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    一起典型豬瘟病毒感染病例的診斷與分析

    2016-11-01 20:46:05
    畜牧與飼料科學(xué) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:弓背豬只豬群

    楊 超

    (1.襄陽正大農(nóng)牧食品有限公司,湖北 襄陽 441104;2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

    一起典型豬瘟病毒感染病例的診斷與分析

    楊 超1,2

    (1.襄陽正大農(nóng)牧食品有限公司,湖北 襄陽 441104;2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

    2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭的育肥豬,先后出現(xiàn)了弓背喜臥、糞便干結(jié)、全身皮膚出血等癥狀。病理剖檢可見全身皮膚及心、肝、脾、肺、腎、胃、膀胱等多臟器廣泛出血斑;采集病豬病變組織,提取RNA,用豬瘟病毒基因特異性引物進行RT-PCR檢測,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,病料呈豬瘟病毒核酸陽性,確診病豬為豬瘟病毒感染。

    豬瘟;病理剖檢;RT-PCR檢測

    豬瘟(Classical Swine Fever,CSF),曾稱為豬霍亂(Hog Cholera,HC),在我國俗稱爛腸瘟。其是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒(CSFV)引起的豬的一種以高熱稽留、全身廣泛性出血、敗血和母豬繁殖障礙為特征的熱性高度致死性傳染病,曾經(jīng)給我國及世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大損失[1-2]。隨著豬瘟疫苗的廣泛使用,豬瘟在世界范圍內(nèi)得到了一定程度的控制,有的國家已經(jīng)消滅了豬瘟[3-4]。近年我國雖無大規(guī)模豬瘟疫情暴發(fā),但豬瘟仍不時在一些不注重防疫的中小型養(yǎng)殖場或農(nóng)戶飼養(yǎng)的豬群中散發(fā)或流行。2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭育肥豬,先后出現(xiàn)了弓背喜臥、被毛粗亂、糞便干結(jié)、眼角分泌物增多,隨后腹部及四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)出血斑等癥狀,經(jīng)病理剖檢和RT-PCR診斷確診為豬瘟病毒感染。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的育肥豬病豬及剖檢采集的淋巴結(jié)和腎臟等病變組織。

    分子生物學(xué)試劑:Trizol試劑、RT試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品;ExTaq酶,dNTP等PCR相關(guān)試劑為寶生物(大連)有限公司產(chǎn)品,PCR引物參照已報道的豬瘟病毒Alfort株的基因序列E2保守區(qū)[5-7]設(shè)計1對引物HCV-F/HCV-R,擴增目標(biāo)片段大小約為440 bp,引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成,序列分別為:

    HCV-F:5′-AATGAGATTGGGTTACTCGG-3′;

    HCV-R:5′-ACCACAGTGGAA AACGAA GAT-3′。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 臨床診斷與剖檢:觀察和記錄豬群病豬臨床癥狀,剖檢死亡豬只,檢查大體病變,并采取具有典型病變的組織,-70℃冷凍備用。

    1.2.2 總RNA提?。嚎俁NA提取,按Trizol試劑盒操作說明進行:取具有明顯病變的淋巴結(jié)或腎臟約 100 mg,置于 1.5 mL EP管中,加入 1 mL Trizol,放入磁力組織破碎勻漿器具中,勻漿破碎10 min,室溫靜置10 min,加入200 μL氯仿,用力顛倒離心管以混勻,靜置2 min,12 000 r/min離心10 min,取上層水相移至新EP管中,加入等體積的異丙醇,振蕩混勻,-20℃冰箱靜置 20 min,12 000 r/min,高速離心15 min,棄上清液。加入300 μL 75%酒精振蕩洗滌,12000r/min離心,棄上清液。室溫靜置10mim,加入RNase free水,-70℃冷凍保存。

    1.2.3 RT-PCR反應(yīng)及電泳:RT反應(yīng)采用20 μL體系:5×Buffer 4 μL,10 mM 的 dNTP 1 μL,40 U/μL的 RNase inhibitor 1 μL,2 mM 的引物 PR 2 μL,5 U/μL 的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μL, 待 檢 RNA 2.5 μL,RNase free H2O 7.5 μL加入PCR管中,置PCR儀中。 反應(yīng)條件為:42℃60min,95℃5min,4℃10min。

    PCR 采用 25 μL 反應(yīng)體系:10×Ex Buffer(Mg2+)2.5 μL,2.5 mM dNTP 2 μL,HCV-F/HCV-R 各 1 μL,反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μL,ExTaq 0.25 μL,H2O 17.25 μL。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 3 min;94℃ 30 s,55℃30 s,72℃ 40 s,30 循環(huán);72℃ 10 min;4℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行檢測。

