浙貝母花期地上部分核苷類、氨基酸類及無(wú)機(jī)元素類成分分析與評(píng)價(jià)△

閆精楊，劉培*，江曙*，朱邵晴，李會(huì)偉，陳京，段金廒

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

浙貝母花期地上部分核苷類、氨基酸類及無(wú)機(jī)元素類成分分析與評(píng)價(jià)△

閆精楊1，劉培1*，江曙1*，朱邵晴1，李會(huì)偉1，陳京2，段金廒1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京 210023；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

目的通過(guò)對(duì)浙貝母花期地上部分核苷類、氨基酸類及無(wú)機(jī)元素類化學(xué)成分的分析評(píng)價(jià)，為其資源化利用提供科學(xué)依據(jù)。方法采用UHPLC-MS/MS方法分別分析了浙貝母花期生長(zhǎng)階段的莖、花器不同部位中核苷類、氨基酸類化學(xué)組成及其含量；采用電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)法及分光光度法分析了樣品中的無(wú)機(jī)元素組成及其含量。結(jié)果浙貝母花(除去花藥)、花藥、莖中總核苷類成分含量分別為4.58、1.91、6.50 mg·g-1；總氨基酸類成分含量分別為69.77、68.79、103.98 mg·g-1；總無(wú)機(jī)元素類成分含量分別為1 295.27、1 306.76、772.74 μg·g-1。結(jié)論浙貝母花期地上部分含有較為豐富的核苷類、氨基酸類、無(wú)機(jī)元素類等資源性化學(xué)成分，具有潛在的藥用和營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。

浙貝母；地上部分；化學(xué)成分分析；資源化利用評(píng)價(jià)

百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq.是多年生草本，多以其地下鱗莖入藥，為中藥浙貝母。浙貝母主產(chǎn)地分布在浙江、江蘇、福建，浙江主產(chǎn)地主要有鄞州、磐安、縉云等地，江蘇主產(chǎn)地主要有南通、蘇州、泰州等地[1]。浙貝母生產(chǎn)上多采用鱗莖繁殖，在其種植過(guò)程中，為使養(yǎng)分集中供于鱗莖，必須適時(shí)摘花打頂，控制地上部分生長(zhǎng)，避免因開(kāi)花結(jié)果消耗大量養(yǎng)分。摘花打頂一般選擇在3—4月浙貝母植株大致開(kāi)放有2朵花左右之時(shí)，除少量花蕾曬干作藥用外，摘下的大部分花蕾和莖棄置于田間自然降解[2-3]。浙貝母全國(guó)年產(chǎn)量約2100 t，而地上部分的重量鱗莖相當(dāng)[4]。有文獻(xiàn)報(bào)道，浙貝母地上部分中含生物堿和皂苷類成分[5]、芳香醛酮類[6]、以及氨基酸類成分[7]。中藥廢棄物資源化是一個(gè)涉及經(jīng)濟(jì)、環(huán)境、社會(huì)效益等多個(gè)目標(biāo)的連續(xù)過(guò)程[8]。在中藥收獲時(shí)產(chǎn)生大量廢棄物，既導(dǎo)致了中藥資源的極大浪費(fèi)又給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了新的壓力[9]。本文對(duì)浙江磐安地區(qū)浙貝母摘花打頂時(shí)期的花(除去花藥)、花藥以及莖中的氨基酸類、核苷類、無(wú)機(jī)元素類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)，以期為浙貝母種植期產(chǎn)生的廢棄物的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sartorius BT125D電子分析天平(德國(guó)賽利多斯公司)；EPED超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)；KQ-250E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；日立Z-2000型原子吸收分光光度計(jì)。ACQUITY UPLC系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；Xevo TQ質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；MassLynxTM質(zhì)譜工作站(美國(guó)Waters公司)。

