牙體充填材料表面粗糙度對常見口腔鏈球菌黏附力的影響

鄭賽男 蔣麗 張雷 郝麗英 葉露 李偉

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學），成都 610041

牙體充填材料表面粗糙度對常見口腔鏈球菌黏附力的影響

鄭賽男 蔣麗 張雷 郝麗英 葉露 李偉

口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學），成都 610041

目的 采用原子力顯微鏡（AFM）檢測常見口腔鏈球菌屬與不同表面粗糙度的光固化復合樹脂及玻璃離子水門汀（GIC）之間的黏附力。方法 將光固化復合樹脂和GIC樣本表面梯度拋光，根據(jù)最終表面粗糙度不同分為300、200、100和10 nm組，使用AFM觀察其表面形貌。采用先鋒菌（血鏈球菌、緩癥鏈球菌）和致齲菌（變異鏈球菌、表兄鏈球菌）制作細菌改性探針，通過AFM獲得力—距曲線測量細菌與樹脂和GIC樣本表面的黏附力。對材料表面粗糙度測量值進行方差分析，細菌黏附力進行Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，同時采用Dunn’s進行組間兩兩比較，并對表面粗糙度與細菌黏附力進行相關性分析。結果 隨材料表面粗糙度增加，細菌的黏附力增大，4種細菌的黏附力均在300 nm的材料表面達到最大值；在10和300 nm組的GIC表面，變異鏈球菌的黏附力由0.578 nN增加到2.876 nN。4種細菌在樹脂表面的黏附力略大于GIC，先鋒菌的黏附力略大于致齲菌，組間差異均在200和300 nm組時較明顯。結論 材料表面粗糙度對細菌黏附力的影響較大，二者有明顯的相關性；GIC對細菌的黏附性較復合樹脂低；材料表面粗糙度對致齲菌的影響小于先鋒菌。

原子力顯微鏡； 黏附力； 充填材料； 表面粗糙度； 口腔鏈球菌屬

齲病是在以細菌為主的多因素作用下，牙體硬組織發(fā)生慢性進行性破壞的疾病[1]。齲病經充填治療后，細菌在牙體和充填材料交界處滯留，易引起微滲漏，發(fā)生繼發(fā)齲，是導致齲病治療失敗的主要原因之一[2]。菌斑生物膜是繼發(fā)齲的始動因素，細菌對牙齒和充填材料表面的黏附是菌斑生物膜形成的關鍵步驟。材料表面的物理特性，如粗糙度、表面電荷和疏水性等均能影響細菌的定植和黏附，其中粗糙度對細菌黏附的影響最大。近年來，人們對菌斑生物膜的形成研究較多，但對細菌黏附的初始階段和充填材料的黏附機制研究較少。原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）因具有原子級的分辨率已被廣泛用于測量材料表面的原子級形貌，通過力—距曲線分析能夠直接定量獲得微生物與材料表面之間及微生物之間的相互作用力，靈敏度高，可重復性好，是一種理想的探測細菌與生物材料之間基本相互作用力的方法。目前AFM已用于口腔細菌黏附力的研究，但利用AFM定量研究致齲菌對充填材料表面黏附定植的力學機制還較少。

本實驗采用AFM觀察不同粗糙度的復合樹脂和玻璃離子水門?。╣lass ionomer cement，GIC）表面的微觀形貌；并選取與齲壞密切相關的先鋒菌（血鏈球菌、緩癥鏈球菌）和致齲菌（變異鏈球菌、表兄鏈球菌）各兩種，通過黏附緩沖液模擬口內環(huán)境，利用AFM原位測量細菌對材料表面的黏附力，考察細菌在兩種材料表面黏附力的差異，比較先鋒菌和致齲菌對不同材料表面黏附力的大小。通過分析細菌對充填材料表面黏附的微觀力學機制，為臨床牙體充填材料表面形貌的處理和材料的選擇提供理論依據(jù)，對減少口腔細菌的黏附和預防繼發(fā)齲提供指導意義。

