水體中磺胺甲惡唑的存在及其毒性研究機(jī)理

卜兆宇,俞世霖

(1. 揚(yáng)州市建筑設(shè)計(jì)研究院有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225000， 2.河海大學(xué)，江蘇 南京210008)

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水體中磺胺甲惡唑的存在及其毒性研究機(jī)理

卜兆宇1,俞世霖2

(1. 揚(yáng)州市建筑設(shè)計(jì)研究院有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225000， 2.河海大學(xué)，江蘇 南京210008)

通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)太湖水體中的磺胺甲惡唑進(jìn)行研究，探究磺胺甲惡唑的存在濃度，并且結(jié)合靜態(tài)暴露實(shí)驗(yàn)，研究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)的代謝毒性作用，對(duì)水環(huán)境中磺胺甲惡唑的安全濃度設(shè)置具有重要的指導(dǎo)作用。

磺胺甲惡唑；濃度；斑馬魚(yú)；代謝毒性

抗生素類物質(zhì)是目前使用較多的一種藥物，并且在常規(guī)水體中被頻繁檢出，對(duì)生態(tài)環(huán)境與人類健康造成了巨大的威脅[1]。目前，抗生素類物質(zhì)開(kāi)始引起廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注，在現(xiàn)有水環(huán)境中檢出的抗生素類藥物中，磺胺類藥物的檢出頻率最高[2]?；前奉愃幬锸且环N廣泛使用的抗菌藥，由合成氨苯磺胺類結(jié)構(gòu)物質(zhì)衍生而成，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療一類感染性疾病。由于磺胺類藥物的大量使用，水體中磺胺類物質(zhì)的濃度明顯升高。在這類磺胺類藥物中，磺胺甲惡唑的水環(huán)境檢出濃度最高，能達(dá)到200 ng/L。目前針對(duì)中國(guó)太湖流域磺胺甲惡唑的濃度研究相對(duì)較少，并且針對(duì)磺胺甲惡唑進(jìn)行毒性研究的資料更少。因此，針對(duì)水環(huán)境中的磺胺甲惡唑的存在濃度及生物毒性進(jìn)行研究十分必要[3]。

本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)江蘇太湖水環(huán)境中的磺胺甲惡唑濃度進(jìn)行研究，并且采用斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)，綜合研究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)的代謝系統(tǒng)毒性作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)所采用的斑馬魚(yú)為德國(guó)Tubingen品系，均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室提供。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，斑馬魚(yú)的養(yǎng)殖參照Westerfield在1995年所發(fā)表的斑馬魚(yú)飼養(yǎng)方法：斑馬魚(yú)養(yǎng)殖照明條件為14 h光照、1 h黑暗交替進(jìn)行；養(yǎng)殖水溫控制在28.5±1℃；水體每隔3 h進(jìn)行曝氣充氧，保證水體中的溶解氧量為5 mg/L以上；pH控制在7.02～7.25；總硬度采用德國(guó)度計(jì)，控制在8.02～8.15[4]?？股鼗前芳讗哼?符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))購(gòu)買于中國(guó)藥品檢定所。在靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)中，斑馬魚(yú)的培養(yǎng)液參照Z(yǔ)ebra fish Book進(jìn)行配置[5]。其中，磺胺甲惡唑采用助溶劑DMSO助溶(終濃度<0.1%)，斑馬魚(yú)的代謝酶(GST、MDA、CAT、SOD)采用代謝酶試劑盒進(jìn)行測(cè)定，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1水體中磺胺甲惡唑的檢測(cè)方法

本次實(shí)驗(yàn)針對(duì)江蘇太湖水體中的磺胺甲惡唑進(jìn)行檢測(cè)，采用定位檢測(cè)的方法，針對(duì)太湖東西南北側(cè)設(shè)定4個(gè)檢測(cè)點(diǎn)進(jìn)行取樣檢測(cè)，所取水樣在48 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)檢測(cè)點(diǎn)采取三個(gè)平行樣，每個(gè)樣品進(jìn)行三次檢測(cè)，保證檢測(cè)精度。

