基于ISSR標記的新疆伊犁薰衣草品種資源的遺傳多樣性分析

郭丹麗，李 敏，王自健，蔣新明，黃先忠，路 喆，王 樸

(1．新疆生產(chǎn)建設兵團第四師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆伊寧　835000;2．石河子大學生命科學學院植物基因組學實驗室，新疆石河子　832003)

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基于ISSR標記的新疆伊犁薰衣草品種資源的遺傳多樣性分析

郭丹麗1，李 敏1，王自健1，蔣新明1，黃先忠2，路 喆1，王 樸1

(1．新疆生產(chǎn)建設兵團第四師農(nóng)業(yè)科學研究所，新疆伊寧835000;2．石河子大學生命科學學院植物基因組學實驗室，新疆石河子832003)

【目的】揭示不同薰衣草品種的遺傳多樣性?！痉椒ā坷肐SSR分子標記技術對45個薰衣草品種的親緣關系進行分析。【結(jié)果】45份材料DNA共擴增出83條譜帶，平均每條引物擴增出9.2條帶，多態(tài)性為60條帶，多態(tài)性比例為72.29%。45份薰衣草品種兩兩之間的遺傳距離值在0.663～0.988。群體的有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣度(H)、Shannon信息指數(shù)(I)分別為1.399 5、0.240 4和0.364 3。45個薰衣草品種在遺傳距離0.72處可分為兩類，第Ⅰ類包含44個品種，第Ⅱ類僅有1個品種。【結(jié)論】伊犁地區(qū)的45個薰衣草品種遺傳多樣性水平低，親緣關系較近。

伊犁薰衣草；ISSR標記；聚類分析；遺傳多樣性分析

0　引言

【研究意義】薰衣草是一種具有多種經(jīng)濟價值、觀賞價值、藥用價值的香料作物[1-3]。自1964年伊犁地區(qū)從法國引種栽培薰衣草后，經(jīng)過50多年的引種、馴化、選育及應用推廣，薰衣草已成為伊犁地區(qū)的經(jīng)濟特色支柱產(chǎn)業(yè)[4]。目前，伊犁地區(qū)的薰衣草品種多、命名雜亂，僅利用植物形態(tài)學標記已無法準確地區(qū)別薰衣草品種。而我國對薰衣草種質(zhì)資源的分子遺傳學研究還不完善，因此利用分子標記技術深入研究伊犁地區(qū)的薰衣草種質(zhì)資源，對充分發(fā)掘優(yōu)異的品種資源、科學選用雜交親本、提高作物育種效率等具有十分重要的意義。【前人研究進展】傳統(tǒng)的薰衣草分類方法主要通過植物學形態(tài)分類方法進行分類，自20世紀40年代后，科學家通過染色體數(shù)目對薰衣草進行分類，這兩種鑒定方法比較繁瑣、工作量較大并且可靠性較差[5]。1980年后，DNA多態(tài)性的遺傳標記產(chǎn)生后，被廣泛應用于種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析等研究領域[6-7]。近年來，利用分子標記技術對薰衣草種質(zhì)資源分析方面也進行了部分研究，如張艷玲等[8]利用RAPD標記技術對10個薰衣草品種進行了遺傳多樣性研究，發(fā)現(xiàn)這10個品種具有較高的遺傳多樣性；蘇秀娟等[9]對新疆的19種薰衣草品種進行了種質(zhì)資源遺傳關系分析，發(fā)現(xiàn)這些薰衣草品種的遺傳相似度較高。【本研究切入點】了解新疆伊犁地區(qū)薰衣草品種的遺傳多樣性及親緣關系，研究利用ISSR標記方法，對第四師農(nóng)科所薰衣草種質(zhì)資源圃及65團第四師農(nóng)科所試驗基地的種質(zhì)資源進行分析。研究薰衣草遺傳多樣性的文章比較少，目前，只有3人利用分子技術對薰衣草進行種質(zhì)資源分析?！緮M解決的關鍵問題】了解新疆伊犁地區(qū)薰衣草品種的親緣關系，為研究不同品種之間的遺傳差異分析其遺傳背景為薰衣草的遺傳改良奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材 料

研究所有材料來自新疆兵團第四師農(nóng)科所特色資源苗圃收集種植的薰衣草品種，以及第四師農(nóng)科所65團試驗基地栽培的薰衣草品種。

1.2方 法

1.2.1薰衣草基因組DNA的提取

參照任艷利等[10]的方法提取薰衣草幼葉DNA，提取的薰衣草基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計法和瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量與濃度，并將DNA稀釋至50 ng/μL，樣品于-20℃冷藏備用。

1.2.2 ISSR-PCR反應體系

查閱相關文獻資料[9]，確定最佳反應體系為20 μL: 50 ng模板DNA, 0.4 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.4 μM ISSR分子標記引物，1 UTaqDNA聚合酶。PCR反應程序為：94℃進行預變性4 min后，94℃變性45 s, 48℃(48～53℃)退火45 s, 72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸8 min，最后4℃進行保存。

