過表達(dá)TaPK-R1基因增強(qiáng)了小麥對(duì)紋枯病的抗性和耐凍性

羅美英榮 瑋魏學(xué)寧楊 坤徐惠君禤維言張?jiān)銎G,*廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 廣西南寧 530004;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 0008

過表達(dá)TaPK-R1基因增強(qiáng)了小麥對(duì)紋枯病的抗性和耐凍性

羅美英1,2榮 瑋2魏學(xué)寧2楊 坤2徐惠君2禤維言1,*張?jiān)銎G2,*
1廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 廣西南寧 530004;2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081

小麥紋枯病菌(Rhizoctonia cerealis)和倒春寒是小麥生產(chǎn)中重要的生物和非生物脅迫因子, 本研究目的是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良小麥的紋枯病抗性和耐冷性。利用構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因載體pAHC25-MYC-TaPK-R1, 通過基因槍介導(dǎo)法,將小麥AGC蛋白激酶基因TaPK-R1導(dǎo)入春小麥品種揚(yáng)麥20, 獲得TaPK-R1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥。對(duì)T1至T4代植株進(jìn)行PCR、RT-PCR、qRT-PCR、Western blot分析, 篩選到3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系, 外源TaPK-R1基因能夠在其植物體內(nèi)遺傳和超量轉(zhuǎn)錄, 并翻譯成蛋白質(zhì)。利用致病力不同的R.cerealis菌株R0301和WK207, 分別對(duì)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系T1至T2代和T3至T4代進(jìn)行紋枯病抗性鑒定, 發(fā)現(xiàn)TaPK-R1過量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因小麥的紋枯病抗性, 3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系各世代的紋枯病平均病級(jí)為1.16~2.11, 病情指數(shù)為23.20~42.10, 而對(duì)照揚(yáng)麥20的紋枯病病級(jí)為2.55~3.60, 病情指數(shù)為51.00~72.00。用-9℃低溫處理三葉一心期小麥幼苗24 h, 對(duì)照揚(yáng)麥20的存活率為17%, 3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系的存活率分別為52%、79%和96%。上述結(jié)果表明, TaPK-R1過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)小麥對(duì)紋枯病的抗性及對(duì)凍害的耐受性, 所獲得的3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系可作為潛在的抗源材料。

小麥; 紋枯病; 蛋白激酶; TaPK-R1; 凍害

紋枯病是我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的主要土傳病害, 由腐生型真菌禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染引起。禾谷絲核菌能感染小麥的莖、葉鞘, 導(dǎo)致小麥生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受阻, 影響小麥的品質(zhì)和產(chǎn)量。在2005—2015年間, 我國(guó)每年約有667~800萬公頃小麥遭受紋枯病的侵害, 年均經(jīng)濟(jì)損失在10億元以上[1-2]。由于目前缺乏抗源材料, 小麥紋枯病抗性改良難以通過常規(guī)育種實(shí)現(xiàn)。全球氣候變暖導(dǎo)致極端氣候頻繁出現(xiàn), 近年來早春“倒春寒”時(shí)常發(fā)生, 對(duì)我國(guó)小麥生產(chǎn)造成威脅, 不僅減產(chǎn), 甚至顆粒無收[3], 因而小麥抗寒性也日益受到重視。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù), 創(chuàng)制小麥抗病、耐逆新種質(zhì), 一方面為小麥品種改良提供抗源儲(chǔ)備, 另一方面也是進(jìn)行小麥抗生物和非生物逆境機(jī)制的重要研究材料。

