基于磁性免疫傳感器的牛乳中四環(huán)素殘留檢測方法的構(gòu)建

康懷彬，馬紅燕，李　芳，徐寶成，羅登林，張瑞華，鄒良亮

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003）

基于磁性免疫傳感器的牛乳中四環(huán)素殘留檢測方法的構(gòu)建

康懷彬1,2，馬紅燕1，李芳1，徐寶成1,2，羅登林1,2，張瑞華1，鄒良亮1

（1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003）

建立一種高靈敏磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法，可用于生鮮乳中四環(huán)素殘留的快速檢測。方法的檢出限為0.03 ng/mL，定量限為0.20 ng/mL；四環(huán)素質(zhì)量濃度在0.25～32 ng/mL時，熒光信號值與質(zhì)量濃度之間具有良好的線性關(guān)系，其回歸方程決定系數(shù)（R2）為0.995 9；本方法準確度高，四環(huán)素不同添加水平條件下的回收率在82.6%～97.0%之間；該方法具有良好的重復(fù)性，測定結(jié)果的日內(nèi)精密度和日間精密度均在5.0%以內(nèi)；本方法與高效液相色譜-串聯(lián)紫外檢測結(jié)果高度吻合。

磁珠；免疫反應(yīng)；熒光檢測；四環(huán)素；生鮮乳

四環(huán)素（tetracycline，TC）屬于廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、立克次氏體屬、支原體屬、衣原體屬等均有抑制作用［1］。TC在奶牛養(yǎng)殖業(yè)是一種被廣泛使用的抗生素，由于濫用或不遵守休藥期，造成其在動物性食品如牛乳、肌肉等組織中的殘留日益嚴重，可導(dǎo)致牛乳發(fā)酵異常，并造成人體腸道菌群紊亂和肝、腎毒性［2-3］。因此，歐盟第675/92號令規(guī)定：肌肉、牛乳中的TC類化合物的總量不得超過100 ng/g，腎臟、肝臟、雞蛋中分別不得超過600、300 ng/g和200 ng/g［4］；我國農(nóng)業(yè)部2002年12月24日發(fā)布的《動物性食品中獸藥最高殘留限量》以及國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和商務(wù)部2002年11月18日發(fā)布的《供港動物及其產(chǎn)品的生產(chǎn)、經(jīng)營和檢驗檢疫的有關(guān)要求》均規(guī)定牛乳中TC類藥物的最高殘留限量為TC、土霉素、金霉素均小于100 μg/kg［5-6］。

目前，動物源性食品中TC殘留檢測主要采用微生物法［7］、儀器分析法［8-10］和酶聯(lián)免疫分析法［11-12］。但微生物分析法常常出現(xiàn)假陽性結(jié)果，并且靈敏度較差［7］；儀器分析法通常需要對樣品進行復(fù)雜的前處理，操作繁瑣，測試時間長、費用高［13］；傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法雖然簡便、快速，但靈敏度較差，難以滿足抗生素殘留痕量、超痕量檢測的要求［14］。針對上述問題，本研究開發(fā)了一種磁性光學(xué)免疫傳感檢測法，可用于生鮮乳中TC殘留的快速、高靈敏檢測，為保障牛乳制品的安全提供更加有效的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

生鮮牛乳樣品 當?shù)啬膛ｐB(yǎng)殖場；滅菌純牛乳市購；環(huán)氧基磁性微粒（粒徑1 μm） 無錫百運納米科技有限公司；牛血清白蛋白（bull serum albumin，BSA）、吐溫-20 德國羅氏公司；TC標準抗體、TC-卵清白蛋白抗原（TC-ovalbumin，TC-OVA） 江南大學(xué)食品學(xué)院食品安全研究室；鹽酸TC、強力霉素（鹽酸多西環(huán)素）、青霉素、氯霉素、頭孢克肟、鏈霉素、慶大霉素標準品（純度＞97%） 中國食品藥品檢定研究院；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（horse radish peroxidase-IgG，HRP-IgG） 武漢博士德生物工程有限公司；對羥基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，p-HPA，純度＞99%） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物（純度≥99%） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O，純度9 9%） 西隴化工股份有限公司；檸檬酸（C6H8O7·H2O，純度≥99.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

