攜帶NDV HN基因疫苗的重組減毒雞白痢沙門菌口服免疫原性研究

丁　軻，余祖華，李　蒙，郁　川，尚　珂，程相朝，陳桂華，廖成水，賈艷艷，汪　洋，張春杰

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003)

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攜帶NDVHN基因疫苗的重組減毒雞白痢沙門菌口服免疫原性研究

丁軻，余祖華，李蒙，郁川，尚珂，程相朝*，陳桂華，廖成水，賈艷艷，汪洋，張春杰

(河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，洛陽 471003)

為研究攜帶新城疫病毒(NDV)血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因疫苗的重組減毒雞白痢沙門菌的口服免疫原性，將攜帶NDVHN基因的重組質(zhì)粒pcDNA3-HN電轉(zhuǎn)化減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13，構(gòu)建重組疫苗菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)。將重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)以1×109CFU·只-1口服免疫7日齡雛雞，同時(shí)設(shè)PBS、ΔcrpC79-13 (pcDNA3) 和NDV Ⅳ系疫苗免疫對(duì)照，于免疫后7、14、21、28、35 d 測(cè)定免疫雛雞誘導(dǎo)的抗NDV 的HI抗體、雞白痢沙門菌IgG抗體和腸道黏膜IgA抗體動(dòng)態(tài)水平，同時(shí)測(cè)定免疫雛雞的外周血淋巴細(xì)胞增殖水平并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。結(jié)果表明，成功獲得攜帶NDVHN基因疫苗的重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)；在免疫后14～35 d，可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗NDV的HI抗體，且在免疫后21 d時(shí)達(dá)到最高值；可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗雞白痢沙門菌的IgG抗體，且在免疫后28 d 達(dá)到最高值；Δcrp(C79-13 pcDNA3-HN)組腸道黏膜IgA抗體含量最高值略高于Δcrp C79-13 (pcDNA3)組，但差異不顯著(P>0.05)。在免疫28 d 以后，Δcrp(C79-13 pcDNA3-HN)組外周血淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，顯著高于ΔcrpC79-13(pCDNA3)組(P<0.05)。用103EID50NDV F48E9株攻毒，保護(hù)率達(dá)67%(10/15)，用108CFU雞白痢沙門菌C79-13攻毒，保護(hù)率為100%。本研究結(jié)果表明重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)具有良好的口服免疫原性。

新城疫病毒；HN基因；減毒沙門菌；口服免疫；免疫原性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害全球養(yǎng)禽業(yè)[1]。NDV又稱禽副黏病毒-1(avain paramyxo-virus，PMV-1)，為單股負(fù)鏈不分節(jié)有囊膜的RNA病毒，其基因組全長(zhǎng)1.5 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白(L、HN、F、 NP、P)，其中血凝素-神經(jīng)氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase，HN)位于囊膜外表面，具有血凝素及神經(jīng)氨酸酶的活性[2]。HN蛋白是NDV重要的宿主保護(hù)性抗原，具有良好的免疫原性，可在NDV侵染的過程中起到識(shí)別細(xì)胞受體、介導(dǎo)病毒吸附細(xì)胞膜的作用[3-4]。因此，HN基因可作為NDV基因工程疫苗的重要抗原靶基因之一。目前，我國(guó)用于ND防制的疫苗主要有弱毒苗和滅活苗，但近年來常有弱毒疫苗和滅活疫苗免疫失敗的報(bào)道。因此，研究新型疫苗來控制NDV是亟待解決的問題之一。

