糖腎安對高糖環(huán)境下大鼠腎臟及腎系膜細胞炎性因子ICAM-1表達的影響

胡　爽，王　鎂

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

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論著

糖腎安對高糖環(huán)境下大鼠腎臟及腎系膜細胞炎性因子ICAM-1表達的影響

胡爽1，王鎂2

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

目的探討糖腎安對高糖環(huán)境下大鼠腎臟及腎系膜細胞炎性因子細胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達的影響。方法①實驗一：50只健康SD大鼠隨機分成正常組和造模組，造模組高糖高脂喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導2型糖尿病模型，成模大鼠隨機分為模型組、糖腎安高劑量組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組和西藥組，各給藥組給予相應藥物8周后收集腎臟標本。②實驗二：大鼠腎系膜細胞株解凍復蘇后制成細胞懸液，將其按照實驗一分組方法進行分組，各藥物干預組在相應含藥血清中培養(yǎng)24 h后收集細胞。2組實驗采用Western blot、RT-PCR方法檢測ICAM-1表達情況。結(jié)果①實驗一：模型組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組ICAM-1表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，糖腎安各組及西藥組ICAM-1表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組ICAM-1表達量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組(P均<0.05)。②實驗二：各藥物干預組ICAM-1表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但明顯低于模型組(P均<0.05)；糖腎安高劑量組ICAM-1表達量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論糖腎安可抑制大鼠腎臟及腎系膜細胞炎性因子ICAM-1的表達，減輕腎臟組織病理學改變，其腎臟保護作用可能與抑制ICAM-1表達水平有關。

糖腎安；大鼠；腎臟；腎系膜細胞；ICAM-1

糖尿病性腎臟疾病(Diabetic Kidney Disease，DKD)是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一[1]，也是終末期腎病的主要原因[2]。細胞間黏附因子-1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員，通過識別其受體白細胞功能相關抗原-1(LFA-1)等而促進炎癥和免疫反應，其與腎臟炎癥的病理生理學關系密切[3-5]。本研究通過體內(nèi)外實驗，采用Western blot、RT-PCR方法檢測中藥糖腎安對實驗性2型糖尿病大鼠腎臟及高糖培養(yǎng)下腎系膜細胞炎性因子ICAM-1表達的影響，探討糖腎安對糖尿病大鼠腎臟保護的作用機制，旨在為其治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1　實驗資料

1.1實驗材料大鼠腎系膜細胞株，由湖南湘雅醫(yī)學院實驗室提供；SPF級雄性健康SD大鼠70只，體質(zhì)量230～300 g，由沈陽龍元經(jīng)濟動物養(yǎng)殖場提供，動物合格證編號：SCSK(遼)2010-0001。

1.2試劑藥品鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)(美國Sigma公司)，蛋白裂解液(碧云天生物技術公司)，10%胎牛血清(GIBCO公司)，ICAM-1引物(Invitrogen生物試劑公司)，ICAM-1一抗、二抗(武漢博士德公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，75%乙醇，胰蛋白酶，DMEM培養(yǎng)基(高糖、低糖)，厄貝沙坦片(安博維，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，生產(chǎn)批號：2A292)，糖腎安煎劑(由黃芪、茯苓、白術等8味中藥組成，購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，藥物水煎過濾濃縮至含生藥3 g/mL)。

1.3儀器設備TDL-5-A型離心機(飛鴿牌Anke，上海安亭科學儀器廠)，EQ.0603-021型PCR儀(日本TaKaRa公司)，Bioshine GelX 1520型凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)，DK-SA型恒溫水浴箱(上海躍進醫(yī)療儀器廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細胞培養(yǎng)瓶。

1.4實驗方法

1.4.1實驗一

1.4.1.1分組及動物模型建立取50只健康SD大鼠普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常組8只和造模組42只，造模組用高糖高脂飼料(豬油10%，膽固醇2%，膽酸鹽1%，蔗糖20%，普通飼料67%配比)喂養(yǎng)4周。大鼠造模前禁食不禁水12 h，造模組按35 mg/kg一次性左側(cè)腹腔注射1% STZ溶液，正常組注射相應量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后大鼠尾靜脈取血測血糖，血糖≥16.7 mmol/L且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象確認為2型糖尿病造模成功。造模過程中無大鼠死亡，3只大鼠未成模，從實驗中剔除。