植物對(duì)腐生真菌的防御反應(yīng)過程復(fù)雜, 涉及蛋白激酶激活和多種信號(hào)傳遞等事件[4-5]。蛋白激酶A/蛋白激酶G/蛋白激酶C (AGC蛋白激酶), 是植物蛋白激酶的一個(gè)亞家族, 均包括C端的絲氨酸/蘇氨酸特異性的激酶催化結(jié)構(gòu)域, 同源于依賴cAMP (環(huán)腺苷酸)的蛋白激酶A、依賴cGMP (環(huán)鳥苷酸)的蛋白激酶G和磷脂依賴的蛋白激酶C[6]。AGC蛋白激酶參與植物的多種生理過程, 如生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、植物的免疫反應(yīng)等[7-9]。在擬南芥中, AGC蛋白激酶OXI1是H2O2和纖維素酶激活MPK3和MPK6所必需的, 并參與擬南芥對(duì)霜霉病菌(Hyaloperonospora parasitica)和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的基礎(chǔ)抗性反應(yīng)[10-11]。本課題組研究發(fā)現(xiàn), TaAGC1在小麥中過表達(dá)可上調(diào)活性氧清除酶及defensin、TaPIE1等防御基因的表達(dá), 進(jìn)而提高小麥對(duì)紋枯病抗性[12]; 小麥ERF基因TaPIE1的過量表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)紋枯病的抗性及對(duì)冷害的耐受性[13]。最近, Alexandra等[14]將一個(gè)葡萄鈣依賴蛋白激酶基因VaCPK20轉(zhuǎn)入擬南芥, VaCPK20過量表達(dá)顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)低溫、干旱的耐性。

本課題組曾克隆出一個(gè)受紋枯病菌誘導(dǎo)的小麥AGC蛋白激酶基因TaAGC1, 又名為TaPK-R1[12]。為了深入解析TaPK-R1的生物學(xué)功能, 本研究構(gòu)建了該基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因載體pAHC25-MYC-TaPKR1, 并將其轉(zhuǎn)入推廣的春性小麥; 通過轉(zhuǎn)基因分子特征分析、紋枯病抗性和抗冷性鑒定, 明確了TaPK-R1基因過表達(dá)能顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)紋枯病的抗性及對(duì)凍害的耐受性, 篩選出既抗紋枯病又耐凍害的轉(zhuǎn)基因小麥新種質(zhì)3份。

1 材料與方法

1.1 材料

春小麥品種揚(yáng)麥20由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院揚(yáng)州里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所張伯橋研究員惠贈(zèng)。禾谷絲核菌R0301是江蘇地區(qū)小麥紋枯病的主要致病菌株, 由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳懷谷研究員惠贈(zèng); 禾谷絲核菌WK207是采自山東泰安的小麥紋枯病強(qiáng)致病菌株, 由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院于金鳳教授惠贈(zèng)。

1.2 轉(zhuǎn)基因載體pAHC25-MYC-TaPK-R1的構(gòu)建

利用PCR擴(kuò)增法, 在小麥AGC蛋白激酶基因TaPK-R1 (GenBank登錄號(hào)為KJ686386)的ORF完整序列[12]的上、下游分別引入限制酶Spe I和Sac I酶切位點(diǎn), 用這2個(gè)限制酶酶切后, 再與pAHC25-MYC載體[12,15]骨架連接, 將TaPK-R1基因的ORF取代載體pAHC25-MYC中的GUS基因[15], 構(gòu)建成TaPK-R1過量表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體pAHC25-MYC-TaPK-R1 (圖1)。通過測(cè)序分析確定構(gòu)建的基因表達(dá)載體的正確性。在該載體中, TaPK-R1基因的轉(zhuǎn)錄受玉米Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng), 終止由根癌農(nóng)桿菌胭脂氨酸合成酶基因的3′非轉(zhuǎn)錄區(qū)(TNOS)控制。

1.3 轉(zhuǎn)基因小麥的獲得

按照徐惠君等[16]建立的基因槍轟擊小麥幼胚的方法, 采用包裹pAHC25-MYC-TaPK-R1質(zhì)粒的金粉轟擊揚(yáng)麥20幼胚愈傷組織, 并通過篩選、分化、再生、移栽成苗等步驟, 獲得再生小麥植株。從轉(zhuǎn)TaPK-R1基因PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因小麥T0代植株上收獲T1代種子, 單株播種T1代轉(zhuǎn)基因植株, 依此類推。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株中外源基因的分子特征分析