沙門菌是一種較為常見的侵襲性胞內(nèi)菌，通過基因工程方法減毒后對(duì)宿主致病性顯著降低，但仍保留良好的侵襲力，并且減毒沙門菌還可作為載體直接將真核表達(dá)質(zhì)粒攜帶進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的蛋白而誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)[5-6]。以減毒沙門菌為載體的DNA疫苗具有諸多優(yōu)點(diǎn)[7-8]。首先，它不僅可以通過口服、鼻內(nèi)感染途徑進(jìn)行免疫，既省時(shí)又方便，而且可以將抗原直接運(yùn)載至內(nèi)臟淋巴組織，產(chǎn)生有效的黏膜免疫。其次，以沙門菌為載體能夠?qū)①|(zhì)粒DNA運(yùn)載至相關(guān)免疫器官的APC細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞對(duì)沙門菌有特殊的親和性，能更有效的將抗原遞呈給樹突細(xì)胞，比DNA疫苗的傳統(tǒng)免疫途徑的遞呈更有效。最后，質(zhì)粒表達(dá)的抗原與減毒沙門菌本身的抗原也起到了聯(lián)合免疫的作用。因此，減毒沙門菌為載體攜帶外源DNA疫苗的策略為研究新型NDV疫苗提供了可能。近年來，關(guān)于ND基因工程疫苗的研究取得長(zhǎng)足的進(jìn)步。X.Yang等[9]以傳染性支氣管炎病毒為載體構(gòu)建了能夠表達(dá)HN的重組病毒R-H120-HN/5a，用該重組病毒免疫SPF雛雞，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高的NDV HI抗體水平，用NDV F48E9強(qiáng)毒株攻毒后的免疫保護(hù)率可達(dá)80%。王善輝等[10]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了HN-Bacmid重組病毒，用該病毒免疫SPF 雞，可誘導(dǎo)產(chǎn)生了高滴度的NDV 特異性抗體，強(qiáng)毒攻擊后免疫保護(hù)率可達(dá)75%。目前已有利用減毒沙門菌攜帶NDV DNA疫苗的報(bào)道[11-12]，但以減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13為載體攜帶NDV DNA疫苗的研究還鮮有報(bào)道。因此，本研究在構(gòu)建攜帶NDVHN基因疫苗的減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)基礎(chǔ)上，對(duì)其口服免疫原性作了進(jìn)一步研究，從而為研制新型雞白痢—新城疫口服活載體疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、質(zhì)粒、疫苗和毒株大腸桿菌JM109、減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13、pMD18-HN、真核表達(dá)載體pCDNA3，均由河南科技大學(xué)動(dòng)物疫病與公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；NDV Ⅳ系疫苗購自遼寧益康生物股份有限公司；S.pullorum標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株C79-13、NDV F48E9株均購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)督所。

1.1.2主要試劑TaqDNA聚合酶、T4DNA 連接酶、BamHⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；新生牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基、青鏈霉素購自Gibco (Life TechnoLogies) 公司；雞外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津?yàn)笕A科生物技術(shù)有限公司；雞sIgA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購自武漢Elabscience生物科技有限公司；刀豆球蛋白A(Con A)、MTT、PMSF、DMSO購自Sigma公司；NDV 陽性血清購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TMB顯色液購自碧云天生物技術(shù)公司。1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物1日齡健康雛雞購自洛陽公華禽業(yè)有限公司，按常規(guī)方法檢測(cè)沙門菌抗體陰性。

1.2方法

1.2.1重組減毒雞白痢沙門菌ΔrpC79-13(pCDNA3-HN)的基因疫苗的制備用設(shè)計(jì)的引物Pa1：5′-CCCAAGCTTACCATGGACCGCGCCGTTAGC-3′(下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))，Pa2：5′-CGGGATCCCTAGCCAGACCTGGCTTC-3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))，以pMD18-HN為模板，PCR擴(kuò)增出HN基因片段。將擴(kuò)增的HN產(chǎn)物通過BamHⅠ、HindⅢ酶切后定向插入真核表達(dá)載體pCDNA3中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA3-HN。通過電轉(zhuǎn)化的方法將重組質(zhì)粒pCDNA3-HN和pCDNA3分別轉(zhuǎn)入減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13中，挑取在LB固體培養(yǎng)基(100 μg·mL-1，Amp+)的上生長(zhǎng)的陽性單菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)和ΔcrpC79-13(pCDNA3)。然后將重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)和ΔcrpC79-13(pCDNA3)分別接種LB 液體培養(yǎng)基(100 μg·mL-1，Amp+)，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，用PBS 洗滌 3次后重懸菌液，并將菌液濃度調(diào)整為1×109CFU·mL-1。