Cary Eclipse熒光分光光度計、高效液相色譜-串聯(lián)紫外（high performance liquid chromatography-ultra violet，HPLC-UV）檢測器 安捷倫科技有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；四維旋轉(zhuǎn)混勻器海門市其林貝爾儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；6孔型磁性分離率架 洛陽惠爾納米科技有限公司；Milli-Q超純水器（電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃） 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1溶液的配制

偶聯(lián)液：pH 8.5的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖（phosphate buffer saline，PBS）溶液；封閉液：在偶聯(lián)液中添加質(zhì)量分數(shù)2% BSA溶液、質(zhì)量分數(shù)2%甘氨酸和1.3 mol/L無水硫酸鈉；淋洗液：在pH 7.4的0.01 mol/L PBS溶液中添加體積分數(shù)0.1%吐溫-20；磁珠保存液：在淋洗液中添加10 mg/mL的BSA溶液和質(zhì)量分數(shù)0.02%疊氮鈉溶液；抗體稀釋液：在pH 7.2的0.01 mol/L PBS溶液中添加質(zhì)量分數(shù)0.1% BSA溶液；0.1 mol/L三（羥甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris）-HCl底物緩沖溶液：12.116 g Tris和2.452 mL質(zhì)量分數(shù)38% HCl溶液定容于1 000 mL滅菌超純水中。

1.3.2磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法設(shè)計思路

圖1　磁珠熒光免疫傳感檢測方法構(gòu)思圖Fig.1　Schematic representation of the fluorescence immunoassay detection method based on magnetic beads

如圖1所示，其基本操作步驟：利用環(huán)氧基磁珠偶聯(lián)TC抗原，并封閉磁珠表面剩余的活性位點，制備磁性免疫傳感探針。根據(jù)免疫反應(yīng)原理，加入TC標準品和TC抗體，讓探針與標準品競爭性結(jié)合抗體，從而形成“磁珠-抗原-抗體”和“標準品-抗體”2 種免疫復(fù)合物。利用外加磁場使“磁珠-抗原-抗體”復(fù)合物迅速聚集沉降，除去上清液（“標準品-抗體”復(fù)合物）。加入HRP-IgG進行第2次免疫反應(yīng)，使HRP-IgG與抗體結(jié)合，形成“磁珠-抗原-抗體-二抗”夾心免疫復(fù)合物，反應(yīng)完成后進行充分洗滌，去除未免疫的HRP-IgG。加入底物液p-HPA和H2O2，在HRP的催化作用下H2O2氧化p-HPA產(chǎn)生強熒光物質(zhì)聯(lián)苯乙酸（bi-p,p′-hydroxyphenylacetic aicd，DBDA）［15-16］。熒光反應(yīng)完成后進行磁分，取上清液用熒光分光光度計（激發(fā)波長317 nm，吸收波長414 nm）測定熒光信號值。根據(jù)熒光信號值與樣品中TC含量之間的競爭抑制關(guān)系，制作標準曲線，完成定量檢測。

1.3.3磁性光學(xué)免疫傳感檢測步驟

第1步，磁性免疫傳感探針制備。1）磁珠偶聯(lián)TCOVA。用移液槍準確移取混合均勻的磁珠1 mg于2 mL離心管中，用1 000 μL偶聯(lián)液對磁珠進行3 次洗滌，磁分、棄上清液；然后取60 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的TC抗原工作液至磁珠中，再補加偶聯(lián)液至500 μL，混勻，并于20 ℃ pH 8.5的體系中反應(yīng)14 h，磁分、去上清液，得免疫磁珠。2）封閉。在1 mg免疫磁珠中加入1 000 μL封閉液，混勻，置于樣品混合儀上于20 ℃條件下封閉14 h，磁分、棄上清液；然后分別用1 000 μL偶聯(lián)液和1 000 μL淋洗液依次對磁珠進行洗滌3 次；最后將所制備的磁性免疫傳感探針保存于1 000 μL保存液中，備用。

第2步，取適量環(huán)氧基磁性免疫傳感探針加入到2 mL離心管中，再加入200 μL淋洗液，置于旋渦混合儀上混勻，然后磁分5 min，棄上清液。按同樣步驟重復(fù)洗滌1 次。