1.4.1.2分組及給藥方法將成模大鼠隨機分為模型組7只、糖腎安低劑量組8只、糖腎安中劑量組8只、糖腎安高劑量組8只、西藥組8只。糖腎安低、中、高劑量組大鼠分別給予糖腎安6 g生藥/(kg·d)、18 g生藥/(kg·d)、60 g生藥/(kg·d)灌胃，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg /(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予相應量的生理鹽水灌胃，各組大鼠均每天灌胃1次，其中糖腎安低劑量組2只死亡，從實驗中剔除。

1.4.1.3標本采集連續(xù)灌胃8周，在末次灌胃1 h后以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，收集腎臟標本，縱向剖開切取皮質(zhì)部分，置于凍存管中-80 ℃保存待用。

1.4.2實驗二

1.4.2.1細胞復蘇及培養(yǎng)大鼠腎系膜細胞株復溫后從水浴箱中取出凍存管，用75%乙醇噴灑消毒后開啟，吸出細胞懸液，移入離心管內(nèi)，緩慢加入7～8 mL含10%胎牛血清的細胞培養(yǎng)液,充分混勻,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入適量細胞培養(yǎng)液,移入細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2.2細胞傳代將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞生長至80%融合時行細胞傳代。吸除瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液,以無菌常溫PBS緩沖液沖洗1～2次，加入1 mL胰蛋白酶輕輕搖動培養(yǎng)瓶，消化1～3 min后把培養(yǎng)瓶放置于顯微鏡下觀察，倒掉消化液，加入少量含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化反應。吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液,反復輕輕吹打瓶壁細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量新培養(yǎng)液，等量分種于新培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)條件同前，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，待細胞生長至大部分融合時，可以再次傳代，本實驗選用3～10代的細胞。

1.4.2.3藥物血清制備取健康雄性SD大鼠20只，自由飲食，適應性喂養(yǎng)4 d后,隨機分為正常組5只、西藥組3只、糖腎安低劑量組4只、糖腎安中劑量組4只、糖腎安高劑量組4只，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg/(kg·d)灌胃，每天1次；糖腎安低、中、高劑量組大鼠分別給予糖腎安6 g生藥/(kg·d)、18 g生藥/(kg·d)、60 g生藥/(kg·d)灌胃，上、下午各1次；正常組給予相應量的生理鹽水灌胃，每天1次。各組均連續(xù)灌胃3 d，在末次灌胃1 h后以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，在無菌條件下經(jīng)腹主動脈采血，3 000 r/min離心15 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，分裝-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.4藥物血清培養(yǎng)細胞實驗分為6組：模型組給予10%無藥血清0.5 mL+30 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；正常組給予10%無藥血清+5 mmol/L低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安低劑量組給予10%低劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安中劑量組給予10%中劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安高劑量組給予10%高劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；西藥組給予10%厄貝沙坦血清0.5 mL+30 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.4.3檢測指標

1.4.3.1大鼠腎臟組織ICAM-1表達情況采用Western blot法檢測。取100 mg腎皮質(zhì)，加入細胞裂解液，冰浴下組織勻漿、離心；取組織裂解蛋白50 μg，經(jīng)12%SDSPAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；加一抗4 ℃過夜，加二抗室溫2 h，以上兩步后TBST洗膜10 min×3次；PVDF膜與顯色劑反應后掃描，以GAPDH為內(nèi)參用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標帶的凈光密度值。

1.4.3.2大鼠腎系膜細胞ICAM-1表達情況采用RT-PCR法檢測。取大鼠腎系膜細胞1×107，按TransZol Up試劑盒提供方法提取總RNA，用蛋白核酸分析儀測定OD260和OD280值，計算總RNA純度。取2.5 μL總RNA作為cDNA合成的模板。擴增參數(shù)：94 ℃ 3 min預變性，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，3個循環(huán)后72 ℃延伸5 min。均取10 μL的PCR產(chǎn)物及DNA Marker DL2000標準比較物，置1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以5 V/cm電壓電泳60 min。以凝膠分析系統(tǒng)拍攝、定性定量分析。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠腎臟組織中ICAM-1表達情況正常組腎臟組織中ICAM-1表達量為30.38±4.07，模型組為81.50±5.13，糖腎安低劑量組為67.63±7.46，糖腎安中劑量組為35.88±4.52，糖腎安高劑量組為17.13±2.95，西藥組為55.25±5.80。模型組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組ICAM-1表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，糖腎安各組及西藥組ICAM-1表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組ICAM-1表達量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組(P均<0.05)。見圖1。

