CD137表達(dá)與慢性乙型肝炎患者肝臟免疫病理損傷程度的相關(guān)性研究

王　博，吳俊英,2，徐　超

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

CD137表達(dá)與慢性乙型肝炎患者肝臟免疫病理損傷程度的相關(guān)性研究

王博1，吳俊英1,2，徐超3

目的：探討CD137表達(dá)與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者肝臟免疫病理損傷程度的相關(guān)性。方法：采用ELISA法檢測受試者外周血中CD137L的水平；免疫熒光法檢測肝組織中CD137的表達(dá)；Western blot法檢測肝組織中CD137和CD28蛋白水平表達(dá)；熒光定量PCR檢測肝組織中CD137和CD28 mRNA的表達(dá)。結(jié)果：重度CHB組患者血清CD137L的表達(dá)水平均明顯高于健康對照組、輕度和中度CHB組患者(P<0.01)。肝組織中CD28 mRNA在中度CHB組和重度CHB組患者的表達(dá)水平均較健康對照組及輕度CHB組患者明顯升高(P<0.01)。重度CHB組患者CD137 mRNA表達(dá)水平均較健康對照組、輕度CHB組和中度CHB組患者顯著升高(P<0.01)。肝組織中CD28蛋白在中度CHB組和重度CHB組患者的表達(dá)水平均較健康對照組及輕度CHB組患者明顯升高(P<0.01)。重度CHB組患者CD137蛋白表達(dá)水平均較健康對照組、輕度CHB組和中度CHB組患者中CD137蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：CD137的活化參與CHB患者肝組織免疫病理損傷過程，與其損傷程度有相關(guān)性。

慢性乙型肝炎;CD137;免疫病理損傷;肝損傷

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus,HBV)感染的高發(fā)區(qū)，其中慢性HBV感染攜帶者約1億例，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者約2 000萬例[1-2]。CHB患者的肝臟損傷與機(jī)體的免疫調(diào)控息息相關(guān)，在此過程中眾多的調(diào)控因子和細(xì)胞參與其中，如共刺激分子、細(xì)胞因子、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，但其具體機(jī)制如何，尚有待進(jìn)一步研究[3-4]。T細(xì)胞活化后介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是HBV病毒清除和肝細(xì)胞損傷的主要機(jī)制[3]。T淋巴細(xì)胞活化需要雙信號(hào)，除了T細(xì)胞接受抗原提呈細(xì)胞提供的第一信號(hào)(抗原信號(hào))外，共刺激分子結(jié)合為T細(xì)胞活化提供第二信號(hào)，如CD28/B7和CD137/CD137L等。已有研究表明CHB患者外周血中共刺激分子的表達(dá)變化與肝臟病理損傷程度有一定相關(guān)性[5]，然而對于其在人肝組織中表達(dá)情況的研究尚不充分。目前多通過檢測患者外周血淋巴細(xì)胞活化的方法來推測患者免疫狀態(tài)，指導(dǎo)臨床治療[6]。事實(shí)上，CHB患者肝組織中共刺激分子的表達(dá)情況可以更直觀地反映其與肝臟損傷程度的相關(guān)性。已有研究表明CD28在中度CHB組和重度CHB組肝組織中的表達(dá)水平明顯高于健康對照組[7]，但未進(jìn)一步探討其他共刺激分子與肝臟免疫病理損傷程度是否有相關(guān)性。本研究探討CD137在肝組織中的表達(dá)及其與肝臟免疫病理損傷程度間的相關(guān)性并與CD28作比較。

1　材料與方法

1.1試劑及儀器兔抗人CD137、CD137L、CD28(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗兔熒光二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，hRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TRIZOL試劑(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2方法

1.2.1病例選擇病例取自2014年10月至2015年6月中國人民解放軍一二三醫(yī)院和蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院CHB住院患者60例，其中男46例，年齡20～59歲；女14例，年齡18～55歲。CHB的診斷按2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)共同修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均不合并其他病毒性肝炎并排除酒精性肝病、藥物性肝病以及有自身免疫性疾病的患者。外周血的對照組標(biāo)本來自于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共30名；肝組織的對照組標(biāo)本取自于蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科和急診外科，選取癌旁組織(>5 cm)或外傷所致肝破裂的患者，共10例。所有受試者年齡、性別等一般資料均具有可比性。

1.2.2病理學(xué)診斷經(jīng)皮肝穿刺法取肝組織，進(jìn)行病理學(xué)診斷，肝組織炎癥分級(jí)包括G0～G4五級(jí)，纖維化分期包括S0～S4五期，依據(jù)2000年西安全國病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議的修訂標(biāo)準(zhǔn)[8]將CHB患者分為輕度CHB組14例、中度CHB組29例和重度CHB組17例。

1.2.3ELISA檢測外周血中CD137L表達(dá)水平于反應(yīng)板微孔中加受試者血清100 μL，37 ℃孵育2 h，洗滌5次，每次3 min，加CD137L抗體100 μL，37 ℃孵育1 h，加入TMB顯色液顯色，在450 nm波長下比色，獲取吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到CD137L濃度。