1.2.3ISSR擴增產(chǎn)物的檢測

PCR反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳條件為：上樣7 μL, 1×TAE緩沖液，100 V的電壓35 min。電泳完畢后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并采集圖像，實驗重復3次。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計ISSR電泳的多態(tài)性條帶，有條帶的記為1，無條帶的記為0。只有清晰和可重復的條帶才可以記錄。使用PopGene32軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon信息指數(shù)(I)、多態(tài)位點百分率(PPB)，用NTSYS-pc2.1分析軟件計算相似系數(shù)(GS)，然后用非加權配對算術平均法(UPGMA)并進行聚類分析，繪制樹狀聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1ISSR引物擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

9條ISSR引物對供試材料的DNA模板進行PCR擴增，并對擴增條帶進行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，9條引物共獲得83個擴增位點，其中多態(tài)性位點60個；每個引物擴增出的位點為5～14個，平均9.2個；每個引物擴增出的多態(tài)性位點2～14個，平均6.6個，多態(tài)性比率為72.29%。這表明供試薰衣草種質(zhì)資源間存在較大的遺傳變異，并且ISSR標記能夠有效的揭示材料間的遺傳多態(tài)性。圖1,表1

M: DL 2000 Marker; 1-23: 23個不同的薰衣草品種

M: DL 2000 Marker; 1-23: 23 lavandula varieties

圖1引物UBC808部分薰衣草品種擴增結(jié)果
Fig.1The part of ISSR amplification result using primer UBC808 of lavandula
表1ISSR引物擴增結(jié)果及多態(tài)性
Table 1Amplification result and polymorphic of 9 ISSR primers used in this study

引物Primer引物序列Primersequence退火溫度Annealingtemperature(℃)擴增條帶數(shù)No.ofbands多態(tài)性條帶數(shù)No.ofpolymorphicbands多態(tài)性百分率(%)PercentageofpolymorphicbandsUBC808(AG)8C529666.7UBC818(CA)8G485480UBC826(AC)8C53131076.9UBC841(GA)8YC50131184.6UBC844(CT)8RC505240UBC845(CT)8RG495480UBC855(AC)8YT501414100UBC868(GAA)64910660UBC873(GACA)4499333.3總計Total836072.29平均Average9.26.7

注：表中R代表A或T，Y代表C或G

Note：R represents A/G/T and Y represents C/G

2.2ISSR標記的遺傳多樣性

通過POPGENE軟件分析發(fā)現(xiàn)45份薰衣草材料之間的多態(tài)性位點百分率為72.29%，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.399 5，Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別是0.240 4和0.364 3。通過NTSYS2.1軟件計算不同薰衣草材料間的遺傳相似性系數(shù)(GS值)，最后得到供試材料的相似性矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，暗示著親緣關系越近；遺傳相似系數(shù)越小，暗示著親緣關系越遠。45份薰衣草材料的相似性系數(shù)在0.663～0.988，變幅為0.325。其中，薰衣草材料YXD-5和YXD-6的二者之間的遺傳相似性系數(shù)(0.988)最大，表明YXD-5和YXD-6的親緣關系較近，遺傳差異最??；材料YXB-2和YXD-10的遺傳相似系數(shù)(0.663)最小，表明YXB-2和YXD-10的親緣關系較遠，遺傳差異最大，存在較高的遺傳多樣性。

2.3ISSR標記聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，選用UPGMA法進行聚類分析。聚類結(jié)果顯示，遺傳相似性系數(shù)為0.72時，所有薰衣草材料可分為兩大類，第一大類(Ⅰ)含有44個材料品種，而第二大類(Ⅱ)則只有YXB-2，說明YXB-2和其他的薰衣草材料之間差異較大。當遺傳相似性系數(shù)為0.79時，第一大類(Ⅰ)薰衣草品種又被分為2個亞類，即新薰4號、YXA-6、新薰2號、新薰1號、YXC-6以及YXD-8為一個亞類，剩余的38個品種被分為另一個亞類。這暗示著，在伊犁地區(qū)種植的薰衣草遺傳關系比較近。圖2

3　討 論

遺傳多樣性直接反應了生物的遺傳背景、作物育種潛力及其使用價值，只有認清了不同物種間的遺傳變異信息和親緣關系，才能有目的地選擇親本，選育優(yōu)良品種。目前，利用ISSR技術在植物中進行遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定等方面的研究報道較多，結(jié)果表明，ISSR分子標記能夠準確區(qū)分不同物種間的親緣關系，是一種非常靈敏、有效的工具[11]。試驗中9條ISSR引物在45份薰衣草材料中共產(chǎn)生83條擴增帶，其中72.29%的擴增片段都能夠揭示材料間的遺傳差異，表明薰衣草品種間遺傳相似性系數(shù)和遺傳距離變化范圍比較大，具有豐富的遺傳基礎。這一研究在國內(nèi)其他對薰衣草種質(zhì)遺傳多樣性的研究中都得到驗證，這些分子標記都能產(chǎn)生多態(tài)性條帶，但不同的分子標記的檢測水平及多態(tài)性水平各不相同。如張艷玲等[8]利用RAPD標記對10個國外薰衣草材料進行親緣關系進行分析，15個多態(tài)性引物共擴增出312條普帶，其中99.38%具有多態(tài)性；蘇秀娟等[9]等根據(jù)ISSR對新疆19份薰衣草品種進行了種質(zhì)資源分析，9條ISSR引物共檢測出94條帶，其中42.6%為多態(tài)性條帶。這些差異可能是由于材料選擇和研究方法的不同造成的。