1.2.2雛雞的分組與免疫隨機(jī)選取6只雛雞進(jìn)行血清母源抗體檢測(cè)，待母源抗體下降到4 log2以下后，挑選體重均勻的雛雞240只，隨機(jī)分為4組，每組60只。按表1免疫方式和劑量進(jìn)行免疫。

表1雛雞免疫試驗(yàn)分組

Table 1The grouping of chicken

分組Groups免疫方式Immunemethods免疫劑量Immunizingdose免疫次數(shù)Immunitytimes數(shù)量NumberPBS口服200μL160ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)口服1×109CFU160ΔcrpC79-13(pCDNA3)口服1×109CFU160Ⅳ系口服2頭份160

1.2.3NDV HI 抗體水平檢測(cè)分別于免疫后7、14、21、28、35從各組隨機(jī)取6只雛雞，采血，分離血清，測(cè)定各組雛雞NDV HI抗體水平。

1.2.4雞白痢沙門菌 IgG抗體的檢測(cè)挑取雞白痢沙門菌C79-13單菌落，活化過夜，以1∶100比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)8 h，收集菌體并用PBS洗滌2次，以1∶100倍濃縮重懸于PBS，置于冰上超聲破碎至菌液澄清，離心后收集上清，并將濃度調(diào)整至10 μg·mL-1包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，每孔100 μL，置于4 ℃過夜。棄去包被液，PBS洗滌3次，每孔加入0.5%的脫脂奶粉100 μL，37 ℃封閉2 h；PBS洗滌3次，將待檢血清按1：200比例稀釋后100 μL·孔-1，37 ℃孵育2 h，PBS洗滌3次；每孔加入HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG(稀釋倍數(shù)為1∶3 000)100 μL，37 ℃孵育2 h；經(jīng)洗滌后每孔加入50 μL TMB底物顯色液，避光反應(yīng)10 min。每孔加入50 μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)量其OD492 nm值。1.2.5免疫雛雞腸道sIgA抗體水平的測(cè)定分別于免疫后7、14、21、28、35 d從各組隨機(jī)挑選6只雛雞，撲殺雞，采集小腸，用含100 μg·mL-1PMSF 的PBS緩沖液灌洗小腸。離心收集小腸液并制備免疫雛雞及對(duì)照的小腸樣本，采用雞sIgA ELISA 檢測(cè)試劑盒測(cè)定免疫雛雞腸道sIgA 抗體水平。1.2.6免疫雛雞淋巴細(xì)胞增殖檢測(cè)分別于免疫后7、14、21、28、35 d從每組隨機(jī)抽取6只雛雞，無菌心臟采血，分離淋巴細(xì)胞，將分離的淋巴細(xì)胞懸浮于RPMI 1640培養(yǎng)基中并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)·mL-1。將淋巴細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL·孔-1)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)孔，每孔加100 μL 含有ConA(5 μg·mL-1)的RPMI-1640營(yíng)養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加100 μL完全RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃ 5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h；最后加入10 μL MTT(終質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，37 ℃培養(yǎng)4 h，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清，并每孔加入100 μL DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀測(cè)定OD492 nm值。以免疫組的OD值/對(duì)照組的OD值表示各組的刺激指數(shù)(SI)。

1.2.7免疫雛雞的攻毒保護(hù)試驗(yàn)在免疫21 d后，每組選擇30只雞，其中15只雞用NDV F48E9株進(jìn)行滴鼻攻毒，攻毒劑量103EID50，另外15只雞用S.pullorum菌野生株C79-13口服攻毒，攻毒劑量為108CFU·mL-1(100倍LD50)。各組雞攻毒后連續(xù)觀察20 d，記錄雞的精神狀態(tài)、發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計(jì)免疫保護(hù)率。

1.2.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析one-way ANOVA進(jìn)行差異性比較，并用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，用 * 表示，P<0.01表示差異極顯著，用 ** 表示。