1 材料和方法

1.1 樣本的制備

采用模具將Z250型光固化復合樹脂（3M公司，美國）和IX型GIC（而至富士公司，日本）均制備成直徑1 cm、厚2 mm的圓片形試件，調磨使其上下平行，隨機分為4組，每組3個試件。在拋光機（Strue-Ts公司，丹麥）上用250、1 000、2 000、3 000目耐水砂紙（勇士公司，德國）在流水冷卻下由粗到細將試件進行梯度打磨，形成表面粗糙度最終為300、200、100和10 nm的表面。打磨結束后，去離子水沖洗30 s，超聲清洗10 min，自然干燥，采用SPM-9600 型AFM（島津公司，日本）測量兩種材料的表面粗糙度Ra值，測量條件為：相位模式、掃描頻率1 Hz，掃描面積20 μm×20 μm。每個樣本按單純隨機法選取3個位點觀察材料的表面形貌，得到圖像后使用AFM內置的VectorScan 3. 31測量分析軟件構建樣本表面三維模型，應用Surface組件分析材料表面的Ra值，超聲清洗10 min后，自然干燥，備用。

1.2 細菌培養(yǎng)和懸液制備

將血鏈球菌ATCC 10556、緩癥鏈球菌ATCC 700610、變異鏈球菌ATCC 25175以及表兄鏈球菌ATCC 33478分別加入10 mL腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（OXOID公司，英國）中，37 ℃下兼性厭氧（70% N2+20%CO2+10%H2）環(huán)境中，增菌培養(yǎng)12 h，離心（1 500 g，15 min）后收集細菌沉淀團塊，PBS洗2次以去除殘余培養(yǎng)基，最后加入1 mL PBS重懸，以利于增加細菌與探針的靜電作用。在冰水浴中以8 W功率超聲振蕩3次，每次10 s，利用超聲分散細菌團塊并斷裂鏈狀結構，形成細菌懸液。

1.3 細菌探針的制備

本實驗采用AFM無尖探針，型號為CSC37/tipless/ Cr-Au（μ-Masch公司，愛沙尼亞）。光學顯微鏡下檢查探針表面是否有碎屑等雜質，合格后在紫外線下消毒5 min，將探針固定在自制顯微操作儀上，將探針的懸臂梁尖端2/3沒入0.01%聚左旋賴氨酸（Sigma-Aldrich公司，英國）中3 min，使得探針表面帶正電荷，取出自然干燥2 min，然后浸入剛制備的細菌懸液中5 min，將細菌固定在懸臂梁上，制備好的探針立即用于測量黏附力。

1.4 力—距曲線的測量

將制備好的細菌探針加載于AFM的探針架上，并將待測樣本用防水膠帶固定于液體池底部，AFM測量條件為：室溫，黏附緩沖液中，接觸模式、掃描頻率1 Hz，掃描范圍2 μm×2 μm，觸發(fā)器閾值1 V。在試件材料的表面隨機選取3個位點，每次測量100次，非同日培養(yǎng)的細菌重復2次。根據(jù)掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）圖片及曲線抖動情況判斷細菌脫落程度，收集所有的有效數(shù)據(jù)，根據(jù)虎克定律F=Ksp×D（F為細菌與材料表面的黏附力；Ksp為AFM探針的彈性系數(shù)，可通過熱力學法算出；D為AFM探針的彈性形變），將懸臂梁的彈性形變（nm）換算為黏附力（nN）。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SigmaPlot 12.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。因為材料表面粗糙度為正態(tài)分布，故統(tǒng)計推斷采用方差分析（ANOVA），統(tǒng)計描述采用平均值±標準差；而黏附力數(shù)據(jù)屬于偏態(tài)分布，故統(tǒng)計推斷采用Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗，并利用Dunn’s進行組間兩兩比較，統(tǒng)計描述采用中位數(shù)和四分位數(shù)；對材料表面粗糙度與細菌黏附力進行相關性分析；檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 材料的表面形貌