1.2 試劑

超純水(自制)；乙腈、甲醇和甲酸為色譜純；甲酸銨(上海凌峰化學(xué)試劑)和醋酸銨(國(guó)藥控股化學(xué)試劑)均為分析純。γ-氨基丁酸(16)、天冬酰胺(21)、瓜氨酸(22)、?；撬?26)、反式-4-羥基-L-脯氨酸(27)、L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽(28)、天冬氨酸(32)、谷氨酰胺(37)、胞嘧啶(1)、胞苷(2)、2′-脫氧腺苷(3)、胸苷(4)、尿苷(5)、腺苷(6)、肌苷(7)、次黃嘌呤(9)、黃嘌呤(11)、胸腺嘧啶(12)、腺嘌呤(13)、鳥(niǎo)苷(15)購(gòu)自Sigma公司；尿嘧啶(10)、2′-脫氧肌苷(14)購(gòu)自阿拉丁試劑公司；甲硫氨酸(17)、苯丙氨酸(18)、色氨酸(19)、谷氨酸(20)、L-脯氨酸(23)、纈氨酸(24)、酪氨酸(25)、精氨酸(29)、組氨酸(30)、賴氨酸(31)、亮氨酸(33)、丙氨酸(34)、蘇氨酸(35)、絲氨酸(36)、半胱氨酸(38)、異亮胺酸(39)、鳥(niǎo)嘌呤(8)購(gòu)自中國(guó)惠行生化試劑公司。化合物純度均大于98%，由高效液相色譜儀測(cè)定。

1.3 材料及處理

實(shí)驗(yàn)用浙貝母地上部分3批采自江蘇南通(批號(hào)：BMH20150301 ～ BMH20150303)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為浙貝母FritillariathunbergiiMiq.的地上部分。采集時(shí)間為2015年5月間。每批次分別分取花(除去花藥)、花藥、莖3個(gè)不同部位，40 ℃鼓風(fēng)干燥后，粉碎成粗粉，置干燥器中備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 核苷類成分分析

2.1.1 供試品溶液制備 取樣品粉末(40目)各1 g，精密稱定，加入50 mL超純水，置于100 mL錐形瓶中，精密稱其重量。超聲提取30 min(25 ℃、100 Hz)，稱重，加超純水補(bǔ)足損失重量。提取液離心10 min(13 000r·min-1)后，取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液作為供試品。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品1～15 1.35、1.18、1.14、1.54、1.18、1.40、1.43、1.19、1.18、1.20、1.23、1.31、1.13、1.27、1.24 mg配制成質(zhì)量濃度分別為27.0、23.6、21.3、30.8、23.6、28.0、28.6、23.8、23.6、24.0、21.2、26.2、22.6、25.4 μg·mL-1的甲醇-水(9∶1，V/V)溶液。不同濃度對(duì)照品溶液由上述儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇-水(9∶1，V/V)稀釋配制而成。

2.1.3 色譜及質(zhì)譜條件 ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。體積流量：0.4 mL·min-1，柱溫：35 ℃。流動(dòng)相：5 mmol·L-1甲酸胺-5 mmol·L-1乙酸胺-0.2%甲酸水溶液(A)，1 mmol·L-1甲酸胺-1 mmol·L-1乙酸胺-0.2%甲酸乙腈溶液(B)。梯度洗脫：1～3 min，10%A；3～9 min，10%～18%A，9～15 min，18%～20%A；15～16 min，20%～46%A。

離子化模式：ESI+；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；采樣錐電壓為30 V；脫溶劑氣流量為1000 L·h-1；錐氣流為20 L·h-1；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃；碰撞能量為6 V。典型樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

2.1.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各1 μL，注入U(xiǎn)HPLC儀測(cè)定，總核苷的量為各核苷的量之和，每份樣品平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表1。

注：A. 核苷對(duì)照品；B. 花(除去花藥)；C. 花藥；D. 莖；1. 胞嘧啶，2. 胞苷，3. 2′-脫氧腺苷，4. 胸苷，5. 尿苷，6. 腺苷，7. 肌苷，8. 鳥(niǎo)嘌呤，9. 次黃嘌呤，10. 尿嘧啶，11. 黃嘌呤，12. 胸腺嘧啶，13. 腺嘌呤，14. 2′-脫氧肌苷，15. 鳥(niǎo)苷。圖1 浙貝母典型樣品核苷類成分的UHPLC-MS/MS圖譜