    2 試驗結(jié)果

    2.1 臨床癥狀臨床觀察豬群,豬只多被毛粗亂、弓背喜臥、眼角可見分泌物和淚斑,有的豬只糞便干結(jié),有的稀薄,部分豬只腹部及四肢內(nèi)側(cè)皮膚可見出血斑等癥狀。

    2.2 剖檢病變對死亡的豬只進行剖檢,可見病豬心肌及心冠脂肪出血明顯;脾臟明顯梗死,邊緣呈鋸齒狀;腎臟表面可見針尖狀出血點,膀胱內(nèi)膜出血有大小不一的出血斑,胃內(nèi)膜出血并有潰瘍斑,見圖1。

    圖1 病豬剖檢內(nèi)臟病變

    2.3 RT-PCR結(jié)果提取病變淋巴結(jié)和腎臟組織總RNA,用參照已發(fā)表的豬瘟病毒序列E2保守區(qū)設(shè)計合成的豬瘟特異性引物,進行豬瘟病毒核酸RT-PCR檢測,結(jié)果擴增出了約440 bp的條帶,顯示病料呈豬瘟核酸陽性,見圖2。

    圖2 RT-PCR檢測豬瘟病毒核酸

    3 討論

    典型的豬瘟往往是由強毒株引起的,開始時豬群內(nèi)可能僅有個別豬只食欲減少,神情呆滯,弓背垂尾,體溫升高,便秘[5]。隨著病程的發(fā)展,豬群內(nèi)有更多的豬發(fā)病,最初的病豬可能食欲廢絕,出現(xiàn)眼結(jié)膜炎,兩眼有多量黏液膿性分泌物,隨后下痢,有的發(fā)生嘔吐、驚厥,出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等衰弱癥狀,常在幾天內(nèi)死亡。

    近年來,豬瘟的流行和發(fā)病特點已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形式,出現(xiàn)了臨床癥狀顯著減輕,發(fā)病率較低,潛伏期及病程較長多呈散發(fā)的溫和型豬瘟,這些病例往往病變不明顯,常需依賴實驗室診斷才能確診[6]。

    該研究通過對豬群進行臨床觀察,發(fā)現(xiàn)豬群癥狀符合豬瘟臨床癥狀。對死亡病豬進行剖檢發(fā)現(xiàn),心臟、心冠脂肪、腎臟、膀胱及胃內(nèi)膜等內(nèi)臟器官廣泛性出血;脾臟梗死,邊緣呈鋸齒狀,呈現(xiàn)典型的豬瘟示病癥狀[7]。在臨床診斷、病理剖檢的基礎(chǔ)上進一步進行RT-PCR病原分子生物學(xué)檢測,擴增出了豬瘟病毒核酸,確診該豬群為豬瘟感染。

    對發(fā)病原因進行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)殖戶一直未對豬群進行豬瘟疫苗免疫,可能是造成該次發(fā)病的主要原因。這種免不免疫都無所謂的僥幸心理也有可能正是造成當(dāng)前豬瘟在我國中小型養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的豬群中仍時有發(fā)生的根本原因。因此,中小型養(yǎng)殖戶一定要提高防疫意識,采取積極有效的免疫措施,進行科學(xué)養(yǎng)殖,方能降低風(fēng)險,提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益。

    [1]吳憶春.某豬場豬偽狂犬病病毒與豬瘟病毒混合感染的診斷[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2014,35(6):171-174.

    [2]高順.淺談豬瘟病毒[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2015(10):89.

    [3]王在時.豬瘟防治研究的回顧和展望[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1996:64-71.

    [4]仇華吉,童光志,沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗——半個世紀(jì)的回顧[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(8):1675-1685.

    [5]邱楊,趙麗,盧小雨,等.五種動物疫病診斷方法研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2012,33(12):156-160.

    [6]李文良,毛立,楊蕾蕾,等.豬瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的協(xié)同免疫保護作用 [J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,31(2):357-361.

    [7]MEYERS G,RUMENAPF T,THIE H.Molecular cloning and nucleotide sequencing of hog cholera virus [J].Virology,1989,171:55-56.

    S858.282.651

    A文章順序編號:1672-5190(2016)01-0100-02

    2015-12-31

    楊超(1977—),男,碩士研究生,主要研究方向為動物疾病防控。

    (責(zé)任編輯:趙景娣)

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