不同粗糙度的復合樹脂和GIC的AFM表面形貌圖見圖1。根據(jù)Surface組件分析得到的材料表面Ra值見表1，據(jù)Ra值將每種材料樣本分為4個梯度，即10、100、200和300 nm，經統(tǒng)計學分析，每組樣本之間Ra值的差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。由圖1可見，兩種材料在粗糙度為10和100 nm時，樣本表面較平滑，有輕微的劃痕和小的裂縫；200和300 nm時，樣本表面的劃痕和裂縫明顯，甚至有孔洞樣結構，表面粗糙度明顯增加。

圖 1 復合樹脂和GIC的表面形貌圖 AFM × 750 000Fig 1 Surface topography images of GIC and composite resin AFM × 750 000

表 1 不同表面粗糙度的復合樹脂和GIC的Ra值Tab 1 Ra values of different roughness of composite resin and GIC ?

2.2 細菌黏附力

血鏈球菌在樹脂表面的力—距曲線見圖2。從細菌的后退曲線（圖2藍線所示）可明顯看出4種不同表面粗糙度對該菌力—距曲線的影響。在黏附力測量過程中，被覆細菌的探針不斷接近材料表面，在距離表面200 nm時受到排斥力并呈指數(shù)增加（圖2紅線所示）。當探針離開材料表面時，由于細菌與材料表面具有黏附力，使得探針離開時懸臂梁向樣本表面彎曲，探針必須離開一定距離后，細菌與樣本表面才能分離，細菌與材料間的黏附結合鍵斷裂，此時懸臂梁彈性形變達最大值，即最大黏附力主峰值；然后隨探針遠離材料表面，出現(xiàn)很多小的黏附力副峰，即為典型的細菌黏附力—距曲線。

圖 2 血鏈球菌在不同粗糙度樹脂表面的力—距曲線Fig 2 Example of force-distance curve between Streptococcus sanguis and composite resin surface with different roughness

細菌黏附力的定量分析結果見圖3，統(tǒng)計結果表明，4種細菌對充填材料表面的黏附力均表現(xiàn)出相似的趨勢，隨著表面粗糙度的增加，細菌在材料表面的黏附力均有增加。在樹脂表面，血鏈球菌的黏附力由1.051 nN增加到4.295 nN，變異鏈球菌由0.336 nN增加到4.026 nN；在GIC表面，變異鏈球菌的黏附力由0.578 nN增加到2.876 nN。就同種材料而言，先鋒菌的黏附力略大于致齲菌，統(tǒng)計結果表明，在200、300 nm兩種粗糙度下，先鋒菌和致齲菌的黏附力差異明顯（P<0.05），在10、100 nm時差異較?。≒>0.05）。對比兩種材料表面的細菌黏附力，在200、300 nm時，4種細菌在樹脂表面的黏附力大于GIC（P<0.05），粗糙度較小時黏附力的差異較小或無明顯差異。統(tǒng)計分析表明，除了緩癥鏈球菌在兩種材料表面和表兄鏈球菌在樹脂表面的黏附力與材料表面粗糙度相關性無統(tǒng)計學意義之外（P>0.05），其余細菌的黏附力與材料表面粗糙度都有明顯的線性關系（P<0.05），其中表兄鏈球菌黏附力與GIC表面粗糙度的線性相關關系見圖4。

圖 3 4種細菌在不同粗糙度復合樹脂和GIC表面的黏附力Fig 3 Adhesion forces of four bacteria on composite resin and GIC surface with different roughness

圖 4 表兄鏈球菌黏附力與GIC表面粗糙度呈線性相關Fig 4 Linear correlation between Streptococcus sobrinus and GIC surface with different roughness

