支氣管哮喘患者治療前后血清IL-2、IL-4及外周全血T細(xì)胞亞群水平動(dòng)態(tài)變化的研究*

張晶，賴(lài)飛，梁小亮

（福建省廈門(mén)市第二醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.輸血科，福建 廈門(mén) 361021）

新進(jìn)展研究

支氣管哮喘患者治療前后血清IL-2、IL-4及外周全血T細(xì)胞亞群水平動(dòng)態(tài)變化的研究*

張晶1，賴(lài)飛2，梁小亮1

（福建省廈門(mén)市第二醫(yī)院1.檢驗(yàn)科，2.輸血科，福建 廈門(mén) 361021）

目的通過(guò)檢測(cè)不同嚴(yán)重程度支氣管哮喘患者治療前后血清白細(xì)胞介素-2（IL-2）、IL-4及外周全血CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平變化，探討上述指標(biāo)對(duì)支氣管哮喘患者診斷、治療及病情變化的臨床意義。方法用流式細(xì)胞儀檢測(cè)支氣管哮喘患者治療前后血清IL-2、IL-4、干擾素-γ（IFN-γ）及外周全血CD4+、CD8+、CD3+T細(xì)胞亞群水平，并同時(shí)檢測(cè)正常人上述指標(biāo)的水平，將治療前后結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并分別與正常人結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果治療前后血清IL-2、IL-4、IFN-γ水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；外周全血CD4+T細(xì)胞水平治療前后，以及與正常人水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；治療前后外周全血CD8+T細(xì)胞水平與正常人水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；輕、中度哮喘患者治療前后外周全血CD3+T細(xì)胞水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而重度哮喘治療前后外周全血CD3+T細(xì)胞水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論動(dòng)態(tài)測(cè)定IL-2、IL-4及CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平是判斷支氣管哮喘病情變化的有效指標(biāo)，對(duì)哮喘的診斷、治療有一定的意義。

支氣管哮喘；白細(xì)胞介素-2；白細(xì)胞介素-4；CD4+T細(xì)胞；CD8+T細(xì)胞

支氣管哮喘（以下簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種氣道慢性炎癥性疾病，過(guò)去10年其發(fā)病率急劇增加，給全球健康，特別是西方國(guó)家[1]，帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為全世界重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一。其是由多種細(xì)胞，特別是肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥反應(yīng)，氣道高反應(yīng)性和支氣管平滑肌痙攣是該病的兩大特征[2]。有研究表明，發(fā)作期哮喘患者存在CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)量和功能的異常[3-6]，即哮喘患者細(xì)胞免疫功能紊亂與哮喘的發(fā)作有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)直接檢測(cè)CD3、CD4、CD8水平，了解T細(xì)胞亞群的變化。研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡已被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的主要機(jī)制之一[7-8]。Th1細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ)、IL-12等細(xì)胞因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。王俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，IL-4活性可作為T(mén)h2功能指標(biāo)，IL-2活性作為T(mén)h1功能指標(biāo)，可間接反映Th1/Th2變化。本課題針對(duì)性的選擇IL-4、IL-2做為細(xì)胞因子的代表，通過(guò)IL-4/IL-2反映Th1/Th2變化。在哮喘患者不同程度、不同發(fā)作頻率時(shí)，分別檢測(cè)其水平，同時(shí)與T細(xì)胞亞群聯(lián)合檢測(cè)，進(jìn)一步達(dá)到監(jiān)測(cè)病情，隨診觀(guān)察評(píng)估的目的。