1.2.4免疫熒光檢測肝組織中CD137表達(dá)水平石蠟切片脫蠟，用0.1 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌3次，每次5 min，正常山羊血清封閉30 min，甩去血清，加CD137抗體孵育，4 ℃過夜，次日取出室溫平衡30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加FITC標(biāo)記的二抗，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加DAPI，室溫15 min，PBS洗滌5次，每次5 min，甘油封片，用正置熒光顯微鏡顯微觀察并攝影。

1.2.5RT-PCR法檢測肝組織中CD28和CD137mRNA表達(dá)水平向1 mL玻璃勻漿器中加入收集到的肝組織和1 mL Trizol 提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR反應(yīng)體系為20 μL(SybrGreen mix 10 μL，ROX 0.4 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，cDNA模版2.0 μL，ddH2O 6.4 μL)設(shè)定條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，再72 ℃平衡10 min，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。所有基因引物由美國通用生物公司設(shè)計(jì)并合成，具體序列如下：CD28上游：5′-AGG CTC CTG CAC AGT GAC TA-3′，CD28下游：5′-GAG CGA TAG GCT GCG AAG-3′，產(chǎn)物長度107 bp。CD137上游：5′-TGC TTG TGA ATG GGA CGA AGG AGA-3′，CD137下游：5′-AGA AAC GGA GCG TGA GGA AGA ACA-3′，產(chǎn)物長度195 bp。GAPDh上游：5′-CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA-3′；GAPDh下游：5′-TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA-3′，產(chǎn)物長度106 bp。

1.2.6Western blot法檢測肝組織中CD28和CD137蛋白表達(dá)水平向1 mL玻璃勻漿器中加入收集到的肝組織和100 μL蛋白裂解液，研磨提取組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度。95 ℃ 5 min后上樣，10%SDS-PAGE凝膠中電泳，再轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，封閉液封閉2 h。孵一抗4 ℃，過夜，TBS-Tween20緩沖液洗3×10 min，孵二抗37 ℃，2 h，TBS-Tween20緩沖液洗3×10 min。加曝光液在Bio-Rad凝膠成像儀上成像并分析。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用方差分析和q檢驗(yàn)及多個(gè)樣本比較的秩和檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1對照組和不同程度CHB患者血清中CD137L表達(dá)水平比較中度和重度組CHB患者血清CD137L表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05和P<0.01)，重度組CHB患者血清CD137L表達(dá)水平亦明顯高于輕度和中度組(P<0.01)，而對照組和輕度組CHB患者血清CD137L表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

q檢驗(yàn)：與對照組比較*P<0.05,**P<0.01；與輕度組比較△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

2.2對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28 mRNA和CD137 mRNA表達(dá)水平比較中度和重度組CHB患者肝組織中CD28 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對照組及輕度組(P<0.01)。重度CHB組患者CD137 mRNA表達(dá)水平均較對照組、輕度CHB組和中度CHB組顯著升高(P<0.01)(見表2)。

表2對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28 mRNA和CD137 mRNA相對表達(dá)量比較

兩兩比較秩和檢驗(yàn)：與對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與輕度組比較△P<0.05，△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

2.3對照組和不同程度CHB患者肝組織中CD28和CD137蛋白表達(dá)水平比較中度和重度組CHB患者肝組織中CD28蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組及輕度組(P<0.01)。重度CHB組患者CD137蛋白表達(dá)水平均顯著高于對照組、輕度CHB組和中度CHB組(P<0.01)(見圖1、表3)。免疫熒光檢測CD137蛋白在重度CHB患者肝組織中的表達(dá)(見圖2)。

q檢驗(yàn)：與對照組比較**P<0.01；與輕度組比較△△P<0.01；與中度組比較##P<0.01

3　討論

HBV感染后對肝臟細(xì)胞造成的損害，并非由HBV自身直接所致，而是通過HBV誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞活化后產(chǎn)生的細(xì)胞免疫所致[9]，因此，T細(xì)胞的活化在CHB患者疾病發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮了重要作用。T細(xì)胞的活化需要雙重信號(hào)刺激，第一信號(hào)為T細(xì)胞接受抗原提呈細(xì)胞提供的抗原信號(hào)，第二信號(hào)則為淋巴細(xì)胞表面的共刺激分子，如CD28/B7和CD137/CD137L等[10]。本研究將CD28和CD137兩種共刺激分子進(jìn)行對比研究，探討它們與CHB患者肝臟病理損傷程度間的相關(guān)性。

本研究首先在CHB患者血清中檢測CD137L的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在中度和重度CHB患者血清中的表達(dá)均高于健康對照組(P<0.05和P<0.01)，但在輕度CHB組，患者血清中CD137L的表達(dá)與健康對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與既往報(bào)道[11]一致。提示在患者因HBV感染發(fā)展成為CHB的過程中，共刺激分子CD137L在其中發(fā)揮了一定作用，但其具體機(jī)制，還需更多的研究探討。