第3步，加入200 μL不同質(zhì)量濃度的TC標準品（或200 μL待分析牛乳樣品）和100 μL一定稀釋倍數(shù)的TC抗體，用旋渦混合儀混勻，然后置于樣品混合儀上在37 ℃、80 r/min條件下反應(yīng)40 min。

第4步，競爭反應(yīng)結(jié)束后，取出離心管磁分棄上清液，然后用200 μL淋洗液對磁珠重復(fù)洗滌3 次。

第5步，向每支離心管中加入100 μL經(jīng)3 000 倍稀釋的HRP-IgG，用旋渦混合儀混勻，然后置于樣品混合儀上在37 ℃、80 r/min條件下反應(yīng)40 min。

第6步，第2次免疫反應(yīng)結(jié)束后，取出離心管，磁分棄上清液，然后用200 μL淋洗液對磁珠重復(fù)洗滌4 次，以充分洗脫未結(jié)合的HRP-IgG。

第7步，再次向離心管中分別加入100 μL一定濃度的H2O2和15 mmol/L的p-HPA，充分混勻，避光反應(yīng)35 min。在HRP的催化作用下H2O2氧化p-HPA產(chǎn)生強熒光物質(zhì)DBDA。然后添加50 μL濃度為0.5 mol/L的硫酸溶液終止反應(yīng)5 min。

第8步，終止反應(yīng)結(jié)束后，磁分、取出上清液并加入1 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl底物緩沖液，用旋渦混合儀混勻。

第9步，取1 mL反應(yīng)溶液于微量四面透光石英比色皿中，用熒光分光光度計測定熒光信號值。所有測定數(shù)值均需要扣除背景信號值。

1.3.4磁性光學(xué)免疫傳感檢測法關(guān)鍵工作條件的確定

1.3.4.1H2O2濃度的選擇

當H2O2濃度過低時，氧化反應(yīng)不能充分進行，熒光信號值偏低；而濃度過高時，H2O2能淬滅HRP的活性，降低熒光信號數(shù)值［17］。因此，本實驗考察了H2O2濃度為1、3、5、7、9、11 mmol/L時對熒光信號值的影響。其他實驗條件為：免疫磁珠添加量30 μg，無TC標準品競爭，TC抗體稀釋倍數(shù)4 000 倍，HRP-IgG稀釋倍數(shù)3 000 倍，p-HPA濃度15 mmol/L，具體操作步驟見1.3.3節(jié)?？瞻讓φ眨ㄓ米鲀x器調(diào)零）不添加p-HPA，以100 μL超純水代替，其他參數(shù)及步驟同樣品。陰性對照（用作考察磁珠的非特異性吸附）不添加TC抗體，以100 μL抗體稀釋液代替，其他參數(shù)及步驟同樣品。

1.3.4.2免疫磁珠最佳用量及抗體最佳工作稀釋倍數(shù)的選擇

采用棋盤法，免疫磁珠（從左到右列排）選擇5、10、15、20、25 μg和30 μg，TC抗體（從上到下橫排）2 000～32 000 倍稀釋。其他實驗條件為：無TC標準品競爭，H2O2濃度選用1.3.4.1節(jié)優(yōu)化結(jié)果，p-HPA濃度15 mmol/L，HRP-IgG 3 000 倍稀釋，具體操作步驟見1.3.3節(jié)?？瞻讓φ蘸完幮詫φ胀?.3.4.1節(jié)。

1.3.5磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法驗證

1.3.5.1方法檢出限、定量限和線性范圍

按照磁性免疫熒光傳感檢測方法的操作步驟，分別用質(zhì)量濃度為32、16、8、4、2、1、0.5 ng/mL和0.25 ng/mL的TC標準品與免疫磁珠進行競爭反應(yīng)，測定各組的熒光信號值（B），并同時測定無TC標準品競爭條件下的熒光信號值（B0），計算各質(zhì)量濃度條件下的吸光度比值（B/B0）。每個質(zhì)量濃度點獨立平行測定3 次，以平均吸光度比值（B/B0）為橫坐標，對應(yīng)的TC標準品質(zhì)量濃度的對數(shù)值（lgC）為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線及線性回歸方程。

