斑馬魚母源凝集素基因zfol的克隆和表達分析

王紅瑩, 杜　嫚

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

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斑馬魚母源凝集素基因zfol的克隆和表達分析

王紅瑩, 杜嫚

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室，武漢430074)

為驗證凝集素Zfol是否為母源蛋白及其具體表達模式，揭示凝集素這類來源于母體的免疫物質(zhì)在魚類胚胎發(fā)育早期的免疫保護作用并提供理論依據(jù)，克隆Zfol 的基因全長進行了生物信息學(xué)分析.利用RT-PCR和Western blot分析了zfolmRNA和Zfol蛋白的時空表達.結(jié)果表明：zfolmRNA及Zfol蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達均呈動態(tài)變化.zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中表達，在精巢中未檢測到表達.Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測不到表達，而在腎臟中有低含量表達，在卵巢中有高含量表達.

凝集素；斑馬魚； 基因zfol； 克?。槐磉_分析

凝集素是動、植物體內(nèi)一種重要組分，作為一類能識別并結(jié)合糖基的蛋白質(zhì)，可結(jié)合致病源表面糖蛋白或糖綴合物，在識別致病源、抑制細菌增殖、阻止卵子多精受精、調(diào)節(jié)糖類物質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮重要作用類在[1-4].早期胚胎發(fā)育過程中依賴母源免疫和自身非特異免疫.卵母細胞中有一些凝集素來源于母體，可能是魚體的先天免疫因子，在魚類還沒發(fā)育成熟時保護早期胚胎避免病原入侵[5-8].研究卵母細胞特異的凝集素功能有助于深入了解胚胎發(fā)育早期的免疫保護機制[7,9,10].與其他魚類相比，作為模式生物的斑馬魚(Daniorerio)早期胚胎發(fā)育細胞分裂快速、飼養(yǎng)簡便、遺傳背景清晰、遺傳操作技術(shù)成熟等，這些特點為本研究的順利開展提供了可能.

本文以克隆斑馬魚基因zfol為切入點，在生物信息學(xué)分析基礎(chǔ)上，在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平分別分析了zfol在胚胎發(fā)育過程中及各組織中的表達差異，為進一步對其進行功能研究奠定了基礎(chǔ).

1　材料和方法

1.1材料

供試材料：野生型斑馬魚在(28±0.5)℃循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，每天早晚各投喂餌料1次，控制光照(14 h照明/10 h黑暗)的明暗周期照明.需要收集胚胎時，于前一天將雌雄斑馬魚按照只數(shù)2∶1比例放置在同一繁殖缸內(nèi)，中間用隔板隔開，第二天光照前去掉插板，待斑馬魚開始追尾，約20～40 min后開始產(chǎn)卵，收集受精卵，胚胎用水清洗后，置于ERS培養(yǎng)液，放置于(28±0.5)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2試劑

限制性內(nèi)切酶、KOD試劑盒、Taq酶(日本TakaRa)，T4 DNA 連接酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega)，Trizol regent(美國Invitrogen)，抗體(上海Abmart)，凝膠回收試劑盒(上海華舜)，質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒(上海生工).

1.3RNA的提取和cDNA合成

取斑馬魚胚胎，利用TRIZOL方法提取總RNA.利用MMLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.4目的基因zfol克隆和mRNA水平檢測

克隆zfol基因的引物：F：5′-ATGAAGGTTTATC

AAGGTGTTTTG-3′，R：5′-TTATAGAGTACATTTACG

GATG-3′.β-actin作為內(nèi)參，引物如下：F： 5′-CTTGCGGTATCCACGAGAC-3′，R：5′-GCGCCATACA

GAGCAGAA-3′. PCR產(chǎn)物與pGEM-T Vector 相連接，轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌中，利用菌落PCR鑒定是否插入正確，測序.zfol轉(zhuǎn)錄水平檢測采用RT-PCR方法，引物同上.

