山核桃外蒲殼中胡桃醌的提取工藝優(yōu)化研究

沙如意，申秀英，蔡成崗，毛建衛(wèi)

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州310023；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023；3.浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023）

山核桃外蒲殼中胡桃醌的提取工藝優(yōu)化研究

沙如意1，2，3，申秀英1，2，3，蔡成崗1，2，3，毛建衛(wèi)1，2，3

（1.浙江科技學院生物與化學工程學院，浙江杭州310023；2.浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江杭州310023；3.浙江省農業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023）

采用單因素試驗設計、正交試驗設計法對山核桃外蒲殼中胡桃醌提取進行了優(yōu)化，獲得了料液比、提取溫度、提取時間等參數(shù)，并建立了參數(shù)方程。由試驗結果可知，采用超聲波提取法、直接浸提粉末樣品，甲醇提取率最高，考慮到安全問題選擇乙醇為提取溶劑，提取溶劑乙醇效果好于甲醇和石油醚，且95%乙醇效果好于50%和70%乙醇，料液比以1∶40（g/mL）、提取時間和溫度分別為50 min和40℃提取效果較佳。正交試驗結果表明最佳工藝為B2A3C3，即料液比1∶40（g/mL），提取時間50min，提取溫度50℃時，提取量為0.0625mg/mL，是非正交試驗結果平均值的1.3倍。

山核桃外蒲殼；胡桃醌；提取優(yōu)化

山核桃（Juglans mandshurica Maxim）外果皮稱為外蒲殼，未成熟時含有單寧和胡桃醌等成分，具有抑菌、抗腫瘤抗氧化和鎮(zhèn)痛等作用我國傳統(tǒng)中藥用外蒲殼治療胃病和皮膚病，有一定的療效[1]。山核桃中起抑菌活性作用的主要為胡桃醌等物質。胡桃醌是從胡桃科植物中提取分離出來的一種萘醌類活性物質，具有抗菌、消炎、止血、鎮(zhèn)痛、抑癌、抗氧化等多種生物活性，在抑菌活性方面具有較多的研究報道[2-7]，如吳朝霞[8]等研究了胡桃醌對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、酵母菌、黑曲霉等的抑制作用，結果表明胡桃醌對這些微生物均有較好的抑制作用。目前關于山核桃外蒲殼中胡桃醌等抑菌活性物質的提取相關報道較少，為進一步加強對山核桃外蒲殼的高效利用，并加強對胡桃醌的性質研究，需要對胡桃醌進行提取工藝優(yōu)化。本研究采用單因素和正交試驗方法對胡桃醌提取工藝條件進行優(yōu)化研究。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱、GZX-9023MBE電熱鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；冷凍高速離心機：東旺儀器；HH-S26數(shù)顯恒溫水浴鍋；RE-2000旋轉蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；KQ-500E型超聲波清洗器：超聲波提取提高KQ3200昆山市超聲儀器有限公司；UV-5500PC紫外可見分光光度計（含比色皿）：上海元析儀器有限公司；PL202-S：梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；移液槍：Eppendorf中國有限公司；TG 15K離心機：長沙東旺實驗儀器有限公司；XFB-400中藥粉碎機：長沙中誠制藥機械廠；100 mL容量瓶、100 mL燒杯、錐形瓶，60目篩、過濾漏斗等為材料：購自華東醫(yī)藥器材化劑公司。

1.2 主要試劑

1.2.1 山核桃外蒲殼

由臨安當?shù)毓r提供，9月采摘后將外蒲殼于40℃烘干備用。將山核桃外蒲殼用中藥粉碎機進行粉碎，后用60目篩過濾，得到棕黃色粉末。

1.2.2 其他試劑

胡桃醌（純度99%）：sigma公司；甲醇、乙醇、石油醚等均為分析純；配置胡桃醌標準品甲醇為色譜純。

1.3 標準曲線繪制

1.3.1 標準溶液配制

稱取2 mg胡桃醌標準品，置于50 mL容量瓶中，加入適量色譜純甲醇，用35℃水浴促進胡桃醌溶解，并用甲醇定容，得胡桃醌標準溶液。

1.3.2 最大吸收波長確定

取標準溶液用分光光度計進行掃描，分別從400nm波長到450 nm波長，每隔5 nm和1 nm測定吸光度。

1.3.3 標準曲線制作

分別吸取胡桃醌標準溶液 0.05、0.25、0.、1.0、2.5、5.0、7.5 mL置于25 mL容量瓶中用甲醇定容，搖勻。以不加胡桃醌標準溶液容量瓶中用甲醇定容，搖勻。以不加胡桃醌標準溶液為空白對照。在426 nm處測定各溶液的吸光度。取標準溶液1.0 mL，按標準曲線制備的方法操作，用UV5500-PC紫外分光光度計測定。