采用建立的磁性免疫光學(xué)傳感檢測方法對不含TC的空白樣品進行檢測，連續(xù)進行10 次獨立重復(fù)測定，計算10 次所得熒光吸收值的平均值和標準偏差，將平均值與3 倍標準偏差的差值代入標準曲線的線性回歸方程計算出對應(yīng)的TC質(zhì)量濃度，即為該方法的檢出限（limit of detection，LOD）。另外，將平均值與10 倍標準偏差的差值代入線性回歸方程計算出對應(yīng)的TC質(zhì)量濃度，即得該方法的定量限（limit of quantifi cation，LOQ）。以熒光信號值為橫坐標，對應(yīng)的TC標準品質(zhì)量濃度的對數(shù)值為縱坐標進行線性回歸，以線性相關(guān)系數(shù)（R2）為判定標準，確定線性范圍。

1.3.5.2方法的準確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性驗證

在空白生鮮乳和商品滅菌乳中分別添加1、10、25、50、100 ng/mL和150 ng/mL的TC標準品，然后用所建立的磁性免疫光學(xué)傳感檢測方法進行分析，每個質(zhì)量濃度點獨立平行測定3 次。根據(jù)實測值計算不同添加水平下的回收率?；厥章?、重復(fù)性和再現(xiàn)性實驗根據(jù)分析方法驗證標準進行［18］。

1.3.5.3方法特異性驗證

選取6 種常用抗生素（強力霉素、青霉素、氯霉素、頭孢克肟、鏈霉素和慶大霉素）來評估本方法的特異性。首先，利用本方法對上述6 種抗生素進行測定，分別得到它們的50%抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。然后，以上述6 種抗生素與TC的交叉反應(yīng)率來評價本方法的特異性，并按下式計算。

1.3.6磁性光學(xué)免疫傳感檢測法在生鮮牛乳樣品檢測中的應(yīng)用及與HPLC-UV檢測結(jié)果比對

將45 份生鮮乳樣品和5 份空白加標樣品以隨機方式進行編號，然后以本研究建立的磁性光學(xué)免疫傳感檢測法對樣品進行檢測；同時采用GB/T 22990—2008《牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定：液相色譜-紫外檢測法》［19］對樣品比對檢測，考察2 種方法的符合度。檢測時，每份樣品均獨立平行測定3 次。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2　結(jié)果與分析

2.1磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法的建立

2.1.1H2O2濃度對熒光信號值的影響

圖2　H2H2O2濃度對熒光信號值的影響Fig.2　Effect of H2O2concentration on the signal intensity of fluorescence

由圖2可以看出，當H2O2濃度從1 mmol/L增加到5 mmol/L時，熒光信號值逐漸增強，從198.663增加到264.567；然而當進一步增加H2O2濃度時，熒光信號值卻反而下降，特別是當H2O2濃度增加到11 mmol/L時信號值僅為185.327。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因主要是：在低濃度區(qū)間，H2O2濃度的增加使HRP催化p-HPA的氧化反應(yīng)更加充分，產(chǎn)生了更多含量的DBDA；然而當進一步增加濃度時，過多的H2O2可能淬滅了部分HRP的活性，導(dǎo)致熒光信號值降低。這與魏波［20-21］等報道的現(xiàn)象一致。綜上分析可知最優(yōu)的H2O2濃度為5 mmol/L。

2.1.2免疫磁珠最佳用量及抗體最佳工作稀釋倍數(shù)的確定

表1　不同免疫磁珠用量及TC抗體稀釋倍數(shù)條件下的熒光信號值Table1　Fluorescence signal intensity of obtained with different amounts of magnetic beads added and TC-antibody dilutions

從表1可以看出，隨著磁珠用量增加及抗體稀釋倍數(shù)的降低，熒光信號呈現(xiàn)逐漸增強的趨勢。由于磁性免疫熒光檢測體系是基于競爭免疫的原理而建立的，因此無競爭體系條件下的信號不能太強也不能太弱。如果信號太強，則會降低標準品（或待檢物）的競爭抑制效應(yīng)，使檢測靈敏度下降；相反，如果信號太弱，雖然能夠獲得較好的競爭抑制效果，但是也會增加實驗操作過程中的偶然誤差，使平行測定結(jié)果的變異系數(shù)增大［22］。因此，本研究選擇熒光吸收峰值在100附近時的免疫磁珠用量及TC抗體稀釋倍數(shù)作為后續(xù)IC50測定時的工作參數(shù)，篩選結(jié)果見表2，對應(yīng)工作條件下的IC50如圖3所示。

