逆流色譜研究進展

吳大同 潘遠江

（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027）

評述與進展

逆流色譜研究進展

吳大同 潘遠江*

（浙江大學(xué)化學(xué)系，杭州 310027）

逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是以分析物在液-液兩相溶劑中的分配差異為核心的快速分離技術(shù)。近年來，逆流色譜對復(fù)雜樣品的分離，尤其是對天然產(chǎn)物的分離已獲得廣泛的關(guān)注。本文綜述了近年來逆流色譜在儀器改進、溶劑體系篩選等領(lǐng)域的研究進展，并介紹了CCC在分離手性化合物中的應(yīng)用前景。最后，對該領(lǐng)域未來的研究內(nèi)容進行了展望。

逆流色譜；儀器改進；溶劑體系；手性分離；評述

1 逆流色譜簡介

20世紀70年代，美國國家健康研究院Ito博士發(fā)明了逆流色譜。逆流色譜（Counter-current chromatography，CCC）是一種連續(xù)液-液分配色譜技術(shù)，無需任何固態(tài)支撐體，依托于兩相溶劑連續(xù)有序的重復(fù)混合實現(xiàn)分析物高效分離。經(jīng)過40多年的發(fā)展與完善，逆流色譜作為一種高效的制備或半制備分離技術(shù)已廣泛用于分離復(fù)雜樣品，如天然產(chǎn)物［1～10］，生物蛋白［11～15］，納米粒子［16］等。與以固相載體作為固定相的色譜技術(shù)相比，其具有樣品損失小、無不可逆吸附、分辨率高等優(yōu)點［17］。因此，逆流色譜正被越來越多的分離工作者接納。至今，已經(jīng)建立了快速分析型CCC，半制備型CCC，大分子蛋白質(zhì)分離用的CCC以及pH區(qū)帶制備型CCC。眾多的應(yīng)用實例表明，逆流色譜憑借其獨特的優(yōu)勢，已成為現(xiàn)代分離技術(shù)不可缺少的手段之一。

本文主要對近5年逆流色譜在儀器改進、溶劑體系篩選等領(lǐng)域的研究進展進行綜述，重點介紹了圍繞提高固定相保留值而進行的儀器改進，并對CCC在分離手性化合物中的應(yīng)用做了簡要介紹。

2 逆流色譜儀器的優(yōu)化和改進

發(fā)展快速、高效的色譜分離技術(shù)是分離工作者不斷追求的目標。經(jīng)過多年發(fā)展，特別是2000年以來，制備或半制備型逆流色譜在儀器改進、設(shè)計方面已取得較大的突破，主要包括以下幾個方面：（1）色譜柱幾何構(gòu)型的設(shè)計；（2）多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計；（3）多維逆流色譜以及逆流色譜與制備液相色譜聯(lián)用技術(shù)。圍繞這三方面，研究人員做了大量的系統(tǒng)工作。設(shè)計出多種獨具特色且高效的逆流色譜，顯著提高了復(fù)雜樣品的分離效率，大大縮短了分離時間。

其中，對色譜柱的改進，即是增加其固定相保留值。固定相保留值是逆流色譜的一個重要參數(shù)。通常，保留值越高，分離得到的峰分辨率就越好。但是，傳統(tǒng)逆流色譜普遍存在著固定相保留值較低的缺點（＜40%）。近年來，針對這個問題，研究人員對色譜柱幾何構(gòu)型進行了改進。

Liang等［18］構(gòu)建了新型圓錐體色譜柱的逆流色譜（圖1），并在理論上得到了最優(yōu)的圓錐體構(gòu)造關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)，不同于傳統(tǒng)的圓柱體色譜柱，該型色譜柱能顯著提高固定相保留值，最高可達71.56%。此外，Cao等［19］設(shè)計了螺旋管圓盤柱，使固定相保留值提高了10%，并成功應(yīng)用于對大極性化合物的分離。這些設(shè)計都有效地提高了逆流色譜的分離能力，證明了對色譜柱的優(yōu)化是一種可靠的方案。

改進多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計是提高逆流色譜分離效率的另一種重要途徑。如今廣泛使用的高速逆流色譜［20～24］，就是利用螺旋管的一種特殊的同步行星式運動模式（J型模式），能夠?qū)崿F(xiàn)快速、高效分離。然而，由于其運動模式的限制，大極性溶劑體系很難在色譜柱中得到保留，因此對多肽、糖類以及蛋白質(zhì)等大極性化合物分離效果很差。

圖1 （A）圓錐體色譜柱設(shè)計示意圖和（B）實物圖［18］Fig.1 （A）Schematic illustration of upright conical coils and（B）photographs of the product［18］

