不同濃度硒含量的富硒乳酸菌抑制黃曲霉菌生長以及產毒效果的研究

姚婉，趙方紅，劉麗娜，秦順義

（天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津西青區(qū)300384）

不同濃度硒含量的富硒乳酸菌抑制黃曲霉菌生長以及產毒效果的研究

姚婉，趙方紅，劉麗娜，秦順義*

（天津農學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津西青區(qū)300384）

為研究不同濃度硒含量的乳酸菌對黃曲霉菌生長及產毒的抑制效果，測定了硒濃度分別為10、15、20、25 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的乳酸菌對黃曲霉菌落生長抑制率、黃曲霉孢子生長抑制率以及黃曲霉產毒量抑制效果。結果顯示：硒濃度在10～25 μg/mL，培養(yǎng)48 h的富硒乳酸菌對于黃曲霉生長的抑制率較乳酸菌組增長了0.6%～9.4%，96 h抑制率達到了37.1%；培養(yǎng)6 h的黃曲霉孢子生長抑制率較乳酸菌組增長了0.2%～61%，24 h抑制率達到93.6%；產黃曲霉毒素B1抑制率較乳酸菌組提高10.3%～56.6%，24 h抑制率達到了97.3%。硒濃度達到25 μg/mL的富硒乳酸菌對于黃曲霉生長的抑制率、黃曲霉孢子生長抑制率和產黃曲霉毒素B1抑制率均達到最大。結果提示，富硒乳酸菌對于黃曲霉菌落的生長、孢子萌發(fā)以及黃曲霉毒素的產生都有一定程度抑制作用，并且硒濃度達到25 μg/mL，抑制效果最好。

乳酸菌；黃曲霉菌；生長抑制率；孢子；富硒乳酸菌；黃曲霉毒素B1

黃曲霉可對飼料造成嚴重污染，其產生的毒素中黃曲霉毒素B1（AFB1）的毒性最強，是氟化鉀的10倍，砒霜的68倍，會對機體造成致畸、致癌、致突變的危害（馮建蕾，2005），并能降低機體的免疫力，造成肝臟的損傷甚至死亡。目前黃曲霉毒素的去毒方法有物理、化學方法和生物學方法。利用物理方法和化學方法在一定程度上可以減少黃曲霉毒素B1對人類造成的危害，但這些方法均存在安全性及食品營養(yǎng)損失等問題。生物學方法是利用微生物吸附毒素和降解代謝產物，具有安全、高效、無二次污染的特點（王宏祥，2014）。研究表明乳酸菌對于黃曲霉毒素B1有一定的吸附作用，但并不能完全去除AFB1，主要是對其進行吸附脫毒，降解率不高（EL-Nezami等，1998）。Eraslan等（2005）研究發(fā)現，將乳酸菌添加到培養(yǎng)基中可顯著抑制曲霉菌絲的生長和毒素形成。有機硒也可以有效拮抗黃曲霉毒素B1的毒性，從而緩解其對機體造成的損害。無機硒對機體有一定的毒性，乳酸菌具有將有毒性的無機硒轉化為無毒的有機硒的特性，結合形成的富硒乳酸菌對于黃曲霉毒素B1的吸附和拮抗效果更好，對于黃曲霉的生長也起到有效的抑制作用。本試驗選取硒濃度分別為10、15、20、25 μg/mL，主要對黃曲霉生長抑制率、黃曲霉孢子生長抑制率和黃曲霉產毒量抑制效果進行比較，并找到對黃曲霉抑制效果最佳的硒濃度的富硒乳酸菌。

1　材料與方法

1.1試驗材料產毒黃曲霉CGMCC 3.4410，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；乳酸菌株，實驗室保存。

察氏瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）；PDA瓊脂培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司）；產毒培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術有限公司）。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉5 g，磷酸氫二鉀2 g，檸檬酸氫二銨2 g，七水硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，吐溫-80 1 mL，蒸餾水定容1000 mL，pH 6.8，121℃高壓滅菌15 min，分裝，待用。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂，121℃高壓滅菌15 min，冷卻后倒入平板內置于4℃冰箱內待用。亞硒酸鈉貯備液：精確稱取亞硒酸鈉0.0218 g，溶于蒸餾水，然后定容至100 mL，所得溶液的硒濃度為100 μg/mL（以硒計）。

亞硒酸鈉（合肥博美生物科技有限責任公司）、丙三醇（天津市北辰方正試劑廠）、磷酸鹽緩沖液［含0.05%吐溫-80（V/V）］、AFB1檢測試劑盒（Beacon公司）、乳酸（天津市北辰方正試劑廠）。

1.2試驗方法

1.2.1富硒乳酸菌的制備將1%的乳酸菌種子液分別接種到含有亞硒酸鈉溶液的MRS液體培養(yǎng)基中，硒濃度分別為10、15、20、25μg/mL，37℃、120rmp培養(yǎng)48 h。將乳酸菌濃度調整到1×109cfu/mL。