1.4.1 PCR檢測(cè) 在小麥二葉一心期, 取每株成活再生植株的1個(gè)葉片, 采用CTAB法[17]提取基因組DNA。以該基因組DNA為模板, 利用嵌合引物進(jìn)行目的轉(zhuǎn)基因的PCR鑒定, 上游引物為TaPK-R1基因開放閱讀框(ORF)特異的一段序列(TaPK-R1-1584F: 5′-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3′), 下游引物載體TNOS特異的一段序列(TNOS-3214L: 5′-AAAACCC ATCTCATAAATAACG-3′)。以轉(zhuǎn)基因載體pAHC25-MYC-TaPK-R1質(zhì)粒DNA為陽(yáng)性對(duì)照, 以未轉(zhuǎn)基因受體(揚(yáng)麥20)的基因組DNA為陰性對(duì)照, 預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段為386 bp。反應(yīng)體系含2×Taq MasterMix(康為世紀(jì)) 10 μL, 上、下游引物 (10 μmol L-1)各1 μL, 模板DNA 100 ng, 補(bǔ)ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 8 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 33個(gè)循環(huán); 72℃, 8 min, 16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離, ethidium bromide染色。

1.4.2 低溫誘導(dǎo)小麥中TaPK-R1轉(zhuǎn)錄分析 將受體揚(yáng)麥20和轉(zhuǎn)基因小麥于-9℃下低溫誘導(dǎo)24 h, 從每個(gè)株系取5個(gè)植株的葉片, 混合后用TRIzol試劑(Invitrogen)提取葉片總RNA, 按cDNA合成試劑盒FastQuant RT kit (含DNA酶, TIANGEN)說明書合成第1鏈cDNA, 然后進(jìn)行RT-PCR和qRT-PCR分析。引物為TaPK-R1-QF (5′-ATGAAGTTGCCGGGATTG C-3′)和TaPK-R1-QR (5′-CGGCGAACCAAACAGG-3′), 內(nèi)參基因?yàn)門aActin (TaActin-F: 5′-CACTGGAA TGGTCAAGGCTG-3′; TaActin-R: 5′-CTCCATGTCA TCCCAGTTG-3′)。

圖1 pAHC25-MYC-TaPK-R1表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Structure of the plant expression vector pAHC25-MYC-TaPK-R1

RT-PCR擴(kuò)增體系含2×Taq MasterMix (康為世紀(jì)) 12.5 μL, 上、下游引物(10 μmol L-1)各1 μL, 均一化后模板cDNA 1 μL, 補(bǔ)ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 8 min; 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 30 s, 27個(gè)循環(huán); 72℃ 8 min, 16℃保存。

在ABI PRISMR7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó))上進(jìn)行實(shí)時(shí)qRT-PCR分析, 反應(yīng)體系25 μL, 按SuperRealPreMix Plus (SYBRGreen, TIANGEN)反應(yīng)體系, 擴(kuò)增程序: 95℃預(yù)變性15 min; 95℃變性10 s, 57℃退火20 s, 72℃延伸32 s, 40個(gè)循環(huán)。對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn), 以受體揚(yáng)麥20為對(duì)照, 用2-ΔΔCT方法[18]計(jì)算低溫處理轉(zhuǎn)基因小麥中TaPK-R1基因的相對(duì)表達(dá)量。用Microsoft Excel軟件進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)(兩尾測(cè)驗(yàn)), 將P < 0.01視為具有顯著性差異。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株蛋白質(zhì)的提取及Western blot分析

選取耐冷的 T4代轉(zhuǎn)基因小麥株系中 PCR陽(yáng)性的植株, 提取苗期葉片總蛋白, 在液氮中充分研磨小麥葉片, 加入蛋白質(zhì)提取液混勻。該蛋白提取液含62.5 mmol L-1Tris-HCl (pH 7.4)、10%甘油、0.1% SDS、2 mmol L–1Na2EDTA、1 mmol L–1PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)和5% β-巰基乙醇。將混合液置冰上10 min, 然后于4℃下13 400 ×g離心 20 min, 上清液即為總蛋白質(zhì)。將總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 再用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)到PVDF膜; 利用麗春紅(ponceaux)對(duì)轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜染色, 以檢查轉(zhuǎn)膜是否成功, 再使用 ddH2O將染料洗凈; 在封閉液中與稀釋3000倍的anti-c-MYC抗體(一抗, 北京全式金生物技術(shù)有限公司) 4℃孵育12 h, 用TBST將雜交膜清洗干凈后, 與稀釋3000倍的Goat Anti-Mouse IgG (H+L)抗體(二抗, 北京全式金生物技術(shù)有限公司) 24~26℃孵育 1 h, 化學(xué)發(fā)光后進(jìn)行曝光顯影, 檢測(cè)c-MYC-TaPK-R1融合蛋白是否在過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥株系中翻譯表達(dá)。使用EasySee Western Marker (北京全式金生物技術(shù)有限公司)標(biāo)記顯影蛋白分子量。