1.4 方法

1.4.1 提取方法

準確稱取外蒲殼粉末4 g，于燒瓶中加入一定比例的提取溶劑，搖勻置于一定溫度水浴鍋中提取，提取液3 000 r/min離心10 min后，在60℃旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮溶液，再以甲醇定容至100 mL，在424 nm波長下分別測吸光度，計算得率。提取溶劑、提取溫度和提取時間根據(jù)試驗設計進行選擇。

1.4.2 試驗設計

1.4.2.1 單因素試驗

1）提取方法

以100 mL酒精（95%）于30℃水浴鍋和超聲波提取器中分別提取30 min，離心濃縮后測定提取率。

2）提取溶劑的確定

分別向外蒲殼粉末中加入30mL甲醇，乙醇（95%）和石油醚，30℃超聲20 min，離心后上清液旋轉蒸發(fā)得浸膏，再以甲醇定容至25 mL容量瓶中，測定胡桃醌提取率。

3）乙醇濃度確定

以質量分數(shù)為50%、70%、95%的乙醇對外蒲殼進行超聲提取，試驗方法同1.4.1。

4）料液比的選擇

分別設置山核桃外蒲殼與95%乙醇溶液的料液比例為 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），進行超聲提取，確定料液比對提取效果的影響。

5）超聲提取時間

選擇 20、30、40、50、60、90 min 進行超聲提取，確定提取時間對提取效果的影響。

6）溫度的選擇

采用超聲輔助提取法，分別測定 20、30、40、50、60℃下不同溫度對胡桃醌提取率的影響。

1.4.2.2 正交試驗設計

依據(jù)單因素試驗的結果，對提取時間（A）、液料比（B）、溫度（C）三因素進行考察，按L9（34）正交表進行實驗，以胡桃醌提取率即最終提取液的吸光度作為考察指標，探討最佳提取工藝條件。正交試驗設計因素水平見表1。

表1 正交因素設計表Table 1 Factors and levels of orthogonal design experiments

2 結果與討論

2.1 標準曲線

采用紫外可見分光光度計掃描，從410 nm波長到430 nm波長每隔1 nm測吸光度，獲得胡桃醌吸收光譜圖，如圖1所示。

如圖1所示，在424 nm處取得最大吸光度，所以取424 nm為檢測波長。

圖1 胡桃醌標準品吸光值與波長關系圖Fig.1 Change of juglone standard absorb value with wavelength

2.2 胡桃醌標準曲線

以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線圖（圖 2），標準回歸曲線方程：y＝0.083 3x+0.048 7，R2＝0.979，說明胡桃醌在0～25 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

圖2 胡桃醌標準曲線Fig.2 Standard curve of juglone

2.3 單因素試驗結果

2.3.1 水浴、超聲提取結果

兩種方法提取胡桃醌含量如表2所示。

表2 提取方法對提取率的影響Table 2 Effects of method on juglone extraction yield

超聲法可以提高胡桃醌提取量，可能與超聲波可作用于分子內部，增大樣品與萃取溶劑之間的接觸面積，提高目標物從固相轉移到液相的傳質速率相關。

2.3.2 提取溶劑選擇

以甲醇、乙醇和石油醚為提取溶劑，結果如表3所示，甲醇效果最好，但考慮到實踐應用中的安全性等問題，選取95%乙醇作為提取溶劑。

2.3.3 乙醇濃度確定

綜合比較50%，70%，95%的乙醇對胡桃醌提取的影響，結果如表4所示，隨著乙醇濃度的上升，提取胡桃醌的效果越好。因此95%的乙醇作為提取溶劑。

表3 不同提取溶劑的提取效果Table 3 Effects of reagents on juglone extraction yield

表4 不同濃度提取溶劑的提取效果Table 4 Effects of reagents concentration on juglone extraction yield

2.3.4 料液比的選擇

試驗結果如表5所示，隨著料液比的增大，提取液中胡桃醌含量呈現(xiàn)增加趨勢，在1∶40（g/mL）時效果最好，因此 1 ∶40（g/mL）為較適料液比。

表5 料液比對提取效果的影響Table 5 Effects of substrate liquid ratio on juglone extraction yield