1.2.2孢子懸液的制備將活化的黃曲霉菌接種在PDA斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)5～10 d后，加入一定量的磷酸鹽緩沖液（含0.05%吐溫-80），用接種環(huán)挑取斜面上的孢子到緩沖液中，然后將含有霉菌孢子的磷酸鹽緩沖溶液通過無菌紗布過濾以除去菌絲殘體。用磷酸鹽緩沖溶液將孢子濃度調整到1×107cfu/mL，待用。

1.2.3對黃曲霉菌生長的影響分別用四種不同濃度硒含量富硒乳酸菌菌液、不含硒乳酸菌全菌液各1 mL分別涂布在7個PDA培養(yǎng)基上，待液體完全吸收后，在培養(yǎng)基的中心接種20 μL黃曲霉孢子懸液（1×107cfu/mL），同時設未涂布乳酸桿菌的空白PDA培養(yǎng)基為空白對照組，接種20 μL黃曲霉孢子懸液，28℃培養(yǎng)，分別對培養(yǎng)48、72、96 h菌落大小進行測量，計算乳酸菌對霉菌生長的抑制率。

每組設3個重復，各試驗重復3次，以3次試驗結果平均值進行分析。

1.2.4對黃曲霉孢子生長數量的影響處理組：將500 μL的黃曲霉胞子液（1×107cfu/mL）分別加入到5 mL四個不同濃度的富硒乳酸菌菌液（1× 109cfu/mL）、不含硒乳酸菌全菌液中。

空白對照組：將500 μL黃曲霉孢子懸液接種到空白的MRS液體培養(yǎng)基中，不調pH值。處理組和空白對照組均在28℃培養(yǎng)，分別于6、18、24 h取不同處理組0.1 mL涂布PDA平板，28℃培養(yǎng)5 d，進行孢子計數，計算處理組和對照組1的抑制率，計算公式為：

各組均設3個重復，各試驗重復3次，以3次試驗結果平均值進行分析。

1.2.5對黃曲霉產毒量的影響在63.34 g甘油中加入1L水，配成甘油水溶液，主要作用是保持培養(yǎng)基的濕度，將產毒培養(yǎng)基滅菌后分裝在培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿均勻噴灑滅菌過的2 mL甘油水溶液待用。用黃曲霉孢子數量影響試驗中的處理組胞子懸液分別于6、18、24 h取100 μL懸液點植接種在培養(yǎng)基正中央，同時設空白對照組：在5 mL無菌生理鹽水中加入500 μL黃曲霉孢子懸液，吸取100 μL懸液，同樣的方法點植接種在培養(yǎng)基正中央，35℃培養(yǎng)16～17 d。每組設3個重復組，各試驗重復3次，以3次試驗結果平均值進行分析。

AFB1的提?。簩⑴囵B(yǎng)皿黃曲霉連同培養(yǎng)基一同放入燒杯中。在燒杯中加入1gNaCl，加入10 mL甲醇-水提取液（V/V=1∶1），用玻璃棒攪拌，超聲萃取10 min后，用玻璃纖維濾紙過濾，取上濾液，用AFB1檢測試劑盒進行檢測。

2　結果與分析

2.1黃曲霉生長抑制試驗結果從表1的結果可見，在48 h時，四個試驗組黃曲霉菌落的生長抑制率較乳酸菌對照組增長0.6%～9.5%，且隨著培養(yǎng)時間的延長，對黃曲霉菌落生長的抑制效果有所增加，到96 h硒濃度為25 μg/mL的試驗組黃曲霉霉菌落生長抑制率達到了37.1%。

表1　黃曲霉菌落生長抑制效果%

2.2黃曲霉孢子萌發(fā)數量抑制試驗結果從表2可以看出，乳酸菌對照組和四個試驗組對孢子的萌發(fā)均起到了抑制的作用，在6 h時，硒濃度為20、25 μg/mL的試驗組較乳酸菌對照組增長了39.1%、61%；在18 h時，硒濃度為15、20、25 μg/mL的試驗組的抑制率均達到了60%以上；24 h抑制率均有所增長，硒濃度為25 μg/mL組抑制率達到了94.6%。

表2　黃曲霉孢子萌發(fā)數量抑制效果%

2.3黃曲霉產毒抑制試驗從表3的試驗結果可見，6 h時四個試驗組黃曲霉菌落生長抑制率較乳酸菌對照組增長10.3%～56.6%，硒濃度為20、25 μg/mL組對于黃曲霉產毒的抑制率分別增長32.2%和56.6%，且隨培養(yǎng)時間的延長，抑制率都有一定程度的增長，在18 h以及24 h時，硒濃度25 μg/mL組的抑制率超過90%。