3 討論

3.1 AFM用于測量細菌黏附力的優(yōu)勢

分析材料表面細菌的黏附量是研究細菌對材料表面黏附的傳統(tǒng)方法，包括細菌計數(shù)、SEM和熒光顯微鏡檢測等，但這些方法受外界影響因素較多，準確性較差，且僅限于對材料表面細菌的定量和定性檢測，并未涉及細菌的黏附行為和微觀力學機制。1986年Binnig等[3]發(fā)明了AFM，可用于檢測材料表面的原子級形貌、分子間及分子內作用力，并能測量材料表面納米機械性質，如表面力、黏附能和黏彈性等。本實驗采用AFM測量細菌對材料表面的黏附力有以下優(yōu)勢。1）分組明確。利用AFM采集到的樣本表面圖像為表面的三維數(shù)據(jù)，可構建三維立體圖像，精確分析材料表面的粗糙度，本實驗通過材料表面Ra值將樣本進行嚴格分組，確保組間的差異性和實驗的精確性；用SEM和表面輪廓儀等傳統(tǒng)方法觀察材料表面形貌時會損壞樣本表面，而AFM進行表面形貌觀察時，對樣本表面毫無損壞，具有較大的優(yōu)勢。2）靈敏度高。AFM用于檢測細菌黏附力時靈敏度高達pN（pN=10-12N）數(shù)量級，測量范圍很大（10 pN到106pN），可在原子級尺度上直接檢測微生物對材料表面的黏附力[4]。本實驗主要利用AFM測量多個細菌與材料表面之間的黏附力，黏附力均在10 nN以內，除此之外，AFM還可用于測量單細胞與材料表面的黏附力及細菌間的黏附力，將細菌黏附機制的研究推進到了分子生物水平。3）數(shù)據(jù)精確度高。本實驗先將細菌固定在探針表面，探針表面的細菌與材料相接觸，AFM將探針表面細菌與材料表面接觸時懸臂梁的彈性形變轉化為力—距曲線，通過分析力—距曲線能夠計算出微生物與固體材料表面之間以及微生物之間的作用力[5]。4）可實現(xiàn)原位測量。通過調節(jié)黏附緩沖液的成分、溫度和pH值，可以最大程度地模擬生物自然生長環(huán)境，實現(xiàn)原位測量，并且探針的作用力不會破壞細菌表面結構。

3.2 材料表面粗糙度對細菌黏附的影響

粗糙的表面能夠促進細菌的黏附，粗糙度對黏附力的影響大于材料表面能和疏水性。在本實驗中，4種細菌都表現(xiàn)出了相似的趨勢，細菌對兩種材料表面的黏附力均與粗糙度呈正相關，材料表面粗糙度對致齲菌的影響小于先鋒菌。Mei等[6]實驗結果表明，細菌對材料表面的黏附力隨材料粗糙度的增加而相應變大；Taylor等[7]的研究也發(fā)現(xiàn)，粗糙度輕微增加就會引起細菌黏附力大幅度變大。在黏附力測量過程中，探針對細菌表面施加了垂直向下的壓力，柔軟的細菌表面會發(fā)生形變，形變的部分會陷入表面輪廓中，使細菌的有效接觸面積明顯增大，細菌表面黏附分子的接觸位點明顯增加，黏附力相應增加。粗糙表面的表面積及容積會顯著增加，故能為細菌提供更大的黏附面積，同時，粗糙表面凹陷深度的增加也能夠為細菌提供庇護作用，為細菌的生存提供空間，從而促進表面細菌的黏附。細菌更容易黏附在凹痕與菌細胞直徑相近的材料表面。Verran 等[8]實驗結果表明，當樣本表面的凹痕比菌細胞大時，細菌的黏附力反而減少，這可能是由于探針的形變有限，當凹痕垂直高度過大時，部分細菌不能接觸到，就不能提供更大的有效接觸面積。故在某些實驗中會出現(xiàn)一個粗糙度閾值（Ra=200 nm），當材料表面粗糙度超過閾值時，由于材料表面的有效接觸面積變小，細菌的黏附力反而會下降。Wang 等[9]利用磷酸將釉質處理成不同的粗糙度表面，實驗結果表明在200 nm時細菌對釉質的黏附力達到最大值，在300 nm時細菌的黏附力反而下降。Quirynen 等[10]的實驗發(fā)現(xiàn)，鈦表面也存在該閾值，當鈦表面的粗糙度超過這一閾值時，細菌的黏附力不再繼續(xù)增加。本實驗未出現(xiàn)閾值，可能與材料表面的劃痕直徑并未超過細菌直徑有關。與此相反，也有實驗[11]發(fā)現(xiàn)材料表面粗糙度必須大于200 nm才會對細菌的黏附和定植造成重要影響；當材料表面粗糙度低于200 nm時，細菌的黏附量不會明顯減少[12]，這可能是因為粗糙度較大的表面凸起能夠明顯減小表面液體流動產生的水平剪切力，可以形成有利于生物膜生長的靜態(tài)水力學環(huán)境，幫助細菌抵抗外界的清除力量，促進生物膜在粗糙表面快速生長和成熟。