Shinomiya等［25］以主、從動軸不同的轉(zhuǎn)動方式構(gòu)建了交叉軸螺旋管式離心型逆流色譜（圖2），具體運動方式為支撐軸在水平方向轉(zhuǎn)動，從動軸在豎直方向轉(zhuǎn)動。與傳統(tǒng)的J型螺旋管式離心型逆流色譜相比，其對大極性溶劑體系具有較好的固定相保留值，能夠顯著提高大極性化合物的分離效率。實驗表明，該型逆流色譜可以基于雙水相系統(tǒng)成功分離5種多糖類似物。此外，該設(shè)計極大地豐富了逆流色譜色譜柱的設(shè)計思路，為儀器的改進提供了較佳方案。

圖2 （A）J-型螺旋管和交叉軸型螺旋管運動模式設(shè)計示意圖及（B）實物圖［25］Fig.2 （A）Schematic illustration of planetary motions of the type-J coil planet centrifuge（CPC）and cross-axis CPC and（B）photograph of the product［25］

其后，該研究小組又利用4個偏心軸將同步行星式運動模式（J型模式）與非同步離心模式（I型模式）結(jié)合，構(gòu)建了新型四柱并聯(lián)逆流色譜（圖3）［26］，并分別測試了以頭到尾和尾到頭洗脫方式分離復(fù)雜樣品。無論是以上相或下相為固定相，都具有較高的固定相保留值和較好的分離度。該方法既能保留兩種不同運動模式的優(yōu)點，又能擴大其應(yīng)用范圍，適用于分離極性差別大的復(fù)雜樣品。

多重色譜聯(lián)用技術(shù)是提高分離效率的有效手段之一。近年來，Qiu等［27，28］利用獨特的接口技術(shù)和不間斷分離模式，發(fā)展了逆流色譜與制備型液相色譜聯(lián)用技術(shù)（圖4）。以逆流色譜為第一維分離，制備液相色譜為第二維分離，一次性分離得到12種化合物，且純度達到90%以上。該結(jié)果表明，多維色譜技術(shù)能有效的結(jié)合每個色譜的技術(shù)特點，綜合利用其優(yōu)勢使分離效率達到最優(yōu)化。

為了進一步優(yōu)化二維逆流色譜系統(tǒng)，本課題組設(shè)計了一種新型二維逆流色譜接口技術(shù)［29］。如圖5所示，該系統(tǒng)結(jié)合了固相萃取技術(shù)，用固相萃取小柱除去一維產(chǎn)生的大量溶劑，同時將目標樣品吸附在固相萃取柱上。通過少量的流動相即可將固相萃取柱上的樣品引入二維分離。該逆流色譜系統(tǒng)通過特殊的接口及色譜聯(lián)用設(shè)計實現(xiàn)了兩柱并聯(lián)集成化，大大提高了逆流色譜的分離效率。其后，本課題組又利用該二維逆流色譜系統(tǒng)開發(fā)出兩種不同類型溶劑體系，同時在線分離大黃提取物中的4種蒽醌類化合物［30］。具體操作步驟如下：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1∶1∶1∶1，V/V）作為第一維逆流色譜溶劑體系；甲基叔丁基醚-乙腈-水（2∶2∶3，V/V），上相加入三氟乙酸（10 mmol/L），下相加入三乙胺（10 mmol/L）的酸堿溶劑體系作為第二維逆流色譜溶劑體系，實現(xiàn)了對復(fù)雜樣品的高效、快速分離。

圖3 （A）J型模式和I型模式并聯(lián)設(shè)計示意圖和（B）實物圖［26］Fig.3 （A）Schematic illustration of type-J forward and type-I backward columns and（B）photograph of the product［26］

圖4 CCC和制備型HPLC聯(lián)用設(shè)計示意圖［27］Fig.4 Scheme for flow programming CCC×preparative HPLC system［27］CCC：Counter-current chromatography.