1.5Western blot 檢測Zfol蛋白的時空表達模式

受精后的斑馬魚胚胎觀察，選取不同發(fā)育時期的胚胎進行收集.斑馬魚成魚中，選取不同組織，將以上樣品分別用 RIPA裂解液裂解，隨后采用Western blot 方法檢測Zfol的不同發(fā)育時期和不同組織中的表達模式.

2　結(jié)果

2.1zfol克隆測序及序列分析

PCR擴增后經(jīng)測序驗證得到zfol的開放閱讀框序列(圖1).經(jīng)生物信息學(xué)檢測，zfol基因編碼256個氨基酸.其5′非翻譯區(qū)的長度為73 bp，3′非翻譯區(qū)的長度為93 bp，有完整的poly A尾巴，基因的cDNA全長為937 bp.以上結(jié)果表明zfol基因編碼完整的蛋白.

圖1　凝膠電泳檢測zfol基因 Fig.1　Agarose gel electrophoresis detection of zfol gene

圖2　測序結(jié)果和對應(yīng)的氨基酸序列Fig.2　Sequencing result and correspongding amino acid sequences

2.2zfolmRNA表達量在不同發(fā)育時期的胚胎中的變化

為研究凝集素zfol是否為母源蛋白，及其在魚類的早期胚胎發(fā)育過程中的模式，采用RT-PCR方法檢測了其在斑馬魚受精后不同胚胎發(fā)育時期的mRNA表達量的變化(圖3).以β-actin為標準來檢測各個時期所用的總RNA量是否一致.RT-PCR分析結(jié)果顯示zfol在受精后的各個發(fā)育時期均有表達.從發(fā)育起始就有高含量表達，說明其是來自母體遺傳，為母源蛋白，表達量受精后到16 hpf一直較高，后期隨著胚胎的進一步發(fā)育，母體蛋白影響變小，zfol的mRNA表達量下降，到36 hpf后，隨著胚胎的分裂發(fā)育，新生胚胎自身的mRNA及蛋白大量表達，zfol的表達量有所上升.

圖3　受精后斑馬魚胚胎發(fā)育不同時期的zfol mRNA表達水平Fig.3　Temperal expression of zfol mRNA in different periods during zebrafish embryogenesis

2.3在成體斑馬魚不同組織中zfol轉(zhuǎn)錄水平表達變化

不同組織的定位預(yù)示著不同的功能實驗利用RT-PCR方法研究了斑馬魚成魚中不同組織中zfol的表達變化(圖4)，結(jié)果顯示組織表達中，zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中有表達，在精巢中未檢測到表達.

圖4　斑馬魚成魚各組織中zfol mRNA表達水平Fig.4　zfol mRNA expression level in each indicated tissues of zebrafish

2.4Zfol蛋白在斑馬魚各發(fā)育早期的表達水平變化

蛋白起始表達時期、表達量的多少預(yù)示了是否是母源蛋白.實驗以β-Tubulin作為標準內(nèi)參，應(yīng)用Western blot方法檢測Zfol蛋白表達情況(圖5).在受精后最初的4 h內(nèi)，Zfol含量非常高，此時期新生胚胎自身的蛋白尚未開始大量表達.說明此時的Zfol來自母體.此后蛋白含量出現(xiàn)動態(tài)變化，母體蛋白逐漸耗盡，在受精后約6 h，蛋白含量回落，表達量下降.12～16 h蛋白含量有小幅上升，20～24 h表達量再次回落，到36 h蛋白表達量升至最高，此后Zfol蛋白含量劇烈下降.故斑馬魚受精后早期胚胎發(fā)育的96 h內(nèi)，Zfol蛋白表達呈現(xiàn)動態(tài)波動變化.

0～96 hpf：斑馬魚胚胎受精后0～96 h圖5 Zfol蛋白在斑馬魚各發(fā)育早期的表達水平Fig.5　Zfol expression levels at each early developmental stages of zebrafish

2.5在成體斑馬魚不同組織中Zfol蛋白水平表達模式

不同組織的蛋白定位直接與蛋白的功能相關(guān)，采用Western blot檢測了Zfol在斑馬魚成體魚不同組織中的表達模式(圖6).結(jié)果表明：Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測不到表達，而在腎臟中有低含量表達，在卵巢中有高含量表達.