3.3 先鋒菌和致齲菌黏附力的差異

本實驗選取了先鋒菌和致齲菌各兩種，總體來說，對兩種材料而言，先鋒菌的黏附力要大于致齲菌，特別是在200 nm和300 nm時差異更加明顯，Wang等[9]的實驗也表明先鋒菌在各種材料表面的黏附力均要大于致齲菌。牙菌斑生物膜的形成是十分復雜的動態(tài)過程，大致可分為3個階段：獲得性薄膜的形成、細菌的黏附和聚集及菌斑的成熟。先鋒菌最先定植在牙體和材料表面，致齲菌不直接黏附在牙體和材料表面，而是通過與已經定植在表面的先鋒菌發(fā)生共聚，形成分層結構，繼而發(fā)育為成熟的生物膜，故表面粗糙度對致齲菌的影響小于先鋒菌。細菌對牙面和材料表面的黏附是菌斑生物膜形成的關鍵步驟，本實驗中的4種細菌在菌斑生物膜的形成過程中都有重要作用。先鋒菌表面大量的黏附素能與牙面和材料表面唾液薄膜中的受體結合，并為后續(xù)致齲菌的黏附提供受體，有利于菌斑生物膜的生長[13]，因此，先鋒菌必須要有更強的黏附力，才能抵抗口腔內各種剪切力，使得后續(xù)細菌能牢固黏附在牙面和材料表面，在菌斑生物膜的形成過程中起到重要的橋梁作用。致齲菌與先鋒菌產生共聚后，能夠分泌某些代謝物，使得先鋒菌數(shù)量減少，成為菌斑生物膜中的主要細菌，致齲菌通過代謝作用能產生多種酸性物質，導致周圍環(huán)境pH值降低，促進齲病的發(fā)生[14]。

3.4 復合樹脂和GIC表面細菌黏附力的差異

在本實驗中，口腔細菌對樹脂的黏附力略大于GIC，在粗糙度較大的時候差異較明顯。研究[15]發(fā)現(xiàn)，GIC表面的變異鏈球菌生物膜量明顯小于樹脂表面，GIC能抑制細菌的生長和菌斑生物膜的形成。復合樹脂和GIC是臨床上常用的窩洞充填材料，同時，繼發(fā)齲是引起充填失敗的主要原因之一。GIC是一種具有抗菌作用的充填材料，與牙本質-牙髓復合體有良好的生物相容性，其抗菌性主要來源于起始pH值較低和材料中氟的持續(xù)釋放，氟能夠促進牙體再礦化，并能在酸性環(huán)境中抑制致齲菌酸性代謝物的產生，影響致齲菌的代謝和生長[15]。此外，GIC還能與牙本質和釉質進行化學黏附和離子交換[16]，這些行為都能減少口腔細菌的黏附。本實驗選用的富士IX型GIC中還含有鍶元素，該元素能促進牙體組織再礦化，與氟具有協(xié)同抗菌作用[17]。目前，商業(yè)化的樹脂主要是由疏水性的基質和填料組成，含有微量（例如親水性的聚氧化乙烯）或者不含抗菌成分，因此商業(yè)化樹脂都沒有抗菌性能。當樹脂固化不完全時，其中的二甲基丙烯酸乙二醇酯和二甲基丙烯酸三甘醇酯還能促進細菌的生長，如溶血性鏈球菌、表兄鏈球菌和乳酸桿菌[18]。葡糖基轉移酶（glucosyltransferase，GTF）在細菌代謝中有重要作用，能將蔗糖轉化為葡聚糖，促進細菌的黏附[19]。樹脂能提高細菌GTF的活性，三甘醇在生物膜形成過程中能調節(jié)GTF的表達。因此，有研究者試圖通過抗菌材料改性獲得生物性能和機械性能雙優(yōu)的材料。如Saku等[16]通過在普通樹脂中添加預燒結的玻璃離子微顆粒，使得樹脂具有釋放氟的功能，與普通樹脂相比，這種改良樹脂在體內外實驗的抗菌性能均較好。