綜上所述，無論是對色譜柱的幾何構(gòu)型優(yōu)化設(shè)計，還是對多重色譜柱的串、并聯(lián)設(shè)計，均是為了增加固定相保留值，提高逆流色譜的分離度。此外，合理的多維色譜聯(lián)用設(shè)計能綜合不同色譜的技術(shù)優(yōu)點，顯著提高分離效率。

3 溶劑體系的選擇和優(yōu)化

選擇合適的溶劑體系是逆流色譜分離化合物最為關(guān)鍵一步，占全部工作量的90%以上。因此，建立合理的溶劑篩選策略，選擇合適的溶劑體系無疑是極其重要的。近年來，研究者陸續(xù)開發(fā)了新的溶劑篩選策略。針對四元溶劑體系：正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，Margraff定義了其中的23種溶劑體系，并用字母命名A～Z定義了這23個溶劑體系（除E，I和O外），這些溶劑體系又被命名為Arizona體系。每個溶劑體系中正己烷/乙酸乙酯的比例與甲醇/水的比例必須保持一致。本課題組首先研究了溶質(zhì)的分配系數(shù)以及Arizona體系從親水性的溶劑體系（乙酸乙酯-水）到疏水性溶劑體系（正己烷-甲醇）的極性變化關(guān)系［31］，以此提出了新的篩選策略（圖6），AZ系統(tǒng)被分成4個部分：Ⅰ親水性，A～H；Ⅱ弱親水性，J～M；Ⅲ弱疏水性，N～S；Ⅳ疏水性，T～Z。結(jié)果表明，利用三柱并聯(lián)分析型逆流色譜。僅需3次即可獲得最佳溶劑體系。該策略顯著縮短了獲得合適的溶劑體系所需要的時間，極大地提高了分離效率。

圖5 二維逆流色譜設(shè)計示意圖［29］Fig.5 Scheme of two-dimensional counter-current chromatography［29］

圖6 基于AZ兩相體系的復(fù)雜物物質(zhì)快速篩選策略［31］Fig.6 Rapid screening strategy of a complex mixture based on liquid compositions of the AZ liquid system［31］

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)利用建模的方法歸納出兩相體系中溶質(zhì)的分配系數(shù)規(guī)律具有一定的可行性。具體步驟如下：首先，利用少量實驗數(shù)據(jù)得出溶質(zhì)分配系數(shù)的一定規(guī)律，并用相應(yīng)的數(shù)學(xué)方程式表示；其次，根據(jù)已建立的數(shù)學(xué)模型，尋找最佳的溶劑篩選體系。Hopmann等［32，33］基于非平衡溶劑化能數(shù)值計算的類導(dǎo)體屏蔽模型（COSMO-RS）對逆流色譜的溶劑體系進行篩選。結(jié)果表明，該模型可以準確地預(yù)測兩相溶劑系統(tǒng)的變化對溶質(zhì)分配系數(shù)的影響，并以此篩選出合適的溶劑體系。Ren等［34，35］創(chuàng)新性地引入熱力學(xué)模型（非隨機兩相液體模型，NRTL），其可對逆流色譜常用的兩相溶劑系統(tǒng)的液-液平衡組成成分進行準確估算。具體篩選過程如圖7所示：根據(jù)實驗測定的溶質(zhì)分配系數(shù)及其相應(yīng)的溶劑體系計算NRTL模型參數(shù)，并用標準品數(shù)據(jù)證明該參數(shù)模型的可行性。其中，活度系數(shù)是非常重要的中間參數(shù)，該值的準確性將決定該模型能否準確預(yù)測合適的溶劑體系。

此外，傳統(tǒng)的溶劑體系（正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，甲基叔丁醚-乙腈-水等）適用于分離極性較小或中等極性的化合物。但對于一些大極性、容易失活的樣品，此類溶劑體系并不能滿足分離要求。因此，一些新的溶劑體系被開發(fā)用于分離多糖、多肽、蛋白質(zhì)等樣品。Yin等［36］利用雙水相系統(tǒng)PEG1000-MgSO4-H2O（12∶16∶72，w/w）實現(xiàn)一步分離3種不同分子量的多糖。Bezold等［37］開發(fā)新型的溶劑體系［Emim］Cl-K2HPO4/KH2PO4-H2O，成功實現(xiàn)3種蛋白質(zhì)（即溶解酵素、肌紅蛋白和牛血清蛋白）的分離。研究表明，含有離子液體的雙水相系統(tǒng)具有對樣品不易失活、對大極性化合物具有較好的分配系數(shù)等優(yōu)點。Wu等［38］以正己烷-乙酸甲酯-乙腈-水（4∶3∶4∶4，V/V）三相系統(tǒng)為基礎(chǔ)，以上層為固定相，下層為流動相。分離得到白芷提取物中8種香豆素類化合物；以上層為固定相，中間層為流動相，分離達到高良姜提取物中6種二芳基庚烷類衍生物；以中間層為固定相，下層為流動相，分離得到知母提取物中3種化合物。綜上所述，合適的溶劑體系有助于擴大逆流色譜的分離對象，增加其應(yīng)用范圍。表1列舉了近年開發(fā)的新型溶劑體系。