表2　磁性免疫熒光傳感檢測系統(tǒng)的免疫磁珠用量及TC抗體稀釋倍數(shù)Table2　The amounts of magnetic beads and TC-antibody dilutionsused in fluorescence immunosensor detection system

圖3　磁性免疫熒光傳感檢測系統(tǒng)不同工作條件下的TC抗體IC50Fig.3　IC50of anti-TC antibody obtained by fluorescence immunosensor detection system under different working conditions

從圖3可以看出，磁性免疫熒光檢測系統(tǒng)在不同工作條件下，TC抗體的IC50及測定結(jié)果的重復(fù)性均存在一定的差異，其中免疫磁珠用量15 μg、一抗8 000倍稀釋時，其IC50最低，為0.73 ng/mL，3 次測定值的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為6.15%；其次是添加20 μg磁珠時對應(yīng)的IC50為1.12 ng/mL，RSD為4.04%；相比而言，免疫磁珠用量10 μg、一抗4 000 倍稀釋時，所得IC50最高，為3.29 ng/mL，RSD為7.03%。根據(jù)IC50最低化的評價原則，并盡量滿足方法重復(fù)性好的要求［23］，本研究選擇免疫磁珠用量20 μg、一抗8 000 倍稀釋作為后續(xù)樣品測定時的工作參數(shù)。

2.1.3磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法的建立

磁性光學(xué)免疫傳感檢測法的關(guān)鍵工作條件為：免疫磁珠用量20 μg；TC抗體稀釋倍數(shù)8 000 倍，用量100 μL；H2O2濃度5 mmol/L，用量100 μL；其他實驗條件及操作步驟同1.3.3節(jié)所述。

2.2磁性免疫光學(xué)傳感檢測方法驗證

2.2.1檢測方法的檢出限、定量限和線性范圍

TC質(zhì)量濃度在0.25～32 ng/mL的范圍內(nèi)，標準曲線具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-4.193 1x+ 2.349 3，決定系數(shù)（R2）為0.995 9。利用本方法對空白生鮮乳樣品（不含TC殘留）重復(fù)測定10 次，計算出熒光信號平均值為120.639，標準偏差為3.283，將平均值與3 倍標準偏差的差值（110.791）代入回歸方程計算出LOD為0.03 ng/mL，將平均值與10 倍標準偏差的差值（87.810）代入回歸方程計算得LOQ為0.20 ng/mL。與常規(guī)酶聯(lián)免疫檢測法（多克隆抗體）［2］和HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜分析法［9］相比，本方法在檢測牛乳中TC殘留時的LOQ比常規(guī)HPLC-UV檢測法低24 倍；與限進介質(zhì)-磁性微球的磁分散萃取-液相色譜法［5］相比，本方法的LOD和LOQ分別比其低260 倍和130 倍。在檢測牛乳中TC殘留時，本方法的LOQ之所以比常規(guī)儀器分析法，特別是比液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法低，主要是因為儀器分析時需要對樣品進行復(fù)雜的前處理，如液液萃取、固相萃取柱、陽離子交換柱等進行凈化和濃縮，容易導(dǎo)致痕量目標物的丟失；而用本方法進行檢測時，無需對樣品進行復(fù)雜前處理，直接加入磁珠，利用其高分散性和超強順磁性以及免疫反應(yīng)的特異性和高靈敏度實現(xiàn)對痕量TC的檢測。

2.2.2方法的準確度、重復(fù)性和再現(xiàn)性驗證

從表3可以看出，TC在生鮮牛乳中的加標回收率在84.2%～96.6%之間，RSD為1.7%～6.4%，在商品滅菌乳中其回收率在82.6%～97.0%之間，RSD為2.7%～6.9%，表明本方法在檢測低、中、高6 個不同質(zhì)量濃度水平的TC時均具有較高的準確度，并且穩(wěn)定性好，能夠滿足后續(xù)實際樣品的檢測需求。此外，本方法日內(nèi)和日間精密度實驗結(jié)果見表4。