2.1.5 樣品中核苷類成分測(cè)定結(jié)果分析 由表1可知浙貝母的花(除去花藥)、花藥、莖含有核苷類化學(xué)成分，所測(cè)核苷總量分別為1.91、6.50、4.58 mg·g-1?；?除去花藥)中含有的核苷種類較少，以尿嘧啶的含量最高，為1.17 mg·g-1；胞嘧啶的含量最少，為0.03 mg·g-1?；ㄋ幹心蜞奏ず孔罡?，為2.57 mg·g-1；2′-脫氧肌苷含量最少，為0.01 mg·g-1。莖中以尿苷含量最高，為1.28 mg·g-1；2′-脫氧肌苷含量最少，為0.002 mg·g-1。綜合來(lái)看花藥中含有的核苷種類最多、含量最大，其中尿嘧啶在3個(gè)部位的含量均較高。

2.2 氨基酸類成分分析

2.2.1 供試品溶液制備 取樣品粉末(40目)各1 g，精密稱定，加入50 mL超純水，置于100 mL錐形瓶中，精密稱其重量。超聲提取30 min(25 ℃、100 Hz)，稱重，加超純水補(bǔ)足損失重量。提取液離心10 min(13 000 r·min-1)，取上清液，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品。

表1 浙貝母地上部分核苷類化學(xué)成分的種類及含量 /mg·g-1

注：“—”表示核苷含量低于定量限，下同。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取對(duì)照品16～39 1.57、1.22、1.47、1.26、1.57、1.76、1.49、1.26、1.86、1.88、1.75、1.26、1.57、1.40、1.80、1.48、1.76、1.46、1.47、1.31、2.04、1.60、2.15、1.55 mg配制成質(zhì)量濃度分別為31.4、24.4、29.4、25.2、31.4、35.2、29.8、25.2、37.2、37.6、35.0、28.0、36.0、29.6、24.0、29.2、29.4、26.2、35.4、24.6、40.8、32.0、24.0、31.0 μg·mL-1的甲醇-水(9∶1，V/V)溶液。不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液由上述儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇-水(9∶1，V/V)稀釋配制而成。

2.2.3 色譜及質(zhì)譜條件 ACQUITY UPLC BEH Amide 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)。體積流量：0.4 mL·min-1，柱溫：35 ℃。流動(dòng)相：5 mmol·L-1甲酸胺-5 mmol·L-1乙酸胺-0.2%甲酸-水溶液(A)，1 mmol·L-1甲酸胺-1mmol·L-1乙酸胺-0.2%甲酸-乙腈溶液(B)。梯度洗脫：1～3 min，10%A；3～9 min，10%～18%A；9～15 min，8%～20%A；15～16 min，20%～46%A。

離子化模式：ESI+；毛細(xì)管電壓為3.0 kV；采樣錐電壓為30 V；脫溶劑氣流量為1000 L·h-1；錐氣流為20 L·h-1；離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃；碰撞能量為6 V。典型樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.4 樣品測(cè)定 分別精密吸取對(duì)照品與供試品溶液各1 μL，注入U(xiǎn)HPLC儀測(cè)定，總氨基酸的量為各氨基酸的量之和，每份樣品平行測(cè)定3次，取平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 浙貝母地上部分氨基酸類化學(xué)成分的種類及含量

2.2.5 樣品中氨基酸類成分測(cè)定結(jié)果分析 浙貝母的花(除去花藥)、花藥、莖中總氨基酸的含量分別為68.79、103.98、69.77 mg·g-1，花藥中所含氨基酸總量高于花(除去花藥)和莖。浙貝母的花(除去花藥)、花藥、莖中所含人體必需氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)總量分別為28.23、41.91、21.81 mg·g-1；賴氨酸在花(除去花藥)、花藥、莖中較其他氨基酸含量均最高，分別為23.38、31.74、14.18 mg·g-1；其次為谷氨酰胺，含量分別為19.10、25.87、13.00 mg·g-1。