圖7 NRTL模型的設(shè)計流程圖［34］Fig.7 Scheme of procedure of NRTL model［34］

表1 近年開發(fā)的新型溶劑體系Table 1 Novel liquid-liquid solvent systemin recent years

4 基于逆流色譜對手性化合物的拆分及其展望

手性對映體是一類具有特殊光學(xué)性質(zhì)的化合物，其在精細化學(xué)品、生命科學(xué)以及醫(yī)藥中間體等領(lǐng)域占有及其重要的地位。大量制備單構(gòu)型手性化合物一直是分離工作者不斷追求的目標。然而，現(xiàn)有的色譜分離技術(shù)，如液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳，存在著樣品容量小和成本高等缺點，限制了其在手性拆分中的應(yīng)用。

逆流色譜分離手性物質(zhì)無疑還處于實驗階段。近年來，環(huán)糊精及其衍生物、蛋白質(zhì)等都被嘗試作為基于逆流色譜分離方法的手性拆分劑。Han等［44，45］以環(huán)糊精和銅（II）絡(luò)合物為手性拆分劑，成功拆分D/L-扁桃酸及其類似物。實驗結(jié)果表明，溫度、溶劑pH值和被分析物濃度都會對分離效率產(chǎn)生影響。Ito等［46］首次嘗試以牛血清蛋白為手性拆分試劑，基于螺旋管式逆流色譜雙水相體系分離單構(gòu)型的D/L-色氨酸。他們比較了液相色譜和逆流色譜在手性拆分中的優(yōu)缺點，其以羥丙基-β-環(huán)糊精為手性拆分劑分離苯基丙酸對映體［47，48］。結(jié)果表明，液相色譜和逆流色譜對手性拆分都各有其優(yōu)勢，制備型液相色譜適用于高效分離少量的手性化合物；逆流色譜更適用于大量制備高純度手性化合物。

然而，基于逆流色譜分離手性物質(zhì)仍存在以下幾個問題：（1）CCC分離柱理論塔板數(shù)相對較低；（2）所用溶劑體系會破壞主、客體分子間的相互作用；（3）缺乏合適的手性配體。因此，仍需逆流色譜工作者不斷努力找到合適的解決辦法。但是，可以相信，對于大制備量分離手性化合物，逆流色譜是一個可以信賴的分離技術(shù)。

5 總結(jié)與展望

經(jīng)過幾十年的不斷發(fā)展和完善，無論是儀器構(gòu)造，還是新型溶劑體系的篩選，逆流色譜均有顯著進步。如今，CCC憑借其獨具特色的技術(shù)特點，已被越來越多的分離工作者作為制備或半制備分離技術(shù)，廣泛用于復(fù)雜樣品的分離，并成功得到高純度的化合物，如：生物堿、黃酮類、蛋白質(zhì)等。大量分離實例證明了逆流色譜對復(fù)雜樣品具有高效分離的優(yōu)勢。然而，與其它分離技術(shù)相比，逆流色譜還存在著一些問題亟需解決。例如，其較低的理論塔板數(shù)，限制了其進一步應(yīng)用；分離工作者需要花費較長的時間和精力篩選得到合適的溶劑體系。這些問題的存在使得逆流色譜仍有進一步優(yōu)化的空間。

對此，提出以下幾點展望：（1）由于逆流色譜可以有效避免死吸附，因此可以針對一些高附加值對象（如紫杉醇）進行分離，實現(xiàn)高回收率低消耗的分離過程。（2）逆流色譜是以分配比為基礎(chǔ)的分離技術(shù)，通過控制不同對象的分配比實現(xiàn)化合物的精確分段。隨著逆流色譜的不斷發(fā)展完善，它將發(fā)展成為一種更加成熟的、可產(chǎn)業(yè)化的高效分離技術(shù)。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21532005 ）

Recent Development in Counter-current Chromatography

WU Da-Tong，PAN Yuan-Jiang*
（Zhejiang University，Department of Chemistry，Hangzhou 310027，China）

Counter-current chromatography（CCC）is a quick preparative separation technique based on the different partition coefficient in liquid-liquid solvent systems.This paper reviews recent research progress in the region of solvent systems，instruments improvement of CCC.Moreover，some application prospects about enantioseparation of racemic compounds by CCC are also discussed.Finally，the contents and goal of further research in this field is discussed.

Counter-current chromatography；Instruments improvement；Solvent systems；Chiral separation；Review

20 September 2015；accepted 2 December 2015）

10.11895/j.issn.0253-3820.150746

2015-09-20收稿；2015-12-02接受

本文系國家自然科學(xué)基金資助項目（No.21532005）

*E-mail：panyuanjiang@zju.edu.cn