高效液相色譜法測定痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的含量

代能捷，楊全偉，程　璐，黃文濤

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢　430022)

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高效液相色譜法測定痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的含量

代能捷*，楊全偉，程璐，黃文濤#

(武漢市第一醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430022)

目的：建立測定痛風(fēng)顆粒中的落新婦苷含量的方法。方法：采用Waters e2685 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)，流動相為甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)，檢測波長為290 nm，流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μl。結(jié)果：落新婦苷進樣量在0.099 8～0.998 0 μg(r=0.999 9)范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好；精密度試驗、重復(fù)性試驗、穩(wěn)定性試驗的RSD均≤3.00%；平均加樣回收率為101.54%，RSD=0.54%(n=6)。結(jié)論：本研究測定方法準確、穩(wěn)定、簡便，可用于痛風(fēng)顆粒的質(zhì)量控制。

痛風(fēng)顆粒； 落新婦苷； 高效液相色譜法

痛風(fēng)顆粒為武漢市第一醫(yī)院應(yīng)用多年的具有良好降尿酸作用的臨床經(jīng)驗方。痛風(fēng)顆粒由土茯苓、白英、薏苡仁、徐長卿等11味中藥制成，具有淡滲利濕、健脾祛濁、通脈補腎的功能，主治由高尿酸血癥引起的痛風(fēng)。土茯苓為方中君藥，查閱文獻可知土茯苓中主要有效成分為落新婦苷，是二氫黃酮類化合物[1-3]。本研究建立了高效液相色譜法測定痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的方法，以期為該制劑的質(zhì)量控制提供有效依據(jù)。

1　材料

1.1儀器與設(shè)備

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2489型紫外檢測器(美國沃特斯公司)；百萬分之一天平[賽多利斯(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2藥品與試劑

落新婦苷對照品(中國食品藥品檢定院，批號：111798-201504)；痛風(fēng)顆粒(武漢市第一醫(yī)院制劑中心，批號：20150614)；甲醇、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

Waters e2685 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)；檢測波長為290 nm；流速為1.0 ml/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μl。

2.2溶液的配制

2.2.1對照品溶液：精密稱定4.990 0 mg落新婦苷對照品，加入50%甲醇溶液溶解并稀釋至50 ml，搖勻，即得對照品溶液，溶液濃度為0.099 80 mg/ml。

2.2.2供試品溶液：精密稱定樣品0.50 g，加入50%甲醇溶液50 ml，稱質(zhì)量，超聲溶解30 min，放冷，稱質(zhì)量，補液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3陰性對照溶液：取不含土茯苓的樣品，按照“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3檢測波長的選擇

取“2.2.1”項下對照品溶液，采用紫外分光光度法進行全波長掃描，測定結(jié)果顯示，最大吸收波長為290 nm。因此，本研究以290 nm作為檢測波長[4-5]。

2.4專屬性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，供試品溶液液相色譜圖中落新婦苷的色譜峰能夠較好的分離，且陰性對照溶液液相色譜圖在相同保留時間無色譜峰出現(xiàn)，表明本研究方法專屬性良好，見圖1。

A. 對照品溶液；B.供試品溶液；C.陰性對照品溶液A. Control solution; B. Test solution; C. Negative control solution圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.5線性關(guān)系考察

精密稱取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、8、10 ml，置于10 ml容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至刻度，搖勻，分別制備成質(zhì)量濃度為0.009 98、0.019 96、0.039 92、0.059 88、0.079 84、0.099 80 mg/ml的溶液，分別精密10 μl，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以落新婦苷的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進行線性回歸，得到回歸方程：Y=2 336 982X-114 709，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，落新婦苷在0.099 8～0.998 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果表明，落新婦苷峰面積的RSD=0.53%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗

稱取樣品適量(批號：20150614)，共6份，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。外標(biāo)法計算落新婦苷的平均含量為0.039 20 mg/ml，RSD為1.21%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗

精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液，于室溫(25 ℃)下放置0、1、2、4、8、12 h時，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，落新婦苷峰面積的RSD為0.69%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品(批號：20150614)，每份0.25 g，共6份，置于具塞錐形瓶中，依次精密加入落新婦苷對照品(落新婦苷質(zhì)量濃度：0.040 90 mg/ml)10 ml，對其加樣回收率進行測定，見表1。計算分析可得，平均加樣回收率為101.54%，RSD=0.54%，結(jié)果顯示本次試驗方法加樣回收率良好。

表1　加樣回收率結(jié)果Tab 1　Results of recovery tests

2.10樣品含量測定

取3批痛風(fēng)顆粒(批號：20150615、20150616、20150617)，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件測定落新婦苷的含量，見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果(mg/g)Tab 2　Content determination of samples(mg/g)

3　討論

藥效學(xué)研究結(jié)果證明，黃酮是藥品治療高尿酸血癥的主要有效部位[6-9]。其中，落新婦苷能夠抑制過氧化物酶的活性，清除次氯酸，增強機體抗氧化能力，從而起到降尿酸作用[10]。

有文獻表明，高效液相色譜法測定土茯苓中落新婦苷的含量，流速、柱溫等色譜條件對保留時間、分離度、影響不大[11-14]。也有文獻報道，在復(fù)方土茯苓顆粒的提取工藝篩選中，采用落新婦苷作為考察指標(biāo)，方法穩(wěn)定可行[15]。

本研究表明，落新婦苷在290 nm處有最大吸收波長，故設(shè)定其為檢測波長。在流動相選擇上，考察了不同比例的甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸分別作為流動相，結(jié)果表明，甲醇-水作為流動相時，落新婦苷拖尾現(xiàn)象較為明顯。因此，本研究以甲醇-0.1%磷酸(V∶V=40 ∶60)作為流動相，其基線平穩(wěn)，落新婦苷與雜峰具有較好的分離度，且無明顯拖尾現(xiàn)象。

綜上所述，本研究結(jié)果準確、方便穩(wěn)定，可用于痛風(fēng)顆粒中落新婦苷的檢測，彌補了痛風(fēng)顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準中含量測定的空白，從而在生產(chǎn)環(huán)節(jié)保證痛風(fēng)顆粒的有效性和穩(wěn)定性，保障患者用藥的安全與有效。

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Content Determination of Astilbin in Tongfeng Granules by HPLC

DAI Nengjie，YANG Quanwei，CHENG Lu，HUANG Wentao

(Dept.of Pharmacy, Wuhan the First Hospital, Hubei Wuhan 430022, China)

OBJECTIVE：To establish the method for content determination of astilbin in Tongfeng granules. METHODS: Waters e2685 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm) column was adopted with the mobile phase of 0.1% phosphoric acid(V∶V=40 ∶60), detection wavelength of 290 nm and flow rate of 1.0 ml/min. And the column temperature was 30 ℃ with sample quantity for 10 μl. RESULTS: The linear range of the astilbin in concentration was 0.099 8-0.998 0 μg(r=0.999 9). Relative standard deviation (RSD) of accuracy test, repeatability test and stability test were≤3.00%. The average recovery rate was 101.54%，RSD=0.54%(n=6). CONCLUSIONS: The method is simple, accurate, and reproducible, which can be used for the quality control of gout granule.

Tongfeng granules; Astilbin; HPLC method

主管藥師。研究方向：藥物新制劑、新劑型研究。E-mail：25513218@qq.com

R927.2

A

1672-2124(2016)09-1232-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.09.031

2016-06-10)

*藥師。研究方向：中藥制劑研究。E-mail：112803190@qq.com