實(shí)驗(yàn)采用Waters公司Oasis HLB 6cc (500 mg, Waters, USA)對(duì)水樣進(jìn)行萃取濃縮，并且采用安捷倫公司超高清液相色譜儀(1260)與三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(6460)對(duì)濃縮液中的磺胺甲惡唑進(jìn)行檢測(cè)，具體濃縮與檢測(cè)步驟參照Yan等人的方法[6]，檢測(cè)回收率為84±2.1%，檢測(cè)限為1.6 ng/L?；前芳讗哼驒z測(cè)條件如表1所示。

表1　磺胺甲惡唑檢測(cè)條件

1.2.2靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

考慮到大濃度下的暴露實(shí)驗(yàn)會(huì)放大生物毒性效應(yīng)便于有毒物質(zhì)的研究，在本次針對(duì)磺胺甲惡唑的靜態(tài)染毒實(shí)驗(yàn)中，按照等比例區(qū)間進(jìn)行濃度設(shè)置，在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置五組濃度梯度與一組空白對(duì)照，即0、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、500 μg/L、1 mg/L。實(shí)驗(yàn)中，在相同暴露條件下的特定檢測(cè)時(shí)間段對(duì)6組中的斑馬魚(yú)酶活性進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)研究，暴露期限為7 d，特定檢測(cè)時(shí)間為暴露1 d后、暴露3 d后、暴露7 d后。

1.2.3代謝酶活性測(cè)定

本次實(shí)驗(yàn)酶活性均采用南京建成生物工程研究所酶活性試劑盒進(jìn)行測(cè)定，具體操作參照試劑盒說(shuō)明。其中，GST酶測(cè)定參照Habig的方法、MDA含量測(cè)定參照硫代巴比妥酸的方法、CAT酶測(cè)定參照Gott的方法、SOD酶測(cè)定參照Marklund的方法[7]。同時(shí)，采用綜合酶活性統(tǒng)計(jì)法對(duì)四種酶活性進(jìn)行加權(quán)統(tǒng)計(jì)，便于綜合反應(yīng)磺胺甲惡唑的生物毒性作用，具體統(tǒng)計(jì)步驟參照Beliaeff的方法[8]。

1.2.4數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用生物毒理學(xué)專用分析軟件Graph pad Prism5.0進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)形式，數(shù)據(jù)用單尾檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，p<0.05為顯著差異。

2　結(jié)果與討論

2.1水體中磺胺甲惡唑的存在濃度

為了檢測(cè)太湖水中磺胺甲惡唑的存在濃度，我們?cè)谔|(E)西(W)南(S)北(N)四個(gè)方向進(jìn)行取樣，對(duì)水樣中的磺胺甲惡唑進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1所示。

圖1　不同取樣點(diǎn)處磺胺甲惡唑的濃度

由圖1可以看出:在太湖四個(gè)方向水樣中的磺胺甲惡唑濃度各有差異。其中太湖西部水樣中的磺胺甲惡唑的平均濃度為41 ng/L，最高檢出濃度達(dá)到了最高達(dá)到了45 ng/L;太湖北側(cè)水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為24 ng/L，最高檢出濃度達(dá)到了27 ng/L;太湖東側(cè)水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為21 ng/L，最高檢出濃度達(dá)到了24 ng/L。檢出濃度最低的是太湖南側(cè)水樣，磺胺甲惡唑平均濃度為13 ng/L，最高檢出濃度達(dá)到了16 ng/L。

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在太湖西側(cè)，工業(yè)企業(yè)眾多，且均有制藥廠分布，大量的生產(chǎn)廢水經(jīng)內(nèi)部小型污水處理裝置收集處理后直接排入大湖中。由于常規(guī)處理工藝并不能對(duì)這類藥物進(jìn)行完全去除，因此造成了西部水體中的磺胺甲惡唑濃度較高。同時(shí)，采樣點(diǎn)西部多為水灣地區(qū)，由于水灣的封閉性作用，并不能促進(jìn)水體進(jìn)行交換，從而導(dǎo)致水體中的磺胺甲惡唑累積，最終導(dǎo)致該處的磺胺甲惡唑濃度較高。