表3　磁性免疫熒光傳感檢測法加標回收實驗結(jié)果（n=3）Table3　Recoveries of TC determined by fluorescence immunosensor analysis based on magnetic beads （n = 3）

表4　磁性免疫熒光傳感檢測法的重復(fù)性和再現(xiàn)性驗證（n=6）Table4　Repeatability and reproducibility of the quantitative results for TC determined by fluorescence immunosensor analysis based on magnetic beads （ n= 6）

從表4可知，在TC添加量為5 ng/g生鮮乳時，本方法測定結(jié)果的日內(nèi)精密度為2.7%，日間精密度為4.1%；在添加量為10 ng/g時，其日內(nèi)和日間精密度分別為3.7%和4.4%?？傮w來看，對同一加標樣品進行測定時，其日間精密度值要大于日內(nèi)精密度，表明日間測定值的離散程度稍大，但都在5.0%以內(nèi)，這也證明本方法具有較高的重復(fù)性和再現(xiàn)性，符合方法學(xué)驗證標準的要求［18］，適合于生鮮乳中TC殘留的快速、高靈敏度檢測。

2.2.3方法特異性驗證結(jié)果

從表5可知，本方法在檢測強力霉素時，交叉反應(yīng)率小于4%，當檢測青霉素、氯霉素、頭孢克肟、鏈霉素和慶大霉素時，它們與TC的交叉反應(yīng)率均小于0.4%。因此，本方法對TC具有很高的特異性，可用于牛乳中TC殘留的高靈敏檢測。

表5　磁性免疫熒光傳感檢測法的特異性Table5　Specificity of fluorescence immunosensor analysis based on magnetic beads

2.3磁性免疫熒光傳感檢測法與HPLC-UV檢測結(jié)果比對

表6　實際樣品比對檢測結(jié)果（n=3）Table6　Comparison of detection results of TC residue in real samples （n = 3）

由表6可知，2 種檢測方法具有較高的符合性，除S17（TC含量低于HPLC-UV定量限）外，其他44 種樣品的盲測結(jié)論完全一致。另外，將10 份陽性樣品（S17除外）的比對檢測結(jié)果進行線性回歸分析，如圖4所示，線性回歸方程為y=1.029 7x-1.661 5，相關(guān)系數(shù)為0.997 4，表明這2 種方法在檢測牛乳中TC殘留時其結(jié)果具有較高的吻合性。進一步分析加標樣品（S6、S18、S26、S37、S44）檢測結(jié)果可知，磁性免疫熒光檢測法的準確度比HPLC-UV稍高，這主要是由于HPLC在檢測TC殘留時需要先對牛乳中的TC進行液液萃取，然后還需要經(jīng)過固相萃取柱和陽離子交換柱進行凈化、濃縮，步驟較多，容易導(dǎo)致目標物丟失，使檢測準確度下降［5,9,19,24-25］。相比而言，磁性免疫熒光檢測具有較高的靈敏度和準確度，這主要歸因于磁珠免疫反應(yīng)的高特異性和熒光檢測的高靈敏度［21,26］。

圖4　磁性免疫熒光檢測與HPLC-UV檢測結(jié)果的相關(guān)性（n=10）Fig.4　Correlation of the results obtained by both fluorescence immunosensor analysis and reference HPLC-UV methods for milk sample （n = 10）

3　結(jié) 論

本研究以環(huán)氧基磁珠為載體，開發(fā)了一種磁性光學(xué)免疫傳感檢測方法，可用于生鮮牛乳中TC殘留的快速、高靈敏檢測。方法靈敏度高，LOD為0.03 ng/mL；LOQ為0.20 ng/mL，LOQ比常規(guī)HPLC-UV檢測法低24 倍。本方法檢測結(jié)果準確可靠，并具有良好的重復(fù)性和再現(xiàn)性，與常規(guī)HPLC-UV比對檢測結(jié)果吻合度高。

［1］ URAPEN R, MASAWAT P. Novel method for the determination of tetracycline antibiotics in bovine milk based on digital-imagebased colorimetry［J］. International Dairy Journal, 2015, 44： 1-5. DOI：10.1016/j.idairyj.2014.12.002.