1.6 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因株系的表型鑒定

1.6.1 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)寒冷逆境的耐受性 采用常規(guī)花盆土培法, 種植轉(zhuǎn)基因株系及其受體揚(yáng)麥 20(對(duì)照)各36株, 生長(zhǎng)條件為22℃光照14 h, 12℃黑暗10 h。于二葉一心期, 每株取 1個(gè)葉片提取基因組DNA, 并以此為模板, 利用 TaPK-R1基因嵌合引物進(jìn)行 PCR鑒定, 將 PCR檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系R1-4、R1-8、R1-9的植株(分別為 25、24、24株)及對(duì)照植株于三葉一心期, 移至4℃鍛煉12 h, 再移至-6℃鍛煉12 h, 最后移至-9℃冰箱中, 每6 h作為一個(gè)處理。-9℃處理 24 h, 將過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小麥株系置正常生長(zhǎng)環(huán)境中, 觀察并記錄低溫處理后恢復(fù)生長(zhǎng)的情況, 統(tǒng)計(jì)存活率。用 Microsoft Excel對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照進(jìn)行 t-測(cè)驗(yàn)(兩尾測(cè)驗(yàn)), 在 P<0.01概率水平判斷差異顯著性。

1.6.2 轉(zhuǎn)基因株系對(duì)紋枯病抗性鑒定 采用常規(guī)花盆土培法種植, 生長(zhǎng)條件為 22℃光照14 h, 12℃黑暗10 h。根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果, 陽(yáng)性植株用于病級(jí)鑒定, 其中 T1代陽(yáng)性植株共 32株, R1-4、R1-8和R1-9株系分別有9、11和12株; T2代陽(yáng)性植株共50 株, 3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別有15、18和17株; T3代陽(yáng)性植株共66株, 上述3個(gè)株系依次為21、24和21 株; T4代陽(yáng)性植株共 73株, 3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系分別為25、24和24株。受體對(duì)照植株數(shù)依次為15、20、30和30株。在滅菌的麥粒上培養(yǎng)紋枯病菌, 待麥粒表面長(zhǎng)滿菌絲后接種。小麥分蘗盛期, 用消毒鑷子夾取長(zhǎng)滿菌絲的麥粒, 放入麥苗根基部, 每株放4~5 粒, 保濕3~5 d[19-20]; 成熟期調(diào)查紋枯病抗性, 按照王裕中等[21]介紹的方法和我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1443.5-2007《小麥抗病蟲性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》劃分病級(jí)(嚴(yán)重度), 其中0級(jí)為無癥狀; 1級(jí)為葉鞘變褐, 有病斑, 但病菌未侵入莖稈; 2級(jí)為病菌侵入莖稈, 病斑環(huán)繞莖稈不超過 1/2; 3級(jí)為病斑環(huán)繞莖稈的1/2~3/4; 4級(jí)為病斑環(huán)繞莖稈的3/4以上; 5級(jí)為出現(xiàn)枯、白穗或整株死亡。按上述標(biāo)準(zhǔn)及蔡士賓等[22]報(bào)道的方法計(jì)算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥的獲得及PCR檢測(cè)

用包裹pAHC25-MYC-TaPK-R1質(zhì)粒的金粉子彈, 轟擊揚(yáng)麥20幼胚愈傷組織, 共轟擊2500個(gè)幼胚愈傷組織, 經(jīng)篩選、分化, 獲得80株再生植株, 利用轉(zhuǎn)基因特異性引物進(jìn)行PCR分析, 檢測(cè)出T0代轉(zhuǎn)基因小麥PCR陽(yáng)性植株11株, 轉(zhuǎn)化率為0.44%。

提取轉(zhuǎn)基因小麥T0~T4代植株葉片基因組DNA,對(duì)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥T0~T4代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)表明, 11個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系的T0~T4代植株中均能檢測(cè)到外源TaPK-R1 基因, 說明導(dǎo)入的TaPK-R1基因在這11個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系中能遺傳。