2　結(jié)　果

2.1重組菌株ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)的鑒定

將構(gòu)建成功的陽性重組質(zhì)粒pCDNA3-HN電轉(zhuǎn)化至減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13后，挑取含Amp 的LB固體培養(yǎng)基上的單菌落，用引物Pa1/Pa2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一條大小約1.7 kb的條帶(圖1)。陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行酶切后獲得兩條大小不同的片段，大小分別為5.4 kb和1.7 kb左右(圖2)。PCR和酶切結(jié)果表明，重組減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)構(gòu)建成功。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)；1.對(duì)照；2、3.重組菌ΔcrpC79-13 (pCDNA3-HN)HN基因PCR產(chǎn)物M.DNA Marker (DL5000);1.Control；2-3.PCR products of HN gene in ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN)圖1　重組減毒菌的PCR鑒定Fig.1　Identification of recombinant attenuated strain

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)；1.BamH Ⅰ+HindⅢ 酶切ΔcrpC79-13 (pCDNA3-HN);2.BamH Ⅰ+HindⅢ酶切ΔcrpC79-13(pCDNA3)M.DNA Marker (DL5000);1.Restriction fragments of ΔcrpC79-13(pCDNA3-HN) with BamH Ⅰ+HindⅢ;2. Restriction fragments of pCDNA3 with BamH Ⅰ+Hind Ⅲ圖2　重組減毒菌的酶切鑒定Fig.2　Identification of enzyme for recombinant attenuated strain

2.2重組菌株對(duì)雛雞NDV HI抗體水平的影響

ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)重組菌株免疫雛雞后，在一定時(shí)期內(nèi)可以有效刺激機(jī)體NDV HI抗體水平的增長(zhǎng)，且在免疫后21 d時(shí)抗體水平達(dá)到最高值，之后兩周開始緩慢降低。21～35 d，ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)重組菌免疫組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組顯著高于ΔcrpC79-13(pcDNA3)免疫組與PBS對(duì)照組(P<0.05)，而ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)重組菌免疫組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組之間差異不顯著(P>0.05)，ΔcrpC79-13(pcDNA3)免疫組和PBS對(duì)照之間差異也不顯著(P>0.05)(圖3)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖3　NDV HI抗體檢測(cè)Fig.3　Assay of HI antibody of NDV

2.3重組菌株對(duì)雛雞體內(nèi)沙門菌血清IgG抗體水平的影響

以S.PullorumC79-13菌體蛋白作為抗原，運(yùn)用間接ELISA方法檢測(cè)各組雛雞血清IgG抗體水平。ELISA結(jié)果表明，14～35 d重組菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)免疫組和ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組的血清IgG抗體極顯著高于PBS對(duì)照組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組(P<0.01)。免疫雛雞的血清IgG抗體含量在7～28 d之間呈上升趨勢(shì)，且在28 d時(shí)達(dá)到最高水平，在第28天之后又呈下降趨勢(shì)(圖4)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖4　沙門菌 IgG抗體檢測(cè)Fig.4　Assay of IgG antibody to Salmonella

2.4重組菌株對(duì)雛雞腸道sIgA抗體水平的影響

運(yùn)用ELISA方法檢測(cè)各組雛雞腸道sIgA抗體水平，結(jié)果顯示ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組、ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組腸道sIgA抗體含量均高于PBS對(duì)照組，且在28 d時(shí)達(dá)到最高水平。免疫后14 d時(shí)ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組腸道sIgA抗體含量顯著高于ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組和PBS對(duì)照組(P<0.05)，NDV Ⅳ系疫苗免疫組腸道sIgA抗體含量略高于ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組，但差異不顯著(P>0.05)；免疫后21～35 d，ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組、ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組均極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，但ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組與NDV Ⅳ系疫苗免疫組及ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組之間差異不顯著(P>0.05) (圖5)。

*.P<0.05；**.P<0.01圖5　腸道sIgA 抗體檢測(cè)Fig.5　Assay of secretion IgA antibodiy in intestinal