本實驗結果表明，牙體充填材料表面粗糙度是影響口腔細菌黏附定植的一個重要因素。為了減少細菌的黏附量和生物膜的形成，降低繼發(fā)齲的發(fā)生，臨床充填體應做到盡可能地拋光；GIC的抗菌性能優(yōu)于樹脂，可用于指導牙體充填材料的改性。此外，人體口腔環(huán)境復雜，唾液[6]、溫度和pH值等都會影響細菌的黏附及生物膜的形成，因此，需要進一步考慮生理環(huán)境對口腔細菌和充填材料之間黏附的影響，從而更好地控制細菌的黏附和繼發(fā)齲的發(fā)生。

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（本文編輯 吳愛華）

Influence of surface roughness on oral streptococcal adhesion forces to dental filling materials

Zheng Sainan, Jiang Li, Zhang Lei, Hao Liying, Ye Lu, Li Wei.
(State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31200720); The Ph.D. Programs Foundation of Ministry of Education of China (20120181120009); Sichuan Science and Technology Project (2016FZ0069). Correspondence: Li Wei, E-mail: leewei@scu.edu.cn.

Objective This study is to determine the common oral streptococcal adhesion forces by using composite resin and glass ionomer cement (GIC) with different degrees of surface roughness via atomic force microscopy (AFM) analysis. The influence of surface roughness on bacterial adhesion force is also discussed. Methods Polishing and grinding were applied to obtain 300, 200, 100, and 10 nm surfaces of light-cured composite resin and GIC samples. Surface topography was assessed by AFM analysis. Initial colonizers (Streptococcus sanguinis and Streptococcus mitis) and cariogenic bacterial strains (Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus) were used to obtain bacteria-modified AFM probes. The force-distance curves were also measured by AFM analysis to determine the adhesion forces of bacteria on the surfaces of the composite resin and GIC. Material surface roughness was analyzed using ANOVA, and adhesion forces were subjected to nonparametric analysis (Kruskal-Wallis test). Comparison among groups was performed by Dunn’s test. Material surface roughness and bacterial adhesion forces were subjected to correlation analysis. Results Bacterial adhesion forces increased with increasing material roughness. The adhesion forces of the four bacterial species reached the maximum on the material surface of 300 nm. The adhesion force of Streptococcus mutans increased from 0.578 nN to 2.876 nN on GIC surfaces with 10 and 300 nm roughness. The adhesion forces of the four species on the surface of the composite resin were stronger than that of GIC. The initial colonizers exhibited stronger adhesionforces to different materials than the cariogenic strains. Intergroup differences were evident on the 200 and 300 nm material surfaces. Conclusion The surface roughness of the material significantly affected the bacterial adhesion forces, and a significant linear correlation existed between both factors. The bacterial adhesion forces of the GIC were lower than that of the composite resin. Furthermore, surface roughness exhibited less influence on the cariogenic strains than that on the initial colonizers.

atomic force microscope; adhesion force; filling material; surface roughness; oral streptococcal

R 780.2

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.003

2016-03-05；

2016-06-13

國家自然科學基金（31200720）；教育部博士學科點新教師基金（20120181120009）；四川省科技計劃項目（2016FZ0069）

鄭賽男，碩士，E-mail：zhsnmail@163.com

李偉，教授，博士，E-mail：leewei@scu.edu.cn