小五臺(tái)山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定

何靜超，胡嵐嵐，郭晨輝，張鋒

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定　071002)

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小五臺(tái)山蟹蛛DNA條形碼分子鑒定

何靜超，胡嵐嵐，郭晨輝，張鋒

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北保定071002)

為了探討DNA條形碼技術(shù)在蟹蛛科蜘蛛物種鑒定中的可行性，本研究基于線粒體COI基因序列，使用鄰接法和貝葉斯法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，ABGD(automatic barcode gap discovery)軟件對(duì)樣本進(jìn)行劃分，對(duì)小五臺(tái)山25種蟹蛛110個(gè)樣本進(jìn)行DNA條形碼分子鑒定.結(jié)果表明：鄰接法和貝葉斯法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)聚類結(jié)果與ABGD軟件劃分結(jié)果以及形態(tài)分類鑒定結(jié)果相一致.據(jù)此筆者認(rèn)為DNA條形碼作為一種有效的分子鑒定工具可以應(yīng)用到蟹蛛科蜘蛛物種鑒定中.

蟹蛛科；DNA條形碼；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；ABGD

科學(xué)準(zhǔn)確的物種鑒定是深入開(kāi)展生物多樣性、環(huán)境監(jiān)測(cè)、生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、人口健康和醫(yī)學(xué)等多學(xué)科研究和利用的前提[1].傳統(tǒng)的分類學(xué)研究對(duì)標(biāo)本的完整性要求較高，且需要通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的專業(yè)訓(xùn)練才能培養(yǎng)出精通于特定類群的分類學(xué)專家.除此之外，由于形態(tài)學(xué)鑒定存在局限性并且分類學(xué)家隊(duì)伍也在不斷縮減，使得進(jìn)化分類學(xué)的發(fā)展面臨著巨大的挑戰(zhàn)[2].

Hebert等[3-4]于2003年提出利用一段較短的DNA序列作為分子標(biāo)記可以精準(zhǔn)地進(jìn)行物種鑒定，此技術(shù)稱為DNA條形碼技術(shù).同時(shí)他們認(rèn)為動(dòng)物的DNA條形碼可以用線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶I(COI)5′端一段長(zhǎng)度為658 bp的DNA序列表示.

到目前為止，DNA條形碼技術(shù)已應(yīng)用到大部分動(dòng)物物種鑒定中[5-13]，其中包括鳥(niǎo)類、魚(yú)類、昆蟲(chóng)、哺乳類、兩棲類、獸類、浮游和海洋小型底棲動(dòng)物等.該片段不僅可在物種水平上對(duì)絕大多數(shù)動(dòng)物類群進(jìn)行鑒定，還能夠準(zhǔn)確地區(qū)分近緣類群,同時(shí)也是鑒定新種與發(fā)現(xiàn)隱存種的良好工具，并用于快速構(gòu)建不同分類階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[14].因此，COI基因已被公認(rèn)為動(dòng)物DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼片段并得到廣泛應(yīng)用.但是由于DNA條形碼的COI基因位于線粒體上，而線粒體是母系遺傳，因此在鑒定存在雜交的生物類群時(shí)存在缺陷[15]，對(duì)于存在不完全支序演化與基因滲入現(xiàn)象的生物類群，DNA條形碼難以區(qū)分[16].例如：蠅屬中大約有60%的物種無(wú)法用COI基因進(jìn)行鑒別，因?yàn)橐恍┓N的條形碼是一樣的；在對(duì)珊瑚蟲(chóng)的研究中發(fā)現(xiàn)COI基因在不同的物種間變化極小，因此也不能成功地鑒別該物種[1].Sperling利用COI基因分析昆蟲(chóng)，結(jié)果顯示：至少有1/4的昆蟲(chóng)物種很難被區(qū)分[17].而蜘蛛類此方面的報(bào)道甚少，因此，利用COI基因?qū)χ┲脒M(jìn)行物種鑒定的可行性有待于證明.