2.5重組菌株對(duì)雛雞淋巴細(xì)胞增殖的影響

用MTT法檢測(cè)各組雛雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖水平，計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。結(jié)果顯示，重組菌株ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)免疫組的SI在免疫后28 d達(dá)到最大值，為1.725左右，重組菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組的SI為1.371左右，NDV Ⅳ系疫苗免疫組的SI為1.579左右。方差的單因子變量分析顯示，免疫后21 d時(shí)，重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)和NDV Ⅳ系疫苗免疫組顯著高于PBS對(duì)照組和ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組(P<0.05)，而ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組與PBS組之間差異不顯著；免疫28 d時(shí)重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)和NDV Ⅳ系疫苗免疫組均極顯著高于PBS對(duì)照組(P<0.01)，顯著高于ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組(P<0.05)(圖6)。

2.6重組菌株對(duì)雛雞的免疫保護(hù)效力檢測(cè)

免疫后21 d，以口服的方式進(jìn)行攻毒雞白痢沙門菌 C79-13，以滴鼻、點(diǎn)眼的方式進(jìn)行攻毒NDV F48E8株，攻毒后連續(xù)觀察20 d，評(píng)價(jià)重組菌免疫雛雞對(duì)C79-13的免疫保護(hù)作用(表2)。免疫雛雞對(duì)雞白痢沙門菌保護(hù)效力結(jié)果顯示，重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)和ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組能100%抵抗野生株的感染，而PBS對(duì)照組和NDV Ⅳ系疫苗免疫組的免疫保護(hù)率為0；免疫雛雞對(duì)NDV保護(hù)效力結(jié)果顯示，NDV F48E9攻毒后，PBS組死亡率高達(dá)80%，重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3) 死亡率為77%，而重組菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)死亡率為33%，保護(hù)率為67%，NDV Ⅳ系疫苗免疫組的存活率為73%，表明該重組菌株對(duì)NDV感染具有一定的免疫保護(hù)，但其免疫保護(hù)效果略低于NDV Ⅳ系疫苗。

表2重組菌免疫雛雞抵抗沙門菌C79-13和NDV F48E8攻毒的保護(hù)力

Table 2The immune protective efficiency of recombinant strain toSalmonellapullorumC79-13 and NDV F48E9in chickens

組別GroupsC79-13F48E9死亡數(shù)/總數(shù)Death/Total存活率/%Survivalrate死亡數(shù)/總數(shù)Death/Total存活率/%SurvivalratePBS15/15012/1520ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)0/151005/1567ΔcrpC79-13(pcDNA3)0/1510010/1523Ⅳ系15/151004/1573

*.P<0.05；**.P<0.01圖6　雛雞免疫后各時(shí)間點(diǎn)的淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)Fig.6　Stimulation index of lymphocytes in various time points after immunization

3　討　論

減毒沙門菌作為載體可以通過自然感染途徑侵入宿主的派伊爾氏結(jié)、腸淋巴結(jié)、肝、脾等組織細(xì)胞，將攜帶的DNA疫苗運(yùn)送至免疫誘導(dǎo)部位，乃至于特定的免疫細(xì)胞(如APCs等)，借助于宿主細(xì)胞表達(dá)目的抗原，不僅激發(fā)出宿主針對(duì)沙門菌本身的免疫反應(yīng)，而且激發(fā)出針對(duì)其所攜帶抗原的各種免疫反應(yīng)，包括全身體液免疫、細(xì)胞免疫和局部黏膜反應(yīng)[13-14]。