1 資料與方法

1.1一般資料

1.1.1研究對(duì)象根據(jù)我國(guó)2013年修訂的支氣管哮喘防治指南標(biāo)準(zhǔn)，選擇輕、中、重度支氣管哮喘患者各30例做為哮喘組。其中，男性20例，女性10例；年齡30～60歲，平均（42.32±10.12）歲；體重（56.23± 12.78）kg，治療前后留取外周血及血清標(biāo)本。哮喘組分為：①中、輕度支氣管哮喘的入選標(biāo)準(zhǔn)為日間癥狀≤2 d/周，發(fā)作間歇無(wú)癥狀，夜間癥狀≤2次/月；②中度支氣管哮喘的入選標(biāo)準(zhǔn)為日間癥狀>2 d/周，但非每天有癥狀，夜間癥狀3～4次/月；③重度支氣管哮喘的入選標(biāo)準(zhǔn)為日間癥狀≥1次/d，夜間癥狀> 1次/周，每晚有或無(wú)癥狀。選擇健康體檢者30例作為對(duì)照組。其中，男性20例，女性10例；年齡30～60歲，平均（44.56±9.32）歲；體重（58.12±12.76）kg，均無(wú)呼吸系統(tǒng)疾病和過(guò)敏性疾病史。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀，型號(hào)為Calibur型。美國(guó)BD公司Human IL-2 Flex Set試劑盒，美國(guó)BD公司Human IL-4 Flex Set試劑盒，美國(guó)BD公司人類(lèi)白細(xì)胞分化抗原CD4/CD8/ CD3檢測(cè)試劑盒。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)本收集空腹靜脈采血2管，1管為抗凝全血2～3 ml，1管為不抗凝血2～3 ml，抗凝全血當(dāng)天上機(jī)檢測(cè)，不抗凝血離心后分離血清，置于-80℃冰箱冷凍保存。同一患者在治療前和病情進(jìn)入緩解期后各采血1次，對(duì)照組在檢測(cè)前2～3d集中采血。

1.2.2IL-2、IL-4及CD3+CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群水平測(cè)定采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自由美國(guó)BD公司，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1支氣管哮喘患者治療前后血清IL-2、IL-4及IFN-γ水平

輕、中、重度哮喘患者治療前后3個(gè)指標(biāo)整體比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，血清IL-2各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.456，P=0.000）；血清IL-4各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=22.765，P=0.000）；血清IFN-γ各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 16.413，P=0.000）。各組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，輕度哮喘患者血清IL-2治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-9.445，P=0.001）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-12.484，P=0.001）。輕度哮喘患者血清IL-4治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=23.174，P=0.000）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-50.878，P=0.000）。輕度哮喘患者血清IFN-γ治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.754，P=0.001）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.456，P=0.001）。中度哮喘患者血清IL-2治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-14.590，P= 0.001）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-19.595，P=0.000）。中度哮喘患者血清IL-4治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=32.233，P=0.000）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-71.445，P=0.000）。中度哮喘患者血清IFN-γ治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.742，P=0.000）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.532，P=0.001）。重度哮喘患者血清IL-2治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-20.438，P=0.000）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-26.925，P=0.000）。重度哮喘患者血清IL-4治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=29.644，P=0.000）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-70.794，P=0.000）。重度哮喘患者血清IFN-γ治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.431，P=0.001）；治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 1.321，P=0.000）。見(jiàn)表1和圖1。

表1　各組治療前后IL-2、IL-4及IFN-γ水平比較（n=30，pm/ml±s）

表1　各組治療前后IL-2、IL-4及IFN-γ水平比較（n=30，pm/ml±s）

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圖1　血清IL-2、IL-4流式分析圖

表2　各組治療前后T細(xì)胞亞群水平比較（n=30，%s）

表2　各組治療前后T細(xì)胞亞群水平比較（n=30，%s）

組別CD3CD4CD8CD4/CD8輕度哮喘組治療前63.10±3.6340.06±3.8124.44±2.921.67±0.32治療后61.00±3.8937.76±3.7624.07±2.971.60±0.31中度哮喘組治療前63.48±3.0540.79±3.1924.78±2.961.68±0.31治療后61.85±3.1338.92±3.4424.04±2.811.65±0.33重度哮喘組治療前65.07±3.3442.15±2.8125.09±2.911.71±0.29治療后62.33±3.1139.13±2.4224.06±2.771.65±0.26對(duì)照組62.58±4.7936.36±2.1124.10±2.491.52±0.17