注：A. 氨基酸對(duì)照品；B. 花(除去花藥)；C. 花藥；D. 莖；16. γ-氨基丁酸；17. 甲硫氨酸；18. 苯丙氨酸；19. 色氨酸；20. 谷氨酸；21. 天冬酰胺；22. 瓜氨酸；23. L-脯氨酸；24. 纈氨酸；25. 酪氨酸；26. ?；撬?；27. 反式-4-羥基-L-脯氨酸；28. L-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽；29. 精氨酸；30. 組氨酸；31. 賴氨酸；32. 天冬氨酸；33. 亮氨酸；34. 丙氨酸；35. 蘇氨酸；36. 絲氨酸；37. 谷氨酰胺；38. 半胱氨酸；39. 異亮胺酸。圖2 浙貝母典型樣品氨基酸類成分的UHPLC-MS/MS圖譜

2.3 無(wú)機(jī)元素測(cè)定

2.3.1 樣品處理 各稱取0.5 g樣品粉末(40目)，置于聚四氟乙烯消解罐中加硝酸5 mL過(guò)夜，加3 mL雙氧水，擰緊密封蓋，置于恒溫烘箱120 ℃加熱3～4 h，直至消解液澄清透明或略帶黃色，冷卻后定容過(guò)濾待測(cè)。

2.3.2 電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜(ICP-AES)測(cè)定條件 射頻功率：1.3 kW，霧化氣流量：0.8 L·min-1，輔助氣流量：0.2 L·min-1，冷卻氣流量：15 L·min-1，觀測(cè)方向：Axial，溶液提升量：1.5 mL·min-1。

2.3.3 樣品測(cè)定及結(jié)果分析 由表3可以看出貝母地上部分中含有的無(wú)機(jī)元素種類較多且含量豐富，花(除去花藥)、花藥、莖中的總含量分別為1 306.76、772.74、1 295.27 μg·g-1，其中金屬元素分別含有1 282.53、735.25、1 275.28 μg·g-1，非金屬元素分別為24.23、37.49、19.99 μg·g-1。以鈉、鐵、鋁的含量最高，鋅、錳、鉀、硼的含量次之。

表3 浙貝母地上部分所含無(wú)機(jī)元素類化學(xué)成分的種類及含量 /mg·g-1

3 討論

通過(guò)對(duì)本實(shí)驗(yàn)各種檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、線性以及加樣回收率進(jìn)行方法學(xué)考察，各檢測(cè)方法均符合定量測(cè)定的要求，因此可以用來(lái)檢測(cè)各類成分。

浙貝母具有清熱化痰、散結(jié)消腫的作用，用于上感咳嗽、支氣管等，在民間浙貝母配桑葉，用于治療風(fēng)熱咳嗽；配桑白皮，用于清肺化痰；配玄參，可治療痰火郁結(jié)。浙貝母地上部分中含有較多種類的核苷類資源性化學(xué)成分，實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了浙貝母地上部分的15種核苷，花(除去花藥)、花藥、莖中分別含有5、12、11種。3個(gè)部位均含有一定量的尿嘧啶，花(除去花藥)、花藥中含有一定量的鳥(niǎo)嘌呤、尿苷。核苷類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)具有多變的特點(diǎn)，由于研究者們通過(guò)化學(xué)和生物修飾，核苷及其衍生物具有顯著的生理功能和藥用活性而受到重視[10-11]，如腺苷具有保護(hù)神經(jīng)、改善血流的作用[12-13]。鳥(niǎo)嘌呤可用作抗病毒藥物阿昔洛韋中間體、硫鳥(niǎo)嘌呤、開(kāi)環(huán)鳥(niǎo)嘌呤的中間體[14]。鳥(niǎo)苷具有抗抑郁、抗氧化的作用[15]。尿苷本身是一種藥物，也可用于合成尿苷肽類抗生素，尿苷參與糖原合成，有助于提高細(xì)胞的耐缺氧能力，提高機(jī)體抗體水平，并可以阻斷癌細(xì)胞和病毒的基因合成[16]。因此我們推斷核苷可能與浙貝母地上部分治療感冒、支氣管炎引起的咳嗽、喉嚨痛有一定關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浙貝母花中含有大量氨基酸。氨基酸在醫(yī)學(xué)上具有防病治病的作用，也可作為營(yíng)養(yǎng)型化妝品的有效成分及合成藥物、表面活性劑、其他工業(yè)產(chǎn)品的化工原料[17]，氨基酸在人體生理活動(dòng)中起著重要作用，尤其是必需氨基酸，浙貝母地上部分中含有6種必需氨基酸。同時(shí)含有大量的谷氨酰胺及精氨酸。谷氨酰胺雖然不是必需氨基酸，但是在生命活動(dòng)中卻有著不可替代的作用，具有增強(qiáng)免疫、提高機(jī)體抗氧化能力的功能。精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥(niǎo)氨酸及肌丁胺的直接前體，對(duì)高氨血癥、肝臟機(jī)能障礙等均有療效。精氨酸和谷氨酰胺同時(shí)作用更是大大提高機(jī)體免疫功能[18]。