甘軍紀(jì)等[15]用表達(dá)雞NDVHN基因的重組雞痘病毒活載體疫苗rFPV-12LS HN免疫14日齡的SPF雞群，7 d后即可檢測(cè)到雞NDV HI抗體，rFPV-12LS HN 免疫后僅2～3周NDV HI抗體平均滴度>4log2，免疫后10～18周，HI抗體平均滴度均<2log2，但依然能完全保護(hù)試驗(yàn)雞抵抗NDV強(qiáng)毒的致死性攻擊。孫景秀等[16]構(gòu)建的重組干酪乳桿菌(pLA-HN/L.casei)免疫雛雞，將重組菌表達(dá)的產(chǎn)物HN蛋白作為抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，前1周其IgG 抗體水平呈平穩(wěn)上升，二免、三免后試驗(yàn)組抗體水平迅速上升，而對(duì)照組沒有變化。以上研究表明NDVHN基因可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生HI抗體，且HI抗體具有較好的保護(hù)效力。本研究構(gòu)建的重組減毒沙門菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)免疫后一定時(shí)期內(nèi)，雛雞體內(nèi)NDV HI抗體水平持續(xù)增長(zhǎng)，且在免疫后21 d時(shí)抗體水平達(dá)到最高值，表明減毒沙門菌ΔcrpC79-13攜帶的HN基因疫苗能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生NDV的HI抗體產(chǎn)生，對(duì)雛雞的新城疫有一定的免疫效果。程相朝等[17]將構(gòu)建的減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13口服免疫4日齡雛雞，結(jié)果顯示ΔcrpC79-13不影響雛雞生長(zhǎng)，且在第14～21天體內(nèi)特異性細(xì)胞和體液免疫水平達(dá)到最高。本研究中，在免疫后7 d 即可檢測(cè)到雞白痢沙門菌的IgG抗體，且在免疫后28 d時(shí)達(dá)到最高水平，表明重組減毒沙門菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)在作為減毒活載體的同時(shí)還能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生一定水平的抗沙門菌IgG，保持了親本株良好的體液免疫原性。

禽類黏膜免疫是機(jī)體內(nèi)抵御外界病原感染的首道免疫屏障，對(duì)維護(hù)機(jī)體健康有著至關(guān)重要的作用。黏膜免疫的主要效應(yīng)因子為slgA，它能夠阻止病原菌黏附子在黏膜表面，可以激活機(jī)體免疫機(jī)制，清除病原，在保護(hù)自身機(jī)體和抗感染等方面發(fā)揮重要作用[18]。在ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組的雞只體內(nèi)檢測(cè)到了腸黏液分泌型IgA，且21 d后ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組和ΔcrpC79-13 (pcDNA3)免疫組均極顯著高于PBS對(duì)照組，表明ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)可定植腸道的相關(guān)淋巴結(jié)，并引起有效的黏膜免疫反應(yīng)。血液中T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化水平可反映機(jī)體細(xì)胞免疫的狀態(tài)。孫景秀等[16]構(gòu)建的重組干酪乳桿菌pLA-HN/L.casei免疫雞淋巴細(xì)胞增殖刺激指數(shù)顯著高于pLA/L.casei免疫組，表明含HN的重組干酪乳桿菌可誘生細(xì)胞免疫應(yīng)答。在本研究中，重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫組與PBS免疫組SI差異顯著(P<0.05)，表明淋巴細(xì)胞在重組菌的刺激下，發(fā)生了分裂增殖，證實(shí)攜帶的HN基因疫苗的重組菌株ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。

本研究的攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，重組菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫雛雞用103EID50NDV F48E9強(qiáng)毒株攻擊后，雛雞的存活率可達(dá)67%，略低于NDV Ⅳ系疫苗。X.Yang等[9]用重組菌R-H120-HN/5a免疫SPF雛雞后，用NDV F48E9強(qiáng)毒株攻毒后的免疫保護(hù)率可達(dá)80%。沙萬里等[19]構(gòu)建pVAXⅠ-HN、pVAXⅠ-F-HN 兩種DNA疫苗肌肉注射2周齡雛雞，免疫14 d后用105EID50的NDV LaSota株滴鼻攻毒免疫保護(hù)率分別為46.7%和93.3%。重組菌ΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)免疫雛雞用雞白痢沙門菌強(qiáng)毒株C79-13攻毒后，仍全部存活，表明攜帶新城疫病毒HN基因疫苗的減毒雞白痢沙門菌ΔcrpC79-13(pcDNA3-HN)不僅能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)新城疫病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答，還能100%抵抗雞白痢沙門菌C79-13的感染，但對(duì)雛雞的免疫保護(hù)效果略低于NDV Ⅳ系疫苗。S.Kumar等[20]研究表明雛雞單獨(dú)免疫表達(dá)HN蛋白的禽3型副黏病毒對(duì)NDV強(qiáng)毒的攻擊可產(chǎn)生部分抵抗力，但同時(shí)免疫表達(dá)HN蛋白和F蛋白的禽3型副黏病毒對(duì)NDV強(qiáng)毒的攻擊可提供完全保護(hù)，表明同時(shí)免疫表達(dá)NDV F蛋白和HN 蛋白的基因工程疫苗具有更好的免疫效果，構(gòu)建能夠同時(shí)表達(dá)HN蛋白和F蛋白的重組減毒雞白痢沙門菌是否可誘導(dǎo)產(chǎn)生更高的免疫保護(hù)率還需進(jìn)一步研究探索。

