡；若再增加提取溶劑用量，提取效果將不再明顯，反而增加了生產(chǎn)成本。因此，需要選擇適宜的料液比。

2.3.3最佳工藝條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過Design Expert 8.0軟件分析計(jì)算得出最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間1.97 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)58.88%、料液比1∶22.35、提取溫度64.88 ℃，蘆丁提取量預(yù)測(cè)值為6.754 mg·(100 g)-1。

結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，將各參數(shù)調(diào)整為：提取時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶22、提取溫度65 ℃。在此條件下提取3次，蕎麥莖蘆丁平均提取量為6.752 mg·(100 g)-1，RSD為0.347%。表明該模型優(yōu)化的提取工藝穩(wěn)定性好，與實(shí)際情況擬合性良好。

3　結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)確定乙醇提取蕎麥莖中蘆丁的最佳工藝條件為：提取時(shí)間2.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶22、提取溫度65 ℃，此工藝下，蘆丁提取量達(dá)到6.752 mg·(100 g)-1。該優(yōu)化工藝能在較低溫度和較短時(shí)間內(nèi)提取蕎麥莖中的蘆丁，且提取量與模型預(yù)測(cè)值接近，工藝穩(wěn)定、安全可行。本研究可為蕎麥莖的開發(fā)和利用提供參考，并為相關(guān)食品和藥品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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Optimization of Extraction Process of Rutin from Buckwheat Straw by Response Surface Methodology

LI Bai-cun

(InstituteofBio-Engineering,ShaanxiXueqianNormalUniversity,Xi′an710100,China)

Theextractionprocessofrutinwasoptimizedusingbuckwheatstrawasarawmaterial.Effectsoffourfactorsincludingsolid-liquidratio,extractiontemperature,ethanolvolumefractionandextractiontimeonextractionamountofrutinwereinvestigatedbysinglefactorexperimentandresponsesurfacemethodology.Resultsindicatedthat,factorsinfluencingtherutinextractionamountwereintheorderasfollows:solid-liquidratio>extractiontemperature>ethanolvolumefraction>extractiontime.Theoptimumextractionconditionsofrutinfrombuckwheatstrawwereasfollows:solid-liquidratioof1∶22(g∶mL),extractiontemperatureof65 ℃,ethanolvolumefractionof60%,andextractiontimeof2.0h.Underaboveconditions,theextractionamountofrutinreached6.752mg·(100g)-1.

buckwheatstraw;rutin;extractionprocess;responsesurfacemethodology;optimization

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2015NY041)，陜西學(xué)前師范學(xué)院科研項(xiàng)目(2015YBKJ030)

10.3969/j.issn.1672-5425.2016.10.009

R 284.2

A

1672-5425(2016)10-0039-06

李白存.響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥莖中蘆丁的提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2016，33(10)：39-44.