在太湖北部和東部，雖然工業(yè)企業(yè)較多，并且水灣較多。由于太湖北部有大量的水生植物生態(tài)修復(fù)區(qū)，水體中的水生植物有著發(fā)達(dá)的根系，會(huì)對(duì)水體中的抗生素進(jìn)行吸收，起到水體凈化作用，因此北部水體中磺胺甲惡唑的濃度比西部低。同時(shí)在太湖的東部地區(qū)，為了保證太湖水源質(zhì)量，政府在太湖東部進(jìn)行了引長(zhǎng)江水進(jìn)太湖水的工程，長(zhǎng)江具有極強(qiáng)的水體流動(dòng)性與交換性，大量的長(zhǎng)江水引入會(huì)促進(jìn)太湖東部地區(qū)水體發(fā)生交換，最終提高了東部的水質(zhì)，降低了該地區(qū)的磺胺甲惡唑的濃度。

太湖南部，工藝企業(yè)較少，且與東部、西部、北部工業(yè)區(qū)相距較遠(yuǎn)，水體的流動(dòng)性與稀釋性導(dǎo)致此處的磺胺甲惡唑濃度相比其他三個(gè)地區(qū)最低，并且此處岸線平滑、少水灣、污染物累積作用較弱，因此該處的水質(zhì)相對(duì)較好。

通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，太湖水體中的磺胺甲惡唑濃度最高出現(xiàn)在太湖西側(cè)，最高達(dá)到了45 ng/L。同時(shí)，生態(tài)修復(fù)區(qū)的建立與引水工程的實(shí)施會(huì)對(duì)水體中的污染物進(jìn)行凈化，保證水體的優(yōu)良水質(zhì)。

2.2磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)單一代謝酶活性的影響

為研究磺胺甲惡唑?qū)λw生物的代謝毒性作用，采用斑馬魚(yú)作為模式動(dòng)物，研究靜態(tài)暴露下的磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)的代謝酶的毒性作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，隨著暴露濃度與暴露的增加，斑馬魚(yú)體內(nèi)的四種代謝酶活性均發(fā)生額了不同變化。GST酶產(chǎn)生了先上升后下降的趨勢(shì)并且在第3天酶活性達(dá)到最大值；MDA含量也產(chǎn)生了先上升后下降的趨勢(shì)并且在第3天酶活性達(dá)到最大值；CAT酶活性隨著暴露時(shí)間與濃度的升高不斷下降，并且在第7天達(dá)到最低值；SOD酶活性與GST、MDA酶趨勢(shì)相同，并且在第3天酶活性達(dá)到最大值。

GST酶活性在生物代謝系統(tǒng)去除生物體內(nèi)具有毒性、致突變、致癌性的親電子時(shí)有著不可或缺的作用[9]。GST酶可以促進(jìn)生物體內(nèi)釋放三肽谷胱甘肽，并且促進(jìn)三肽谷胱甘肽與以內(nèi)的外源性物質(zhì)相互結(jié)合，最終促進(jìn)這類物質(zhì)排出生物體內(nèi)。由圖2可以看出，在暴露實(shí)驗(yàn)的第3天，GST酶達(dá)到最大值，隨后濃度降低，這可能是因?yàn)樵诒┞兜?天磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)代謝酶進(jìn)行誘導(dǎo)，而在第7天斑馬魚(yú)體內(nèi)適應(yīng)了磺胺甲惡唑的代謝毒性。

MDA含量通常用來(lái)判斷體內(nèi)外源性物質(zhì)對(duì)代謝系統(tǒng)的毒性作用，其可直接反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞膜受到的毒性作用[10]。由圖2可以看出，MDA酶在第3天達(dá)到最大值，可能是因?yàn)樵诒┞兜谌旎前芳讗哼驅(qū)Π唏R魚(yú)的代謝毒性作用最大。而在暴露第7天MDA的含量降低，回歸第一天的含量，可能是因?yàn)榘唏R魚(yú)體內(nèi)的代謝酶對(duì)磺胺甲惡唑產(chǎn)生了代謝作用，最終降低了磺胺甲惡唑?qū)?xì)胞的代謝作用。