在CHB患者的血清中檢測到CD137L的變化后，研究了肝組織中CD137的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重度CHB組CD137的表達(dá)明顯高于健康對照組(P<0.01)，但輕度CHB組和中度CHB組變化不明顯。此外，較之對照組，CD28在中度CHB組和重度CHB組中的表達(dá)也明顯增高(P<0.01)，但輕度CHB組變化不明顯，與既往研究[7]一致。推測CHB患者肝臟組織中CD28和CD137的表達(dá)增加可能與機(jī)體的免疫狀態(tài)有關(guān)，在HBV早期侵入時(shí)，機(jī)體對病毒的清除力不強(qiáng)，T細(xì)胞活化數(shù)目較少，肝組織病理改變也輕，共刺激信號(hào)分子的表達(dá)則弱。隨著疾病的進(jìn)展，肝組織的病理改變加重，但對病毒的殺傷作用增強(qiáng)，活化的T細(xì)胞數(shù)目亦增加，此時(shí)共刺激分子CD28和CD137的表達(dá)也增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，中度CHB組和重度CHB組CD28表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但CD137在重度CHB組的表達(dá)則明顯高于中度CHB組(P<0.01)。這可能與二者在T細(xì)胞活化的不同時(shí)段發(fā)揮主要作用有關(guān)。雖然CD28和CD137同為第二信號(hào)，但CD28在靜止和活化的T細(xì)胞上都表達(dá)，而CD137主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞上。在重度CHB患者的肝組織中，機(jī)體對病毒的清除能力強(qiáng)，病理改變較重，活化的T細(xì)胞數(shù)目也較多，此時(shí)CD137的升高會(huì)更加顯著。同時(shí)，由于CD28是T細(xì)胞活化時(shí)表達(dá)最早的共刺激分子，而CD137則在T細(xì)胞活化晚期發(fā)揮主要作用，且CD137既可提供協(xié)同CD28的共刺激信號(hào)，也可提供不依賴于CD28共刺激分子的第二信號(hào)[13-14]。因此，在CHB患者肝臟組織病理改變的重度期，提供第二信號(hào)，活化T細(xì)胞的過程中，CD137較CD28起到了更加重要的作用[15-16]。

由于CHB患者在做肝臟穿刺術(shù)前多已接受過治療，且因個(gè)體化差異治療效果不一，因此本研究中所得結(jié)果是否穩(wěn)定可靠，仍需大批量的標(biāo)本證明。綜上所述，機(jī)體肝臟組織的免疫病理損傷程度加重，CD28和CD137的表達(dá)亦升高，重度時(shí)CD137的表達(dá)變化更加顯著，聯(lián)合檢測CD28和CD137能更準(zhǔn)確地判斷肝組織病理損傷程度，同時(shí)，這也為CHB的免疫治療提供新思路。

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(本文編輯劉璐)

Relationship between the CD137 expression and immunopathological injury degree of liver in patients with chronic hepatitis B

WANG Bo1,WU Jun-ying1,2,XU Chao3

(1.LabofClinicalLaboratoryDiagnostics,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030;2.DepartmentofLaboratoryMedicine,BengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233030;3.DepartmentofInfectiousDiseases,The123rdHospitalofPLA,BengbuAnhui233000,China)

Objective:To investigate the correlation of the expression of CD137 and immunopathological injury degree of liver in patients with chronic hepatitis B(CHB).Methods:The levels of CD137 in peripheral blood and liver tissue were measured by ELISA and immunofluorescent assay,respectively.The levels of the protein and mRNA expressions of CD137 and CD28 in liver tissue were detected using Western blot and qPCR,respectively.Results:The level of serum CD137 in severe CHB group was significantly higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).The expression levels of CD28 mRNA in liver tissue in moderate and severe CHB groups were higher than that in healthy control group and mild CHB group(P<0.01).The expression level of CD137 mRNA in liver tissue in severe CHB group was significantly higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).The expression levels of CD28 protein in liver tissue in moderate and severe CHB groups were higher than that in healthy control group and mild CHB group(P<0.01).The expression level of CD137 protein in liver tissue in severe CHB group was higher than that in healthy control group,mild and moderate CHB groups(P<0.01).Conclusions:The activation of CD137 involves in the immunopathological injury process of liver in CHB patients,and is related to the degree of liver.

chronic hepatitis B;CD137; immunopathological injury；liver injury

2015-10-28

安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2012A195)；蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃(byycx1408)

單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院1.臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，2.醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系,安徽 蚌埠 233030;3.中國人民解放軍第123醫(yī)院 傳染科,安徽 蚌埠 233000

[作者簡介] 王博(1989-)，男，碩士研究生.

吳俊英，碩士研究生導(dǎo)師，教授.E-mail：jywu@126.com

1000-2200(2016)09-1125-04

R 392.32

ADOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.09.002