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組 圖1　各組大鼠腎臟組織中ICAM-1表達情況

2.2各組大鼠腎系膜細胞ICAM-1表達情況正常組腎系膜細胞ICAM-1表達量為0.25±0.03，模型組為0.62±0.04，糖腎安低劑量組為0.38±0.04，糖腎安中劑量組為0.37±0.05，糖腎安高劑量組為0.30±0.04，西藥組為0.31±0.03。各藥物干預組ICAM-1表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但明顯低于模型組(P均<0.05)；糖腎安高劑量組ICAM-1表達量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組(P均<0.05)，但與西藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組 圖2　各組大鼠腎系膜細胞ICAM-1表達情況

3　討　　論

黏附分子是介導細胞間或細胞與細胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類糖蛋白的統(tǒng)稱，主要表達于細胞膜表面與細胞外基質(zhì)中，它參與了機體的免疫應答、炎癥發(fā)生及創(chuàng)傷愈合、細胞活化等一系列重要生理和病理過程。ICAM-1是其中一種重要的黏附分子，可促進白細胞與血管內(nèi)皮細胞的黏附及滲出，擴大炎癥反應，造成血管病變，導致組織器官發(fā)生病理生理的改變[6]。

在DKD發(fā)生發(fā)展中，ICAM-1可介導內(nèi)皮細胞、單核細胞或巨噬細胞和淋巴細胞黏附，使炎性細胞游走到腎臟組織，產(chǎn)生細胞因子，增強白細胞的黏附，加重內(nèi)皮細胞的損傷，造成血管通透性增強、蛋白漏出，形成蛋白尿[7]，并引起細胞外基質(zhì)沉積，腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化[8]，因此ICAM-1作為一項重要的指標反映了DKD的早期病變，參與了DKD的發(fā)病機制[9]。有報道顯示ARB類藥物伊貝沙坦能阻止或延緩糖尿病大鼠腎臟的病理損害，降低ICAM-1mRNA的表達水平[10]。

澳大利亞學者通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，患有糖尿病的小鼠與健康小鼠相比，在8月齡時可出現(xiàn)蛋白尿、巨噬細胞浸潤癥狀，而ICAM-1基因敲除的小鼠在6個月和8個月時尿蛋白分別下降77%和85%，腎小球肥大和腎小管損傷得到改善，并可延緩腎臟纖維化進展[11]。長期的臨床研究表明，中醫(yī)中藥在防治和延緩DKD的發(fā)展上具有一定的作用[12-13]。本研究Western blot及RT-PCR法檢測結(jié)果顯示，ICAM-1在糖尿病模型組表達均明顯增強，表明ICAM-1可能在高糖狀態(tài)下被激活；給予糖腎安干預后，腎臟組織及腎系膜細胞ICAM-1表達量均明顯降低。提示糖腎安可抑制高糖環(huán)境下糖尿病大鼠腎臟及腎系膜細胞炎性因子ICAM-1的表達，減輕腎臟組織病理學改變，其腎臟保護作用可能與抑制ICAM-1表達水平有關。

[1]Bloomgarden Zachary T. Diabetic nephropathy[J]. Diabetes Care，2008，31(4)：823-827

[2]Seaquist ER，Ibrahim HN. Approach to the patient with type 2 diabetes and progressive kidney disease[J]. J C1in Endocrinol Metab，2010，95(7)：3103-3110[3]Soetikno V，Sari FR，Veeraveedu PT，et al. Curcumin ameliorates macrophage infiltration by inhibiting NF-kappaB activation and proinflammatory cytokines in streptozotocin induced-diabetic nephropathy[J]. Nutr Metab，2011，8(1)：35

[4]Tang SC，Leung JC，Lai KN. Diabetic tubulopathy：an emerging entity[J]. Contrib Nephrol，2011，170：124-134