［2］ CONZUELO F, CAMPUZANO S, GAMELLA M, et al. Integrated disposable electrochemical immunosensors for the simultaneous determination of sulfonamide and tetracycline antibiotics residues in milk［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2013, 50： 100-105. DOI：10.1016/j.bios.2013.06.019.

［3］ FENG Y, ZHONG D, MIAO H, et al. Carbon dots derived from rose flowers for tetracycline sensing［J］. Talanta, 2015, 140： 128-133. DOI：10.1016/j.talanta.2015.03.038.

［4］ Commission Regulation （EEC） No. 675/92 amending Annexes Ⅰand Ⅲ of Council Regulation （EEC） No. 2377/90 laying down a community procedure for the establishment of maximum residue limits of veterinary medicinal products in foodstuffs of animal origin［G］// Offi cial Journal of the European Communities No. L73. Brussels： The Commission of the European Communities, 1992： 8-14.

［5］ 農(nóng)業(yè)部. 2002年第235號公告： 動物性食品中獸藥最高殘留限量［EB/OL］. （2002-12-24） ［2016-03-18］. http：//www.aqsiq.gov. cn/ xxgk_13386/jgfl /jckspaqj/ywxx/201210/t20121016_252217.htm.

［6］ 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局, 商務(wù)部. 2002年118號公告： 供港動物及其產(chǎn)品的生產(chǎn)、經(jīng)營和檢驗檢疫的有關(guān)要求［EB/OL］.（2002-11-18） ［2016-03-18］. http：//www.mofcom.gov.cn/article/b/ c/200404/20040400206546.shtml.

［7］ DANG P K, DEGAND G, DANYI S, et al. Validation of a twoplate microbiological method for screening antibiotic residues in shrimp tissue［J］. Analytica Chimica Acta, 2010, 672（1/2）： 30-39. DOI：10.1016/j.aca.2010.03.055.

［8］ 楊旭, 劉美嬌, 林深, 等. 限進材料固相萃取-高效液相色譜在線聯(lián)用檢測牛奶中四環(huán)素類抗生素殘留［J］. 分析化學(xué), 2016, 44（1）： 146-151. DOI：10.11895/j.issn.0253-3820.150443.

［9］ NEBOT C, GUARDDON M, SECO F, et al. Monitoring the presence of residues of tetracyclines in baby food samples by HPLC-MS/MS［J］. Food Control, 2014, 46： 495-501. DOI：10.1016/ j.foodcont.2014.05.042.

［10］ 卜明楠, 石志紅, 康健, 等. QuEChERS結(jié)合LC-MS/MS同時測定蝦肉中72 種獸藥殘留［J］. 分析測試學(xué)報, 2012, 31（5）： 552-558. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2012.05.008.

［11］ 國占寶, 武玉香, 田文禮, 等. 食品中四環(huán)素類殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制［J］. 食品科學(xué), 2011, 32（2）： 333-337.

［12］ WANG S, LIU J, YONG W, et al. A direct competitive assaybased aptasensor for sensitive determination of tetracycline residue in honey［J］. Talanta, 2015, 131： 562-569. DOI：10.1016/ j.talanta.2014.08.028.

［13］ 方慧文, 盧躍鵬, 周原, 等. 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時快速測定牛奶中不同類型的11 種獸藥殘留［J］. 分析測試學(xué)報, 2013, 32（2）：262-266. DOI：10.3969/j.issn.1004-4957.2013.02.022.

［14］ CHAFER-PERICAS C, MAQUIEIR A á, PUCHADES R. Fast screening methods to detect antibiotic residues in food samples［J］. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29（9）： 1038-1049. DOI：10.101 6/j.trac.2010.06.004.

［15］ GUILBAULT G G, Jr BRIGNAC P J, JUNEAU M. New substrates for the fl uorometric determin ation of oxidative enzymes［J］. Analytical Chemistry, 1968, 40（8）： 1256-1263. DOI：10.1021/ac60264a027.

［16］ NIU S Y, LI Q Y, REN R, et al. Enzyme-enhanced fluorescence detection of DNA on etched optical fibers［ J］. Biosensors and Bioelectronics, 2009, 24（9）： 2943-2946. DOI：10.1016/j.bios.2009.02.022.