從中挑選出對(duì)紋枯病抗性較好、來自不同基因槍幼胚的三個(gè)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥株系(R1-4、R1-8 和R1-9)(圖2), 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平、蛋白表達(dá)水平、抗病性與對(duì)低溫的耐受性等研究。

圖2 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥的T0至T4代PCR檢測(cè)圖譜Fig.2 PCR analysis of TaPK-R1 transgenic wheat plants in the T0to T4generations

2.2 轉(zhuǎn)基因小麥株系中TaPK-R1的轉(zhuǎn)錄分析

以抗病、耐凍害的轉(zhuǎn) TaPK-R1基因小麥株系(R1-4、R1-8和R1-9) T4代植株及未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20 (受體)葉片RNA為試材, RT-PCR和qRT-PCR分析表明, 這3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系中TaPK-R1的轉(zhuǎn)錄水平均高于未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20 (圖3-A), 分別是未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20的6.0、5.5和11.6倍(圖3-B)。上述結(jié)果說明這3個(gè)抗病、耐凍害的轉(zhuǎn)基因小麥株系中TaPK-R1基因超量表達(dá)了。

圖3 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥中TaPK-R1基因轉(zhuǎn)錄的RT-RCR(A) 和qRT-PCR(B)分析Fig.3 RT-RCR (A) and qRT-PCR (B) assay on TaPK-R1 transcriptional level in the transgenic lines and its wild-type

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的Western blot分析

在pAHC25-MYC-TaPK-R1載體中, TaPK-R1基因上游與6倍c-MYC標(biāo)簽序列相融合, 便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。提取轉(zhuǎn)基因小麥株系R1-4、R1-8和R1-9陽(yáng)性植株的葉片蛋白, 與anti-c-MYC抗體進(jìn)行Western blot分析, 以在蛋白水平檢測(cè)外源TaPK-R1基因在3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系中的表達(dá)情況。Western blot分析結(jié)果表明, 未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20的總蛋白不能與anti-c-MYC抗體產(chǎn)生雜交條帶, 而上述3個(gè)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥株系均產(chǎn)生與anti-c-MYC抗體雜交的條帶(圖4), 說明c-MYCTaPK-R1基因能夠在這3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系中高水平翻譯表達(dá)。

2.4 轉(zhuǎn)基因小麥的耐凍性鑒定

種植轉(zhuǎn)基因小麥株系R1-4、R1-8、R1-9及未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20 (對(duì)照)各36株, 經(jīng)TaPK-R1基因嵌合引物PCR擴(kuò)增檢測(cè), 3個(gè)株系的陽(yáng)性株分別為25、24、24株。對(duì)陽(yáng)性株三葉一心期幼苗于-9℃分別處理6、12、18和24 h, 然后恢復(fù)生長(zhǎng)3 d, 統(tǒng)計(jì)存活率。-9℃處理18 h, 3個(gè)過表達(dá)TaPK-R1轉(zhuǎn)基因小麥株系的存活率為56%、92%和96%, 對(duì)照存活率為42%;處理24 h, 3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系仍有52%、79%、96%的存活率, 而對(duì)照的存活率僅為17% (圖5), 表明過量表達(dá)TaPK-R1基因提高了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)寒冷環(huán)境的耐受性。

圖4 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥中c-MYC-TaPK-R1蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of c-MYC-TaPK-R1 protein in transgenic wheat plants

2.6 轉(zhuǎn)基因小麥的紋枯病抗性鑒定

圖5 TaPK-R1基因過表達(dá)株系植株對(duì)寒冷(-9°C)逆境的適應(yīng)性Fig.5 Tolerant phenotypes of TaPK-R1 transgenic lines under freezing (-9°C) treatment