2.2支氣管哮喘患者治療前后血清T細(xì)胞亞群水平

輕、中、重度哮喘治療前后3個(gè)指標(biāo)整體比較，經(jīng)重復(fù)測(cè)量方差分析，外周全血CD3+T細(xì)胞各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.304，P=0.000）；外周全血CD4+T各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 22.432，P=0.000）；外周全血CD8+T各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.542，P=0.082）；CD4+/CD8+比值在各組哮喘患者組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 17.675，P=0.000）。各組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，CD3+T細(xì)胞在輕、中度支氣管哮喘患者治療前后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=-0.469，P=0.641；中度：t=-0.869，P=0.388），而在重度哮喘治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.334，P=0.023）；各組哮喘患者治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=2.151，P=0.036；中度：t=2.050，P=0.045；重度：t= 3.292，P=0.002）。CD4+T細(xì)胞在輕、中、重度支氣管哮喘患者治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t= -4.661，P=0.000；中度：t=-6.37，P=0.000；重度：t= -9.038，P=0.000）；各組哮喘患者治療后與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=2.358，P=0.022；中度：t=2.203，P=0.032；重度：t=4.474，P=0.000）。CD8+T細(xì)胞在輕、中、重度支氣管哮喘患者治療前后比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=-0.497，P=0.621；中度：t=-0.973，P=0.335；重度：t=-1，419，P=0.161）；各組哮喘患者治療后與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=0.489，P=0.627；中度：t=0.990，P=0.326；重度：t=1.404，P=0.166）。CD4+/CD8+比值在各組哮喘患者治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t= -2.234，P=0.029；中度：t=-2.410，P=0.019；重度：t= -3.080，P=0.003）；各組哮喘患者治療后與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（輕度：t=0.853，P=0.397；中度：t=0.328，P=0.774；重度：t=0.820，P=0.416）。見(jiàn)表2和圖2。

圖2　外周全血CD3+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞流式分析圖

3 討論

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[10-11]，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，尚未完全清楚，可概括為免疫-炎癥反應(yīng)、神經(jīng)機(jī)制、氣道高反應(yīng)及相互作用[12]。吳健等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞功能的異?；蚴Ш馐且疬^(guò)敏性疾病如支氣管哮喘等多種免疫性疾病的根源。HEATON等[14]2005年研究發(fā)現(xiàn)，哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的主要機(jī)制之一。T淋巴細(xì)胞是人體內(nèi)免疫功能最重要的一大細(xì)胞群，在T淋巴細(xì)胞分類(lèi)中，CD3+代表總T淋巴細(xì)胞，CD4+代表T輔助細(xì)胞，而CD8+代表T抑制細(xì)胞和T殺傷細(xì)胞[15]。CD4+T細(xì)胞的主要功能是增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答過(guò)程，其功能受損會(huì)影響B(tài)淋巴細(xì)胞活化，從而使免疫球蛋白G、免疫球蛋白A等抗體產(chǎn)生減少，抗感染能力將受到很大影響[16]。CD8+T細(xì)胞功能低下，機(jī)體可能會(huì)發(fā)生過(guò)強(qiáng)的免疫應(yīng)答[17-20]，使嗜酸性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)多免疫球蛋白E，導(dǎo)致某些免疫性疾病，如自身免疫性疾病和超敏反應(yīng)等。本研究表明。在輕、中、重度哮喘患者外周全血中，CD4+T細(xì)胞水平升高，治療前后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而CD3+T細(xì)胞只在重度哮喘患者治療前后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CD8+T細(xì)胞治療前后變化比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CD4+T細(xì)胞對(duì)于研究哮喘患者病情、治療等方面可以起到一定的作用。

目前認(rèn)為肥大細(xì)胞為哮喘發(fā)生的始動(dòng)效應(yīng)細(xì)胞，而激活細(xì)胞啟動(dòng)哮喘發(fā)病機(jī)制的主要細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞，其所釋放的細(xì)胞因子，在哮喘炎癥機(jī)制中發(fā)揮重要作用。其中IL-2主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化作用。IL-2生物學(xué)功能必須通過(guò)細(xì)胞膜上的IL-2R介導(dǎo)，才能發(fā)揮作用。IL-2在哮喘方面的研究報(bào)道較多。LAI等[21]報(bào)道，發(fā)作期哮喘患者外周血可溶性白細(xì)胞介素-2受體明顯高于對(duì)照組，病情緩解后受體有所下降。本研究證實(shí)，治療前輕、中、重度哮喘患者的血清IL-2水平降低，并且與治療后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