3　討論

動物食入被黃曲霉毒素污染的飼料后，導致采食量下降，日增重緩慢，飼料利用率下降。經研究發(fā)現1 mg/kg含量的AFB1就可以造成畜禽體重、產蛋率、產奶率、飼料利用率等生產指標下降（劉玫珊，1994）。飼料中黃曲霉毒素含量越多，對動物生產性能損害越大，當黃曲霉毒素濃度達到動物耐受極值時，慢性作用轉化為急性作用，直接導致死亡（Schell等，1993）。預防黃曲霉毒素對食品污染的最有效手段是控制產毒素霉菌的生長，有效控制黃曲霉產毒量，經研究發(fā)現乳酸菌對黃曲霉生長和孢子萌發(fā)以及產毒效果均有一定的抑制作用（徐進等，2001）。

表3　黃曲霉產毒抑制效果%

乳酸菌對于黃曲霉生長及其產毒量抑制效果的相關研究較多，但未見富硒乳酸菌吸附黃曲霉毒素的研究。在富硒乳酸菌對黃曲霉菌落生長抑制試驗中發(fā)現乳酸菌組以及4個不同硒濃度的試驗組對于黃曲霉菌落生長均可起到一定的抑制作用，但是抑制率較低，可能是由于所選用的乳酸菌傳代次數過多，培養(yǎng)出來的乳酸菌的表面性質或者表面結構產生變化。

本試驗結果表明，富硒乳酸菌對于黃曲霉抑制效果優(yōu)于乳酸菌的效果，隨著硒濃度的增大，富硒乳酸菌對于黃曲霉生長的抑制率、黃曲霉胞子生長抑制率和黃曲霉毒素B1產生抑制率有所增大，并且隨著時間的延長抑制效果有所增加，硒濃度達到25 μg/mL的富硒乳酸菌對于黃曲霉生長的抑制率、黃曲霉孢子生長抑制率和黃曲霉毒素B1產生抑制率達到最大。

4　結論

黃曲霉及其產生的毒素可污染糧食作物及飼料，從而影響畜禽的生產繁殖以及人類健康，因而從源頭控制或減少黃曲霉的生長及產毒意義重大。本試驗研究表明，富硒乳酸菌能夠抑制黃曲霉生長、胞子萌發(fā)以及產毒量，硒濃度達到25 μg/mL時抑制效果最好。富硒乳酸菌無毒無害，且具有一定的保健功效，因此，可用于控制黃曲霉毒素污染，從而減少黃曲霉對人類造成的危害。

［1］馮建蕾.黃曲毒素的危宙危害和防治［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（12）：5～7.

［2］劉玫珊.含硫氨基酸對黃曲霉毒素B的解毒機理［J］.中國獸醫(yī)科技. 1994，11：6～9.

［3］王宏祥.富硒乳酸菌拮抗黃曲霉毒素對肉仔雞毒性作用的研究：［碩士學位論文］.天津［D］：天津農學院，2014.

［4］徐進，李玉偉，計融，等.乳桿菌及不同pH值對黃曲霉生長與產毒的影響［J］.中國食品衛(wèi)生雜志.2001，13（6）：3～6.

［5］El-Nezami H，Kankaanpaa P，S，et al.Ability of dairy strains of lactic acid bacteria to bind a common food carcinogen，aflatoxin B1［J］.Food and Chemical Toxicology，1998，36（4）：321～326.

［6］Eraslan G，Akdogan M，Yarsan E，et al.The effects of aflatoxin on oxidative stress in broiler chicks［J］.Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences，2005，29：701～707.

［7］Schell Tc，Lindemann M D KET，Blodgett D J.Effects of feeding Aflatoxin-contaminated diets with and without clay to weanling and growing pigs on performance，liver function，and mineral metabolism［J］.J Anim Sci，1993，71：1209～1218.

To study inhibitory effect of different concentrations selenium content in se-enriched lactobacillus on the growth and toxin-producing effect of Asporgillus，we determined the effect of Aspergillus colony，flavus and toxin production’s growth inhibition rate by Lactobacillus，cultured in MRS liquid medium with 10，15，20，25 μg/mL.The results showed that inhibition ratio of Aspergillus growth effected by se-enriched Lactobacillus cultured in 10～25 μg/mL sodium selenite concentration for 48 h increased by 0.6%～9.4%and inhibition ratio reached to 37.1%for 96 h，inhibition ratio of Aspergillus flavus for 6 h increased by 0.2%～61%compared with lactic acid bacteria group and inhibition ratio reached to 93.6%for 24 h.The growth inhibition rate of aflatoxin B1production increased by 10.3%～56.6%compared with lactic acid bacteria group and inhibition ratio reached to 97.3%for 24 h.The growth inhibition rate of Aspergillus colony，flavus and aflatoxin production B1reached the maximum under the lactic acid bacteria containing 25 μg/mL selenium concentration.These results suggested that se-enriched Lactobacillus presented some inhibition to the growth of Aspergillus flavus coenobium，spore germination and the production of aflatoxin，inhibitory effect was the best when the concentration of Se reached 25 μg/mL.

lactobacillus；aspergillus flavus；growth inhibition ratio；spore；Se-enriched lactobacillus；aflatoxin B1

S816.3

A

1004-3314（2016）12-0019-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161205

國家自然科學基金項目（31101867）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（15JCYBJC30600）