綜上所述，本試驗(yàn)構(gòu)建的攜帶NDVHN基因疫苗的重組減毒S.pullorumC79-13Δcrp(pcDNA3-HN)不僅能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生雞白痢沙門菌特異性應(yīng)答反應(yīng)，而且可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)NDV的免疫應(yīng)答反應(yīng)，具有良好的口服免疫效應(yīng)，為進(jìn)一步將其開發(fā)為雞白痢-新城疫二聯(lián)活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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(編輯白永平)

Oral Immunogenicity of an AttenuatedSalmonellapullorumHarbouringHNGene Vaccine of Newcastle Disease Virus

DING Ke，YU Zu-hua，LI Meng，YU Chuan，SHANG Ke，CHENG Xiang-chao*，CHEN Gui-hua，LIAO Cheng-shui, JIA Yan-yan, WANG Yang, ZHANG Chun-jie

(KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandPublicHealth，HenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

To study the oral immunogenicity of attenuatedSalmonellapullorum，carriedHN(haemagglutinin-neuraminidase) gene vaccine of Newcastle disease virus (NDV).In this study，the recombinant plasmid pcDNA3-HN was finally electro-transformed into attenuatedSalmonellapullorumΔcrpC79-13 to construct the recombinant strainΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN).Then the 7-day-old chickens were oral inoculated with 1×109CFU recombinant strainΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN)，and theΔcrpC79-13 (pcDNA3)，PBS，NDV Ⅳvaccine were act as the control group.Then the dynamic level of HI antibody and intestinal mucosal IgA antibody against NDV were determined at 7，14，21，28，35 days post vaccination.At the same time，the level of peripheral blood lymphocyte proliferation of immune chicken and the challenge protection efficiency were determined.The results showed that the recombinant vaccine strainsΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN) carrying NDVHNgene vaccine was constructed successfully，which could induce HI antibody against NDV at 14-35 d after immunization and reach the highest value at 21 d after immunization.The content of intestinal mucosal IgA antibody inΔcrp(C79-13 pcDNA3-HN) group was slightly higher than that inΔcrpC79-13 (pcDNA3) group，but the difference was not significant (P> 0.05).The peripheral blood lymphocyte stimulation index ofΔcrp(C79-13 pcDNA3-HN) group was significantly higher than that of the PBS control group (P<0.01)，and was slightly higher than that of theΔcrpC79-13 (pCDNA3) group (P<0.05) at 28 d after immunization.The immunity protection rate against strong virus was 67%(10/15) in experiment group with 103EID50 NDV F48E9，the protection rate was 100% which challenged with 108CFUSalmonellapullorumC79-13 strain.The results showed that the recombinant attenuatedSalmonellapullorumΔcrpC79-13 (pcDNA3-HN) strains have good oral immunogenicity.

NDV；HNgene；attenuatedSalmonellabacteria；oral immunization；immunogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.10.017

2016-03-22

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(152102110078)

丁軻(1977-)，男，河南永城人，副教授，博士，主要從事動(dòng)物傳染病與動(dòng)物微生態(tài)學(xué)研究，Tel:0379-64895698，E-mail: keding19@163.com

程相朝，E-mail: chengxch@126.com

S852.52

A

0366-6964(2016)10-2081-08