2.3.5 超聲提取時間

分別提取 20、30、40、50、60、90 min，結果如表 6所示。

表6 不同提取時間對胡桃醌提取量的影響Table 6 Effects of time on juglone extraction yield

超聲提取時間在60 min內可以促進胡桃醌提取效果，但90 min時略有下降，可能因不穩(wěn)定性等原因所致，另外50 min后即可達到較佳的提取效果，因此選擇50 min為提取時間。

2.3.6 溫度的選擇

分別測定 20、30、40、50、60 ℃提取溫度對胡桃醌提取率的影響。結果如表7所示，結果表明，提取溫度40℃最為合適。

表7 不同提取溫度對胡桃醌提取量的影響Table 7 Effects of temperature on juglone extraction yield

2.4 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果設計的正交試驗結果見表8。

表8 三因素正交試驗設計結果Talbe 8 Result of orthogonal design experiments

各試驗因子因素水平圖如圖3所示。

圖3 因素水平圖Fig.3 Factors and levels of orthogonal design experiments

由圖3可知，因素A以3水平提取效果最好，因素B以2水平提取效果最好，因素C以第三水平效果較好。

正交試驗結果分析顯示，影響山核桃蒲外殼中胡桃醌量的主次因素為B＞A＞C，即溶劑用量＞提取時間＞提取溫度。最佳工藝為B2A3C3，即料液比為1∶40（g/mL），提取時間 50 min，提取溫度 50℃。

在對已經優(yōu)化的條件進行驗證后發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化的試驗條件下可以得到較好的試驗水平。結果表明，胡桃醌的提取量達到較佳的提取效果，3次提取結果分別為 0.062 8、0.062 2、0.062 5 mg/mL，是非正交試驗結果平均值的0.048 mg/mL的1.3倍。

3 總結

采用單因素試驗設計和正交試驗設計方法對山核桃外蒲殼中胡桃醌提取進行了優(yōu)化，結果表明，超聲波提取法效果好于直接浸提，甲醇提取率最高，考慮到安全問題選擇乙醇為提取溶劑，石油醚最差，95%的乙醇提取效果好于50%和70%的乙醇，料液比以1∶40（g/mL）為最好，較佳的提取時間和溫度分別為50 min和40℃。正交試驗結果表明，正交試驗最佳工藝為B2A3C3，即料液比 1 ∶40（g/mL），提取時間 50 min，提取溫度50℃。提取效果提高到0.062 5 mg/mL，是非正交實驗結果平均值0.048 mg/mL的1.3倍。相關的優(yōu)化研究還需進一步深入。

[1] 申秀英,毛建衛(wèi),蔡成崗.山核桃外蒲殼成分與功能研究進展[J]．食品研究與開發(fā),2013,34(21)：128-130

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[6] 孫廣仁,姚大地,由士江．山核桃青果皮對幾種人類致病細菌的抑制作用[J]．東北林業(yè)大學學報,2009,37(1)：92-93

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[8] 吳朝霞,陳光啟,王媛.胡桃醌對幾種常見食品腐敗微生物的抑制作用[J]．中國釀造,2009,209(8)：76-78

Study on Optimization of Juglone Extraction Conditions from Hickory Hull

SHA Ru-yi1，2，3，SHEN Xiu-ying1，2，3，CAI Cheng-gang1，2，3，MAO Jian-wei1，2，3
（1.School of Biological and Chemical Engineering，Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.Key Laboratory of Agricultural Products Chemical and Biological Processing Technology of Zhejiang Province，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；3.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Chemical and Biological Manufacturing for Agricultural Biological Resources，Hangzhou 310023，Zhejiang，China）

Thesinglefactorandorthogonalexperimentdesignmethodswereutilizedtooptimizetheextractioncon ditions of juglone from Hickory Hull.The results showed that the ultrasonic extraction method，methanol as extraction reagent had higher extraction rate，but for safety consideration，ethanol was better than methanol and petroleumether，and95%ethanolisbetterthan50%and70%ethanol，the material liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），extraction time and temperature of 50 min and 40℃ showed higher extraction rate.Orthogonal experiment results showed that the optimal conditions of B2A3C3，namely the material liquid ratio of 1 ∶40（g/mL），extraction time and temperature of 50 min and 50℃had the optimal extraction rate of 0.062 5 mg/mL，which was 1.3 times than the average value of single factor experiments.

Hickory Hull；juglone；extraction optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.023

杭州科技發(fā)展計劃項目（20120433B06）；浙江省教育廳科研項目（Y201327551）

沙如意（1982—），男（漢），講師，博士，研究方向：發(fā)酵與生物資源利用。

2015-01-19