［17］ SCHMIDT A, SCHUMACHER J T, REICHELT J, et al. Mechanistic and molecular investigati ons on stabilization of horseradish peroxidase C［J］. Analytical Chemistry, 2002, 74（13）： 3037-3045. DOI：10.1021/ ac0108111.

［18］ USP 37. USP 1225—2007 Validation of compendial procedures［S］. Washington： The United Sta tes Pharmacopieial Convention, 2007.

［19］ 中國國家標準化管理委員會. GB/T 22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素殘留量的測定： 液相色譜-紫外檢測法［S］. 北京： 中國標準出版社, 2008.

［20］ 魏波. 基于磁珠-酶放大免疫熒光方法檢測豬胸膜肺炎放線桿菌感染血清中ApxIVA抗體［D］. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012： 15-19.

［21］ WEI B, LI F, YANG H, et al. Magnetic beads-based enzymatic spectrofluorometric assay for rapid and sensitive detection of antibody against ApxIVA of Actinobacillus pleuropn eumoniae［J］. Biosensors and Bioelectronics, 2012, 35（1）： 390-393. DOI：10.1016/ j.bios.2012.03.027.

［22］ 張道宏. 黃曲霉毒素雜交瘤細胞株的選育及免疫層析檢測技術(shù)研究［D］. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 2011： 54-63.

［23］ 陳秀金. 擬除蟲菊酯類農(nóng)藥免疫快速檢測方法及其定量構(gòu)效模型的建立［D］. 無錫： 江南大學(xué), 2013： 53-57.

［24］ 賈濤. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶中的四環(huán)素類藥物［J］. 中國乳業(yè), 2015（4）： 54-58. DOI：10.3969/j.issn.1671-4393.2015.04.016.

［25］ 智若嵐. 豬肉 及雞蛋中四環(huán)素類抗生素殘留檢測方法研究［D］. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 2011： 27-34.

［26］ LI F, ZHOU R, ZHAO K, et al. Magnetic beads-based electrochemical immunosensor for detection of pseudora bies virus antibody in swine serum［J］. Talanta, 2011, 87： 302-306. DOI：10.1016/ j.talanta.2011.09.049.

Establishment of Magnetic Bead-Based Immunosensor for the Detection of Tetracycline Residues in Milk

KANG Huaibin1,2, MA Hongyan1, LI Fang1, XU Baocheng1,2, LUO Denglin1,2, ZHANG Ruihua1, ZOU Liangliang1
（1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China；2. Henan Engineering Research Center of Food Material, Luoyang 471003, China）

A highly sensitive and rapid immunofluorescence assay for the detection of tetracycline residues in raw milk based on magnetic beads was developed. The limit of detection （LOD） and limit of quantifi cation （LOQ） of this method were 0.03 and 0.20 ng/mL, respectively. The fl uorescence intensity was linear with the concentration of tetracycline in the range of 0.25 to 32 ng/mL with a coeffi cient of determination of 0.995 9 （R2= 0.995 9）. The recoveries of TC spiked at different concentrations were between 82.6% and 97.0%, indicating that the method is accurate. Furthermore, precision, calculated as relative standard deviation （RSD）, was below 5.0% for intra-day and inter-day determinations, indicating good repeatability of the method. The results of tetracycline residues in raw milk determined by this method and HPLC-UV were highly consistent.

magnetic beads； immunoreaction； fluorescence detection； tetracycline； raw milk

10.7506/spkx1002-6630-201620019

TS207.3

A

1002-6630（2016）20-0113-07

康懷彬, 馬紅燕, 李芳, 等. 基于磁性免疫傳感器的牛乳中四環(huán)素殘留檢測方法的構(gòu)建［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）：113-119. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620019. http：//www.spkx.net.cn

KANG Huaibin, MA Hongyan, LI Fang, et al. Establishment of magnetic bead-based immunosensor for the detection of tetracycline residues in milk［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 113-119. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201620019. http：//www.spkx.net.cn

2016-04-30

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31501563）；洛陽市畜牧局項目（2518）；河南科技大學(xué)校級創(chuàng)新團隊項目（2015XTD007）

康懷彬（1963—），男，教授，碩士，研究方向為農(nóng)畜產(chǎn)品加工及質(zhì)量控制。E-mail：khbin001@163.com