蟹蛛科Thomisidae是蜘蛛目中的第7大科[18]，物種多樣性豐富，體型變化較大.傳統(tǒng)的蟹蛛分類鑒定工作主要依據(jù)成熟標(biāo)本的外生殖器官來(lái)進(jìn)行分類，即雄蛛的觸肢器和雌蛛的外雌器.但對(duì)于外形相近的隱存種的鑒別、多組形態(tài)上相近物種的雌雄配對(duì)、同一物種受分布區(qū)域及生境變化引起的種內(nèi)差異以及發(fā)育未成熟物種的鑒定等問(wèn)題，單純依靠進(jìn)化分類學(xué)方法較難解決.有鑒于此，本研究選用分布于小五臺(tái)山的10屬25種蟹蛛作為實(shí)驗(yàn)材料，利用線粒體COI基因，進(jìn)行基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和距離方法的DNA條形碼分析，探索了DNA條形碼技術(shù)對(duì)蟹蛛科物種鑒定的準(zhǔn)確性，以探索建立快速高效的蜘蛛目物種分類的新方法.

1　材料與方法

1.1標(biāo)本采集及形態(tài)鑒定

本研究選用的110頭蜘蛛標(biāo)本均由本研究室成員于2013年6～9月和2014年6～9月在河北小五臺(tái)山(東經(jīng)114°50′～115°15′，北緯39°40′～40°10′)采得(表1).

標(biāo)本采集后保存于體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中，由本研究室成員進(jìn)行了形態(tài)學(xué)種類鑒定，并保存于河北大學(xué)博物館(MHBU).

表1　所用標(biāo)本信息Tab.1　Thomisidae samples used in this study

續(xù)表1 Continue tab.1

1.2DNA的提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

取樣本一側(cè)步足，在液氮中研磨后使用天根生化科技(北京)有限公司的TIANamp血液/組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒提取總DNA.

對(duì)于提取的總DNA使用通用引物L(fēng)CO 1490 (5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和HCO 2198 (5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)[19]進(jìn)行擴(kuò)增.PCR體系為25 μL：MasterMix 12.5 μL，LCO 1490(10 μmol/L)HCO 2198(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 8.9 μL， DNA模板2.0 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，33～35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min.

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將條帶清晰的PCR樣品送金維智生物科技有限公司(北京)進(jìn)行雙向測(cè)序.測(cè)序結(jié)果首先用Chromas軟件判斷峰圖質(zhì)量，并對(duì)每個(gè)堿基逐一進(jìn)行人工校對(duì)，然后用seqman軟件對(duì)雙向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后，以Fasta格式輸出.

1.3系統(tǒng)發(fā)育分析

1.3.1系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)校對(duì)的序列以園蛛科的1條COI序列為外群，用Clustal X[20]進(jìn)行比對(duì)，用MEGA 6.05[21]中的Kimura雙參數(shù)模型(Kimura-2-parameter，K2P)[22]計(jì)算種內(nèi)和種間遺傳距離，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展檢驗(yàn)值(Bootstrap)設(shè)置為1 000，得到NJ樹(shù)上各分支節(jié)點(diǎn)的支持率.使用 MrBayes v3.2.1[23]，以園蛛科的1條相應(yīng)序列為外群，構(gòu)建各單倍型的 Bayesian 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，替代模型為GTR+I.貝葉斯分析包含5×104generations 的運(yùn)算，以運(yùn)算得到的后驗(yàn)概率來(lái)標(biāo)示系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)各分支的置信度.

1.3.2BACODING GAP 分析

基于K2P模型使用MEGA6.05計(jì)算種內(nèi)及種間遺傳距離并在EXCEL中進(jìn)行距離統(tǒng)計(jì)，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果畫(huà)出頻率分布直方圖，進(jìn)行“barcoding gap”[24]分析.