用來源不同、致病力不同的禾谷絲核菌強(qiáng)致病株型R0301和WK207, 對(duì)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥T1和T2代(R0301)、T3和T4代(WK207)植株分別進(jìn)行紋枯病抗性鑒定。與未轉(zhuǎn)基因小麥揚(yáng)麥20相比, 3個(gè)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因株系T1至T4代陽(yáng)性植株的病級(jí)與病情指數(shù)均顯著降低(表1), 如T1代轉(zhuǎn)基因小麥的平均病級(jí)為1.80、2.00和2.11, 病情指數(shù)為36.00、40.00和42.20, 而未轉(zhuǎn)基因揚(yáng)麥20的平均病級(jí)為3.60, 病情指數(shù)為72.00; T4代轉(zhuǎn)基因小麥的平均病級(jí)為1.41、1.35、1.30, 病情指數(shù)為28.20、27.00和26.00, 而未轉(zhuǎn)基因小麥?zhǔn)荏w揚(yáng)麥20的平均病級(jí)為2.55, 病情指數(shù)為51.00。

表1 轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥及受體的紋枯病抗性鑒定Table1 Responses of TaPK-R1 transgenic and recipient wheat lines to R.cerealis

3 討論

近年來, 紋枯病已發(fā)展為我國(guó)小麥生產(chǎn)的主要病害。小麥對(duì)紋枯病抗性由多個(gè)數(shù)量基因控制[2,23],加之在小麥育種和生產(chǎn)過程中紋枯病抗性鑒定困難,致使常規(guī)育種進(jìn)展緩慢。因此, 發(fā)掘和克隆抗紋枯病重要基因、開展高效的分子育種, 非常重要。綜合應(yīng)用比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)、生物信息學(xué)與功能解析等方法, 本課題組發(fā)現(xiàn)幾個(gè)小麥基因參與寄主抗紋枯病反應(yīng)[12-13,24-26], 其中包括小麥AGC蛋白激酶基因TaAGC1 (TaPK-R1)。極端低溫是影響植物生長(zhǎng)、發(fā)育的環(huán)境脅迫因子之一, 導(dǎo)致植物產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中逐漸建立了適應(yīng)和抗性機(jī)制, 通過一系列基因和酶的表達(dá)與生理生化變化來適應(yīng)低溫等逆境[27-29]。Xiang等[28]研究表明, 在OsCIPK03過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻中, 脯氨酸合成酶基因表達(dá)量和脯氨酸含量顯著提高, 從而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)冷、旱、鹽、堿性脅迫的耐受性。Zhu 等[13]研究表明, 小麥ERF基因TaPIE1的過量表達(dá),能顯著提高轉(zhuǎn)TaPIE1基因小麥中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、活性氧清除酶、防衛(wèi)與脅迫相關(guān)基因表達(dá)量, 從而顯著提高轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)紋枯病的抗性及對(duì)冷害的耐受性。TaAGC1 (TaPK-R1)正向調(diào)控 TaPIE1基因的表達(dá)[12], 但TaPK-R1基因能否提高小麥對(duì)寒冷的耐受性未見報(bào)道。

為進(jìn)一步研究TaPK-R1基因的生物學(xué)功能, 我們創(chuàng)制了TaPK-R1過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小麥, 其中3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系(R1-4、R1-8和R1-9), 對(duì)紋枯病抗性較好, 且來源于不同批次基因槍轟擊的小麥幼胚,可能是3個(gè)獨(dú)立株系, 今后有必要用Southern雜交結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。對(duì)上述3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥株系T0至T4代連續(xù)PCR檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄分析表明, 各株系中轉(zhuǎn)入的TaPK-R1基因能穩(wěn)定遺傳、超量表達(dá); Western雜交分析結(jié)果表明, 在上述3個(gè)轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥株系中,轉(zhuǎn)入的TaPK-R1基因可以翻譯成表達(dá)蛋白。此外, 本研究采用南方和北方致病力不同的2個(gè)紋枯病菌(R0301和WK207)進(jìn)行抗病性鑒定, 對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥T1至T4代接種鑒定, 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥對(duì)不同紋枯病菌的病級(jí)(嚴(yán)重度)和病情指數(shù)均顯著降低, 說明TaPK-R1過量表達(dá)顯著提高了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)來源不同、致病力不同的禾谷絲核菌的抗性, 創(chuàng)制的這3個(gè)轉(zhuǎn)基因小麥種質(zhì)對(duì)紋枯病具有廣譜抗性,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。對(duì)T4代轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行–9℃低溫處理, 結(jié)果表明, 過量表達(dá)TaPK-R1基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)寒冷環(huán)境的耐受性?？傊? TaPK-R1在小麥防御紋枯病和低溫脅迫的響應(yīng)中具有重要正向調(diào)控作用。