IL-4和IFN-γ是Th1、Th2產(chǎn)生重要免疫效應(yīng)的細(xì)胞因子，在一定程度上反映Th1、Th2細(xì)胞亞群的功能狀態(tài)[22]。IL-4是CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h2的關(guān)鍵細(xì)胞因子[23]，能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為T(mén)h2細(xì)胞。采用敲除IL-4基因的小鼠，T細(xì)胞及其亞群發(fā)育雖然正常，但不能誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，故IL-4被認(rèn)為是Th2轉(zhuǎn)化的必需因子，而IFN-γ可促使Th0細(xì)胞向Th1方向分化，并抑制Th2克隆分化，能夠顯著提高巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力，并抑制IL-4mRNA的表達(dá)，同時(shí)還抑制IL-4介導(dǎo)的B細(xì)胞表達(dá)Fc受體和分泌sFc受體，從而抑制IL-4誘導(dǎo)的免疫球蛋白E的合成過(guò)程，發(fā)揮抗炎作用[24]。本研究表明，哮喘患者血清中IL-4水平較對(duì)照組增高，而哮喘患者血清中IFN-γ水平低于對(duì)照組，提示哮喘患者血清中以IL-4增高為特征的Th2功能亢進(jìn)和以IFN-γ水平降低為標(biāo)志的Th1功能降低，同時(shí)由于IFN-γ水平降低，導(dǎo)致Th0向Th1方向分化受阻，從而加劇Th2功能亢進(jìn)狀態(tài)[25]。

血清IL-2、IL-4及外周血CD4+T細(xì)胞水平可能是哮喘發(fā)病的重要因素，聯(lián)合檢測(cè)血清IL-2、IL-4及外周血CD4+T細(xì)胞水平有助于支氣管哮喘患者診斷、判斷病情變化等。本研究立足于臨床實(shí)際，針對(duì)支氣管哮喘患者的檢測(cè)、診斷及治療現(xiàn)狀，尋求一種更加有效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的輔助診療方案。

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（童穎丹編輯）

Dynamical changes of serum IL-2，IL-4 and T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with bronchial asthma before and after treatment*

Jing Zhang1，F(xiàn)ei Lai2，Xiao-liang Liang1
（1.Clinical Laboratory；2.Blood Transfusion Room，the Second Hospital of Xiamen，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021，China）

Objective To investigate the changes of IL-2，IL-4 and T lymphocyte subsets levels in peripheral blood of patients with different severity of bronchial asthma and their clinical significance for the diagnosis，therapy and changes in patients＇conditions.Methods In this study 30 healthy adults and 90 bronchial asthma patients were selected.Peripheral blood mononuclear cells were stained with monoclonal antibodies（anti-CD45，anti-CD4，anti-CD8 and anti-CD3）and evaluated using flow cytometry.T lymphocyte subsets were identified as CD3+CD4+and CD3+CD8+T cells.The serum levels of IL-2，IL-4 and IFN-γ were tested with BD Cytometric Bead Array（CBA）human soluble protein master buffer kit and evaluated using flow cytometry.The data were compared between the asthma patients and the healthy controls before treatment and after treatment.Results There were significant differences in IL-2，IL-4 and IFN-γ levels before and after treatment（P＜0.01）.There were significant differences in CD4+T cell subsets before and after treatment and between the controls and the bronchial asthma patients（P＜0.05）.There were no significant differences in CD8+T cell subsets before and after treatment or between the controls and the bronchial asthmapatients（P＞0.05）.There were no significant differences in CD3+T cell subsets in the moderate or mild bronchial asthma patients before and after treatment（P＞0.05），but there were significant differences in the severe bronchial asthma patients before and after treatment（P＜0.05）.Conclusions Dynamical detection of IL-2，IL-4，and CD4+and CD8+T lymphocyte subsets is beneficial to estimation of the changes in disease condition of bronchial asthma patients and has clinical significance in diagnosis and treatment for bronchial asthma.

bronchial asthma；interleukin-2；interleukin-4；CD4+T lymphocyte；CD8+T lymphocyte

R 562.25

B

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.014

1005-8982（2016）19-0069-06

2015-11-10

福建省衛(wèi)計(jì)委青年課題基金（No：2012-2-90）

梁小亮，E-mail：xmeylxl@sina.com；Tel：13606906648