1.3.3ABGD劃分

基于遺傳距離使用ABGD(automatic barcode gap discovery)軟件[25]對(duì)樣本進(jìn)行劃分，劃分在同一組的樣本被認(rèn)為是同一種.將111個(gè)樣本的基因序列的fasta文件在線提交到ABGD網(wǎng)站(http://wwwabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/)，其中種內(nèi)差異先驗(yàn)值P(prior intraspecific divergence)設(shè)置為0.001到0.1， 最小相對(duì)gap 寬度值X(minimum relative gap width)設(shè)置為1.0，將樣本劃分結(jié)果與形態(tài)鑒定結(jié)果逐一進(jìn)行比較.

2　結(jié)果及分析

2.1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的聚類分析

以樣本的總DNA為模板，將經(jīng)PCR擴(kuò)增、公司測(cè)序得到的110條長(zhǎng)度為658 bp的COI序列提交到中國(guó)生命條形碼數(shù)據(jù)門戶中心(http://www.barcodeoflife.cn/).

根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定，110頭蟹蛛標(biāo)本最終被鑒定為10屬25種.分別采用鄰接法和貝葉斯法，以1種園蛛的COI序列為外群構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和BI系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，聚類結(jié)果如圖1所示，圓花葉蛛Synemaglobosum和其他種的蜘蛛形成姐妹群，每個(gè)種聚類明顯，沒(méi)有出現(xiàn)物種交叉現(xiàn)象，并且均各自聚成一個(gè)單系群，且各單系分支的支持率均超過(guò)60%.

A.NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； B.BI 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)； n.序列條數(shù) group、ABGD自動(dòng)分組結(jié)果.圖1　基于COI序列構(gòu)建的小五臺(tái)山蟹蛛的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree of the spiders of thomisidae based on COI gene

2.2DNA條形碼的GAP分析

使用MEGA6.05基于K2P模型進(jìn)行“barcoding gap”分析，做頻率直方圖(圖2)，種內(nèi)遺傳距離為0～0.5%，平均為0.15%；種間遺傳距離為5.25%～23.06%，平均為13.97%；存在明顯的GAP區(qū)，即種內(nèi)的最大值小于種間的最小值，說(shuō)明所用蟹蛛科數(shù)據(jù)能夠很好地區(qū)分種內(nèi)和種間.

圖2　蟹蛛科COI序列遺傳距離分析Fig.2　Analysis of genetic distance of COI gene from Thomisidae taxa

2.3基于距離的分類分析

用ABGD軟件對(duì)111個(gè)樣本(包含外群)進(jìn)行劃分，結(jié)果包括初始劃分和遞歸劃分2種情況(圖3)：初始劃分較穩(wěn)定，111個(gè)樣本被分成26種；遞歸劃分把111個(gè)樣本分成1～36組，但是在很大的P值范圍內(nèi)都維持在26組.將初始劃分結(jié)果與進(jìn)化分類學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)初始劃分中每個(gè)分組的種與形態(tài)種均呈現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，基于樣本遺傳距離的ABGD方法鑒定25種蟹蛛的成功率為100%.

圖3　ABGD劃分結(jié)果Fig.3　Automatic partition results of ABGD

3　討論

本研究利用通用引物對(duì)河北小五臺(tái)山的110頭蟹蛛進(jìn)行了COI基因序列的擴(kuò)增，利用鄰接法和貝葉斯法分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示所有的種均各自聚成了一個(gè)單系群.對(duì)種內(nèi)和種間遺傳距離分析可得，種間平均遺傳距離(13.97%)是種內(nèi)平均遺傳距離(0.15%)的93.1倍，符合種間差異是種內(nèi)差異的10倍[3]的DNA條形碼有效性的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn).因此，COI序列在蜘蛛目蟹蛛科的鑒定中具有較高的準(zhǔn)確性，可以作為鑒定小五臺(tái)山蟹蛛的DNA條形碼.