另外, –9℃處理24 h測(cè)定結(jié)果表明, 在未轉(zhuǎn)基因揚(yáng)麥20葉片組織中的電導(dǎo)率顯著高于轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥株系; 而過量表達(dá)的轉(zhuǎn)TaPK-R1基因小麥株系(R1-4、R1-8和R1-9)中游離脯氨酸含量顯著提高, 3個(gè)株系中分別為291.43、324.76和274.83 μg g-1, 而未轉(zhuǎn)基因揚(yáng)麥20的游離脯氨酸含量?jī)H為71.19 μg g-1。說明, TaPK-R1基因通過提高植物游離脯氨酸積累量和調(diào)控其他生理生化反應(yīng)來維持細(xì)胞質(zhì)膜的完整性, 從而增強(qiáng)了小麥對(duì)低溫逆境的耐受性。

4 結(jié)論

將TaPK-R1轉(zhuǎn)入春小麥品種揚(yáng)麥20; 經(jīng)過分子特征分析與逆境脅迫篩選, 獲得了兼抗紋枯病與凍害的轉(zhuǎn) TaPK-R1基因小麥新材料 3份, 說明TaPK-R1在小麥防御紋枯病和低溫脅迫反應(yīng)中可能具有一定的調(diào)控作用。

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TaPK-R1 Overexpressing Transgenic Wheat Lines Enhance Resistance to Sharp Eyespot and Freezing Stress

LUO Mei-Ying1,2, RONG Wei2, WEI Xue-Ning2, YANG Kun2, XU Hui-Jun2, XUAN Wei-Yan1,*, and ZHANG Zeng-Yan2,*
1Agricultural College of Guangxi University, Nanning 530004, China;2The National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

Sharp eyespot caused by Rhizoctonia cerealis is a soil-borne disease and freezing stress is one of the major abiotic stresses in wheat production.The object of this study was to improve wheat resistance to sharp eyespot and freezing using transgenic technique.The transformation vector pAHC25-MYC-TaPK-R1 expressing the wheat AGC protein kinase gene TaPK-R1 was constructed and transformed into the spring wheat Chinese cultivar Yangmai 20 through particle bombardment.The transformed T1to T4plants were subjected to PCR, RT-PCR, qRT-PCR, and Western blot analyses.Three transgenic wheat lines were generated and screened, in which the introduced TaPK-R1 transgene was inherited and expressed in higher level.After inoculation with R.cerealis virulent-isolate R0301 or WK207, these three TaPK-R1-overexpressing transgenic wheat lines displayed significant improved resistance to sharp eyespot.The infection types of these 3 transgenic lines in T1to T4generations were 1.16–2.11, and their disease indices were 23.20–42.10.At the same time, the infection types and disease indexes of the non-transformed wheat Yangmai 20 were 2.55–3.60 and 51.00–72.00, respectively.The three-leaf wheat seedlings were treated with-9°C for 24 hours.Freezing tolerances of the three transgenic lines were dramatically improved, whose survival rates were 52%, 79%, and 96%, respectively, and significantly higher (P < 0.01) than that of the non-transformed Yangmai 20 (survival rate of 17%).Our results indicate that resistance/tolerance to sharp eyespot and freezing stress could be significantly enhanced in TaPK-R1overexpressing transgenic wheat.The three transgenic lines may serve as potential resource in wheat breeding aiming at resistance improvement to sharp eyespot and freezing stress.

Wheat; Sharp eyespot; Protein kinase; TaPK-R1; Freezing; Enhanced resistance

10.3724/SP.J.1006.2016.01601

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271799)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271799).

*通訊作者(Corresponding authors): 禤維言: E-mail: xuanweiyan_1@163.com; 張?jiān)銎G, E-mail: zhangzengyan@caas.cn

聯(lián)系方式: E-mail: luo_meiying@yeah.net, Tel: 13687719647

稿日期): 2016-03-09; Accepted(接受日期): 2016-07-11; Published online(

日期): 2016-08-11.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160811.0820.008.html