圖6　斑馬魚不同組織中Zfol 蛋白的表達水平Fig.6　Zfol expression level in different tissues of zebrafish

3　討論

凝集素基因zfol是否為母源基因及其具體表達模式是本研究關(guān)注的要點.魚類各組織中尤其是卵母細胞中有一些凝集素來源于母體.在卵母細胞的成熟過程中及受精后的早期胚胎發(fā)育過程中，這些凝集素的功能可能與免疫保護相關(guān)，屬于母源垂直傳遞的母源免疫.為研究克隆基因zfol是否為母源基因，揭示其分布模式和表達模式，實驗克隆得到了該基因全長，生物信息學(xué)分析表明該基因的cDNA編碼一個全序列的功能蛋白.在斑馬魚受精后的早期胚胎發(fā)育時期，該基因的mRNA及蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達均呈動態(tài)變化，且在受精后的前幾個小時表達量很高.在成魚組織中，卵巢的表達量最高.說明zfol基因和蛋白在母體就存在，并隨著魚的產(chǎn)卵，經(jīng)卵母細胞垂直傳遞給新生個體.因此在受精后的幾小時內(nèi)，新生個體自身的基因和蛋白還沒大量表達時，zfol基因和蛋白的含量處于高表達.因此zfol基因是母源基因，其編碼的蛋白質(zhì)是母源凝集素蛋白.

此外，zfolmRNA在成魚的卵巢、心臟、肝臟、腎臟、腦中有表達，在精巢中未檢測到表達.Zfol蛋白在精巢、心臟、腦、肝臟等組織中檢測不到，而在腎臟中有低含量表達，在卵巢中有高含量表達.這可能是翻譯水平存在調(diào)控，因此造成mRNA和蛋白檢測結(jié)果的差異.zfolmRNA及Zfol蛋白在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達均呈動態(tài)變化，說明基因和蛋白的調(diào)控是多層次和多方面的.在轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯以及翻譯后修飾等過程中，存在多方面的復(fù)雜調(diào)控，以保證基因在個體的不同生長發(fā)育時期和不同組織器官中的精確表達.

本文對斑馬魚凝集素基因zfol在早期不同發(fā)育時期和成體不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達情況進行了檢測分析，結(jié)果表明其是母源凝集素蛋白.凝集素被認為是來自母體的有的會對胚胎發(fā)揮免疫保護功能[7,10,11].由zfol基因在斑馬魚胚胎發(fā)育早期的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達譜，獲知了其發(fā)揮重要功能的關(guān)鍵時期，為后續(xù)進一步研究其功能奠定了基礎(chǔ).

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Molecular Cloning and Characterization of Maternal Lectin Genezfolin Zebrafish

WangHongying,DuMan

(Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China ,College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities of Life Science,Wuhan,430074)

To investigate the expression pattern of maternal lectin Zfol, and to provide the theoretical basis for immune protection effect of lectins from the mother′s immune material on embryogenesis, the full-length ofzfolgene was cloned and the expression pattern was characterized. Bioinformatics analysis tozfolwas also performed. The spatial-temporal expression pattern ofzfolmRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot, respectively. The results indicated that bothzfolmRNA and Zfol proteins showed dynamic expression pattern during zebrafish embryogenesis. High level expression ofzfolmRNA were detected in the liver, kidney, ovary, brain, and heart except testis in adult fish; whereas, Zfol protein was highly expressed in ovary, less expressed in kidney, and not expressed in testis, heart, brain and liver.

lectin; zebrafish;zfol;cloning;expression analysis

2016-04-04

王紅瑩 (1976-), 女, 副教授, 博士, 研究方向: 水生生物學(xué)、分子生物學(xué), E-mail: wanghongying@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(31001099)

S965.299

A

1672-4321(2016)03-0026-04