浙貝母地上部分含有一定量的無(wú)機(jī)元素，鈉、鐵、鋁的含量較高。無(wú)機(jī)元素是人類必不可缺的成分，部分具有一定的藥用活性，如鐵元素可以治療缺鐵性貧血、營(yíng)養(yǎng)不良，鋁元素是治療胃病的抗酸劑、胃黏膜保護(hù)劑中必不可少的成分。因此，通過(guò)對(duì)浙貝母地上部分核苷、氨基酸、無(wú)機(jī)元素進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)浙貝母地上部分具有潛在的藥用和保健價(jià)值。

本文對(duì)浙貝母地上部分所含的氨基酸、核苷、無(wú)機(jī)元素類成分進(jìn)行了分析，為浙貝母地上部分的資源利用提供了參考。而浙貝母地上部分的生物堿、皂苷類成分和芳香醛酮類有待于進(jìn)一步研究。

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AnalysisandEvaluationofChemicalComponentofAerialPartsofFritillariathunbergiiinFloweringPeriod

YANJingyang1，LIUPei1*，JIANGShu1*，ZHUShaoqing1，LIHuiwei1，CHENJing2，DUANJin’ao1

(1.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrialization，andNationalandLocalCollaborativeEngineeringCenterofChineseMedicinalResourcesIndustrializationandFormulaeInnovativeMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.ZhejiangChineseMedicalUniversity，Hangzhou310053，China)

Objective：To provide the theoretical basis for the comprehensive utilization of aerial parts ofFritillariathunbergiiin flowering period，amino acids，nucleosides and inorganic elements in different parts of aerial parts ofF.thunbergiiin flowering period，including flower without anther，anther and stem were analyzed and evaluated.MethodsUltra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC/MS-MS) technique was used to determine the contents of nucleosides and dissociative amino acids of different parts in above-ground portion ofF.thunbergiiin flowering period.Plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES) and spectrophotometer were applied to determine the contents of inorganic elements.ResultsThe total contents of nucleoside in flower without anther，anther and stem were 1.91，6.50，4.58 mg·g-1，respectively，the contents of twenty-four kinds of amino acids was 68.79 mg·g-1in flower without anther，103.98 mg·g-1in anther and 69.77 mg·g-1in the stem，which indicated that the amino acids were mainly stockpiled in the flower without anther.In addition，the total content of inorganic elements were 1 306.76，772.74，1 295.27 mg·g-1，respectively.ConclusionThe aerial parts ofF.thunbergiiin flowering period contain a number of amino acids，iron element and uracil，which could be further utilized in food and medicinal chemistry.

Fritillariathunbergii；aerial parts；chemical composition analysis；resource utilization evaluation

2015-11-21)

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(ysxk-2013)；江蘇省“333高層次人才培養(yǎng)工程”項(xiàng)目

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劉培，助理研究員，研究方向：中藥與方劑功效物質(zhì)基礎(chǔ)，Tel：(025)85811917，E-mail：liupei@njucm.edu.cn；江曙，教授，研究方向：微生物與中藥相互作用，Tel：(025)85811516，E-mail：jiangshu2000@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.005