CAT酶和SOD酶是同階段的代謝酶，對(duì)外源性物質(zhì)在斑馬魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生的自由基有著重要的去除作用，并且兩者之間具有重要的聯(lián)系[11-12]。當(dāng)斑馬魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生自由基時(shí)，SOD酶會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)的超氧化物陰離子自由基團(tuán)產(chǎn)生歧化作用，轉(zhuǎn)化為氧化作用相對(duì)較低的過(guò)氧化氫。隨后，CAT酶會(huì)對(duì)過(guò)氧化氫發(fā)生作用，促進(jìn)體內(nèi)的過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水，最終實(shí)現(xiàn)代謝系統(tǒng)內(nèi)的自由基的去除。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：在暴露的第3天斑馬魚(yú)體內(nèi)的SOD濃度明顯上升，這是由于體內(nèi)的自由基濃度上升對(duì)SOD酶產(chǎn)生了誘導(dǎo)作用，而在第7天SOD濃度下降，這是因?yàn)轶w內(nèi)自由基被逐漸轉(zhuǎn)化，濃度降低。而CAT酶一直處于降低的狀態(tài)，這可能因?yàn)榘唏R魚(yú)體內(nèi)的過(guò)氧化氫濃度較高，CAT酶負(fù)荷過(guò)大，產(chǎn)生了抑制作用。

圖2　磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)單一酶活性作用

2.3磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)綜合代謝酶活性的影響

圖3　磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)綜合酶活性作用

為綜合探究磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)代謝系統(tǒng)的綜合毒性作用，對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)的單一代謝酶活性結(jié)果進(jìn)行了綜合統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可以看出：在暴露的7 d內(nèi)，磺胺甲惡唑?qū)Π唏R魚(yú)的代謝毒性作用在暴露第3天最為強(qiáng)烈，且隨著暴露的濃度增加，綜合酶活性指標(biāo)逐漸增加?；前芳讗哼?qū)Π唏R魚(yú)體內(nèi)代謝系統(tǒng)的生物毒性作用隨著暴露濃度的增加而增加，并且磺胺甲惡唑的代謝毒性在染毒第3天作用最為強(qiáng)烈，應(yīng)該引起重視。

3　結(jié)論

(1)在太湖水樣中，太湖西部水樣中的磺胺甲惡唑濃度最高，太湖南部水樣中的磺胺甲惡唑濃度最低，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)生態(tài)修復(fù)工程與引水工程會(huì)降低水體中磺胺甲惡唑的濃度。

(2)通過(guò)代謝酶活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)磺胺甲惡唑會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)的代謝系統(tǒng)產(chǎn)生毒性作用，因此值得后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。

(3)通過(guò)綜合酶活性分析發(fā)現(xiàn)，磺胺甲惡唑的代謝毒性作用在暴露的第3天作用最為強(qiáng)烈，并且隨著暴露濃度的上升，綜合活性指標(biāo)逐漸變大。因此，磺胺甲惡唑的代謝毒性作用應(yīng)當(dāng)受到研究者重視。

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Occurrence of sulfamethoxazole in aquatic environment and its toxicity on zebrafish

BO Zhao-yu1,YU Shi-lin2

(1.YangzhouArchitecturalDesign&ResearchInstituteCo.,Ltd,Yangzhou225000,China;2.HohaiUniversity,Nanjing210008,China)

This experiment studied the sulfamethoxazole concentration and the metabolic toxicity of sulfamethoxazole on zebrafish in Taihu.The results of this study would provide a better reference for safe concentration setting towards sulfamethoxazole.

sulfamethoxazole;concentration;zebrafish;metabolic toxicity

2016-04-07

卜兆宇(1982—)，江蘇揚(yáng)州人，碩士，工程師。

1674-7046(2016)05-0078-05

10.14140/j.cnki.hncjxb.2016.05.014

X171. 1

A