[5]Fornoni A，Ijaz A，Tejada T，et al. Role of inflammation in diabetic nephropathy[J]. Curr Diabetes Rev，2008，4(1)：10-17

[6]高若愚，曲竹秋，常柏. 抵擋湯對糖尿病腎病大鼠腎臟ICAM-1作用的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2012,18(12)：143-145

[7]呂永曼，黃曉麗，易艷. 霉酚酸酯對糖尿病大鼠腎間質(zhì)細胞浸潤及腎組織ICAM-1和MCP-1 mRNA表達的影響[J]. 中華腎臟病雜志，2006，22(9)：576-577

[8]Wang L J，Zhang L，Yu Y，et al. The protective effects of taurine against early renal injury in STZ-induced diabetic rats，correlated with inbibition of renal LOX-1 mediated ICAM-1 expression[J]. Ren Fail，2008，30(8)：763

[9]Xiaoxia Pan，Jianfu Wang，Yanhua Pu，et al. Puerarin regulates kidney gene expression[J]. Med Sci Monit,2015，21：2134-2140

[10] 曾龍驛，舒冏，林可意，等. 伊貝沙坦對糖尿病大鼠腎氧化應激、NF-κB活性和ICAM-1 mRNA表達的影響[J]. 中山大學學報：醫(yī)學科學版，2008，29(4)：402-406

[11] Chow FY，Nikolic-Paterson DJ，Ozols E，et al. Intercelluar adhesion molecule-1 deficiency is protectice against nephropathy in type 2 diabetic db/db mice[J]. Jam Soc Nephrol，2005,16(6)：1711-1722

[12] 李潔，楊洪濤，楊波，等. 益氣養(yǎng)陰、活血通絡法對糖尿病腎病(Ⅲ期)中醫(yī)證候及尿蛋白影響的研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(3)：230-232

[13] 殷美琦，劉蘇，余江毅. 中成藥治療糖尿病腎病蛋白尿的研究現(xiàn)狀[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(2)：178-179

Effect of Tangshenan decoction on expression of inflammatory factor ICAM-1 of rat kidney and kidney mesangial cell in high sugar environment

HU Shuang1，WANG Mei2

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,Liaoning, China；2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032, Liaoning,China)

Objective It is to explore the effect of Tangshenan decoction on the expression of inflammatory factor ICAM-1 of rat kidney and kidney mesangial cell in high sugar environment. Methods Experiment I:50 SPF healthy SD rats were randomly divided into normal group and model building group,the rats in model building group were fed with high-sugar high-fat diet for 4 weeks,then they were given Streptozotocin by intraperitoneal injection one time to induce type 2 diabetes models.The rat models successfully established were randomly divided into model group,Tangshenan high,medium and low concentration groups,western medicine group which were treated with respective drugs for 8 weeks,then their kidney specimens were collected for observation.Experiment II: The rat renal mesangial cell lines after the thawing recovery were used to make cell suspension,then they were divided according to the method in experiment I. The cells were collected after every drug intervention group was cultured under respective drug-containing serum for 24 h. ICAM-1 expression was detected by Westernblot,RT-PCR. Results Experiment I:The expression of ICAM-1 in the model group,low and middle Tangshenan group,western medicine group were higher than that in normal group(P<0.05);that in Tangshenan groups and western medicine group were significantly lower than that in model group(P<0.05);that in Tangshenan high dose group was lower than that in middle and low dose of Tangshenan groups and western medicine group (P<0.05).Experiment II:The expression of ICAM-1 in every drug intervention group was higher than that in normal group but lower than that in model group(P<0.05);the expression in Tangshenan high dose group was lower than that in middle and low dose of Tangshenan groups(P<0.05). Conclusion Traditional Chinese medicine Tangshenan decoction could inhibit the expression of cell inflammatory factor ICAM-1 in rat kidney and kidney mesangial cell,relieve kidney tissue pathology change. The renal protective effect may be related to regulating ICAM-1 expression level.

Tangshenan decoction；kidney of rats；renal mesangial cells;ICAM-1

胡爽，女，在讀碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝研究工作。

王鎂，E-mail：wm896464@163.com

沈陽市科技計劃項目(F14-231-1-11)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.29.001

R-332

A

1008-8849(2016)29-3193-04

2016-04-25