圖2基于ISSR標記的45份薰衣草資源聚類
Fig.2Dendrogram of cluster analysis based on ISSR of 45 lavandula germplasm

實驗同文獻[9]的研究方法相同，都是用相同的9條ISSR引物對伊犁地區(qū)薰衣草進行擴增，但在擴增過程中引物所用的退火溫度、擴增條帶數(shù)與文獻[9]的均不相同，可能與薰衣草材料、提取方法、實驗儀器以及統(tǒng)計方法的差異不同所引起的。研究表明伊犁地區(qū)種植的薰衣草材料之間的遺傳相似性系數(shù)在0.663～0.988，遺傳多樣性較低；而文獻[9]做出的薰衣草遺傳相似性系數(shù)為0.325～0.975，遺傳多樣性較高，這就表明薰衣草的種質(zhì)資源鑒定需要結(jié)合多種方法，相互驗證，最終確定出薰衣草之間的遺傳關系。評價種質(zhì)資源遺傳多樣性水平主要參考三個重要參數(shù)：有效等位基因數(shù)(Ne)、基因多樣度(H)和Shannon信息指數(shù)(I)，研究得到的薰衣草種植遺傳多樣性參數(shù)Ne=1.399 5，H=0.240 4，I=0.364 3與文獻[9]做出的遺傳多樣性參數(shù)Ne=1.454 0，H=0.280 5，I=0.435 4相差不多，均表明薰衣草的遺傳多樣性水平較低，品種間的親緣關系較近，是伊犁地區(qū)新品種資源創(chuàng)新工作遇到的主要困難。因此，需要不斷引進新品種，并利用先進的分子育種手段培育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種，來滿足薰衣草產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求。

4　結(jié) 論

45種材料共獲得83個擴增位點，其中多態(tài)性位點60個，平均每個引物擴增位點9.2個；有效等位基因數(shù)(Ne)為1.399 5, Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon信息指數(shù)(I)分別是0.240 4和0.364 3；遺傳相似系數(shù)介于0.663～0.988；利用UPGMA聚類分析，以遺傳相似性系數(shù)0.72為界，可將45個薰衣草材料劃分為2類。伊犁地區(qū)種植的薰衣草品種遺傳多樣性水平低，品種之間相似性高。

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Fund project:Supported by Youth Foundation of Xinjiang Production and Construction Corps (2014CD007) and Science and Technology Xinjiang Supporting Program of Xinjiang Production and Construction Corps (2014AB010).

Genetic Diversity of Distinctive-spicy Lavender Cultivars in Xinjiang Yili Revealed by ISSR Analysis

GUO Dan-li1, LI Min1, WANG Zi-jian1, JIANG Xin-ming1, HUANG Xian-zhong2,LU Zhe1, WANG Pu1

(1.InstituteofAgriculturalSciences,theFourthAgriculturalProductionDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps，YiningXinjiang835000,China; 2.PlantGenomicsLaboratory,CollegeofLifeSciences,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 This research focuses on assessment of the genetic variability and diversity of lavender (Lavandulapedunculata). 【Method】 Genetic relations among 45 cultivars of lavenders were analyzed by inter-simple sequence repeat (ISSR) makers. 【Result】 A total of 83 ISSR bands were obtained, among which 60 were polymorphic bands. On average, amplification band of the each primer was 9.2 and polymorphism ratio was 72.29%. The dissimilarity coefficient of the 45 lavender cultivars ranged from 0.663 to 0.988. The efficient number of alleles, Nei's genetic diversity, and Shannon's information index of the cultivars varieties were 1.399，5, 0.240，4 and 0.364，3, respectively. The 45 lavender cultivars were divided into 2 groups at the genetic distance 0.72 by UPGMA. The first group contained 44 cultivars and the second group only contained 1 cultivars. 【Conclusion】 The population genetic diversity of 45 lavender cultivars was high and the genetic relationship was close.

lavender (Lavandulapedunculata) in Yili; ISSR remark; genetic diversity; clustering analysis

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.04.017

2015-12-02

兵團青年基金項目(2014CD007)；兵團科技支疆項目(2014AB010)

郭丹麗(1989-)，女，新疆伊犁人，助理研究員，研究方向為特色作物遺傳育種，(E-mail)guodanli0@163.com

路喆(1982-)，男，甘肅慶陽人，副研究員，研究方向為香料作物新品種選育及栽培，(E-mail)1178714191@qq.com；王樸(1967-)，女，新疆伊犁人，研究員，研究方向為特色作物，(Email)429513483@qq.com

S573+9

A

1001-4330(2016)04-0716-05