在某些類群中由于線粒體基因置換速率不同，出現(xiàn)了種內(nèi)和種間遺傳距離出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，導(dǎo)致難以界定種內(nèi)和種間差異的閾值標(biāo)準(zhǔn)[2].ABGD方法能成功解決上述難題，因?yàn)锳BGD是基于一定范圍的先驗(yàn)值P自動(dòng)的探測(cè)給定數(shù)據(jù)集的“barcoding gap”,在一定程度上能降低閾值定義的人為因素，減少了基于距離分類的主觀性，并且擁有很高的準(zhǔn)確性.在本研究中顯示出ABGD的分組結(jié)果與形態(tài)分種結(jié)果完全一致.由于DNA條形碼技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地鑒別物種，并能發(fā)現(xiàn)新種與隱存種而被廣泛應(yīng)用.目前這種技術(shù)也廣泛地應(yīng)用到蛛形綱動(dòng)物中，如Zhang等[26]于2014年利用COI和其他基因片段來(lái)研究洞穴蜘蛛隱存種的多樣性；Huber等[27]于2009年利用形態(tài)與分子結(jié)合的方法對(duì)幽靈蛛科的Tainonia屬進(jìn)行了修訂.Franzini 等[28]利用COI和H3基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并且與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)了園蛛科的新種.Zhang等[29]利用COI及其他基因片段研究了跳蛛科斑蛛亞科的分子系統(tǒng)學(xué)、分歧時(shí)間和生物地理分布，結(jié)果顯示采用的263頭標(biāo)本通過(guò)貝葉斯法、最大似然法和簡(jiǎn)約法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中支持斑蛛亞科為單系的有85屬，進(jìn)而對(duì)斑蛛亞科進(jìn)行了屬級(jí)修訂.

不可否認(rèn)，DNA數(shù)據(jù)具有很強(qiáng)的可靠性，但如果只依靠DNA數(shù)據(jù)而忽略其他因素，得到的僅僅是序列相似性模式，而不是進(jìn)化模式.因此，用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行分析時(shí)不能脫離形態(tài)學(xué)手段.除此以外，由于單分子標(biāo)記的局限性，應(yīng)該將其他基因片段與COI一起作為DNA條形碼的標(biāo)記基因，以適應(yīng)物種鑒定的需要[30].

雖然條形碼技術(shù)受到一些專家的質(zhì)疑，但DNA信息的豐富性和獨(dú)一無(wú)二的可重復(fù)性，以及在動(dòng)物、植物和微生物中已經(jīng)取得的豐富的研究成果，明顯推動(dòng)了生物分類學(xué)的發(fā)展.事實(shí)上，DNA 條形碼與進(jìn)化分類學(xué)相輔相成，彼此促進(jìn)，共同推動(dòng)生物分類和系統(tǒng)學(xué)研究[31].

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Molecular identification of crab spiders from Xiaowutai Mountains,China with DNA barcoding

HE Jingchao,HU Lanlan,GUO Chenhui,ZHANG Feng

(College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China)

In order to explore the feasibility of DNA barcoding in the species identification of crab spiders,the COI gene of 110 thomisid samples belonged to 25 species in Xiaowutai Mountains,China,was applied; the phylogenetic trees were reconstructed by neighbor-joining (NJ) and Bayesian Inference (BI) methods,and with ABGD(automatic barcode gap discovery) software to divide the samples.The results showed that the samples belonging to the same species clustered in one monophyly and all species were successfully distinguished by the phylogenetic trees,and the groups automatically defined by ABGD perfectly matched the groups defined by morphological characters,and accorded with phylogenetic trees.We believe DNA barcoding can be used as an effective tool in the molecular identification of crab spiders.

Thomisidae; DNA barcoding; phylogenetic trees; ABGD

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.03.011

2015-09-12

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2012FY110803);河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2014201041)

何靜超(1989-)，女，河北保定人，河北大學(xué)在讀碩士研究生.E-mail:hejingchao2014@163.com

張鋒(1971-)，男，河北蔚縣人，河北大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事蛛形動(dòng)物學(xué)研究.

E-mail:zhangfeng@hbu.cn

Q959.2262

A

1000-1565(2016)03-0286-07