高速逆流色譜法用于縱條紋炭角菌中過(guò)氧麥角甾醇的分離純化

黃　毅,雷傳文,宋　航,楊智芹,袁小紅,賀新生

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010;2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都 610065)

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高速逆流色譜法用于縱條紋炭角菌中過(guò)氧麥角甾醇的分離純化

黃毅1,2,雷傳文1,宋航2,楊智芹1,袁小紅1,賀新生1

(1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621010;2.四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都 610065)

過(guò)氧麥角甾醇生物活性多樣,具有較大開發(fā)價(jià)值,但傳統(tǒng)柱色譜分離手段步驟多效率低,本文建立了高速逆流色譜從縱條紋炭角菌中高效快速制備過(guò)氧麥角甾醇的方法。通過(guò)高效薄層色譜和高效液相色譜測(cè)定分配系數(shù),再利用高速逆流色譜考查了多個(gè)溶劑體系的分離效果,確定最佳溶劑體系為:正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比為3∶1∶2∶0.8)。以上相為固定相,下相為流動(dòng)相,轉(zhuǎn)速為800 r/min(正轉(zhuǎn)),流速為2 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。制備所得過(guò)氧麥角甾醇經(jīng)13C-NMR和1H-NMR鑒定,并經(jīng)高效液相色譜分析純度達(dá)到96.05%(峰面積歸一化法)。經(jīng)DPPH體外抗氧化活性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)該化合物在0.2 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基清除為28.36%,遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照抗壞血酸(93.41%),且量?jī)r(jià)關(guān)系也不明顯,表明其DPPH自由基清除能力較弱。該方法制備過(guò)氧麥角甾醇簡(jiǎn)便、快速,所得產(chǎn)物純度高,可用于縱條紋炭角菌中該化合物的分離。

過(guò)氧麥角甾醇,高速逆流色譜,縱條紋炭角菌,抗氧化活性

縱條紋炭角菌(XylariastriataPat. 1887),屬子囊菌門(Ascomycota),盤菌亞門(Pezizomycotina),糞殼菌綱(Sordariomycetes),炭角菌亞綱(Xylariomycetidae),炭角菌目(Xylariales),炭角菌科(Xylariaceae),炭角菌屬(XylariaHillex Schrank),原始標(biāo)本采自中國(guó)南京的棕櫚樹(Trachycarpusfortunei)樹干上[1]。文獻(xiàn)報(bào)道同屬的黑柄炭角菌具有改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)、造血、抗前列腺增生以及提高機(jī)體免疫等功能[2],目前已有醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)成功并上市銷售?；瘜W(xué)成分研究也發(fā)現(xiàn)同屬多種炭角菌中具有各種活性小分子[3-8]。本課題組于2012年在四川省綿陽(yáng)市重新發(fā)現(xiàn)該種后便開始對(duì)該菌展開系統(tǒng)性研究,先期完成了培養(yǎng)優(yōu)化工作[9-11]。在后續(xù)化合物分離工作中,筆者發(fā)現(xiàn)該菌含有較多的真菌標(biāo)識(shí)型化合物麥角甾醇,在HPLC跟蹤比對(duì)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了麥角甾醇的氧化物-過(guò)氧麥角甾醇(如圖1所示)也有較高含量。

圖1　過(guò)氧麥角甾醇結(jié)構(gòu)式Fig.1　The structural formula of ergosterol peroxide

過(guò)氧麥角甾醇(CAS:2061-64-5,C28H44O3)結(jié)構(gòu)比較特殊,在5,8位有過(guò)氧橋鍵,具有免疫抑制、抗炎、抗病毒、抗腫瘤和殺錐蟲等多種生理活性[12-16],具有較大開發(fā)價(jià)值。該化合物傳統(tǒng)獲取手段主要是柱色譜法,該法固相吸附嚴(yán)重,步驟多效率低。近年來(lái)迅速發(fā)展的高速逆流色譜(High-speed counter-current chromatography,簡(jiǎn)稱HSCCC)技術(shù),因其液-液分配機(jī)制,無(wú)固相載體,具有了分離效率高、樣品回收率高、適用范圍廣,可一步大劑量制備純品的優(yōu)點(diǎn),在生物醫(yī)藥、天然產(chǎn)物化學(xué)和食品等領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)豐富。為了尋找簡(jiǎn)單,高效的過(guò)氧麥角甾醇大量制備方法,本研究在參考麥角甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇等化合物高速逆流色譜分離方法的基礎(chǔ)上,建立了縱條紋炭角菌中該化合物的高速逆色譜分離純化法,并測(cè)試了純化的單體化合物過(guò)氧麥角甾醇的體外抗氧化活性。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

縱條紋炭角菌子實(shí)體,由西南科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供,培養(yǎng)方法見(jiàn)文獻(xiàn)[9]。經(jīng)自然風(fēng)干并于50 ℃烘干后,粉碎過(guò)100目篩備用。

TBE-300C高速逆流色譜儀(柱體積300 mL,進(jìn)樣環(huán)體積20 mL)和TBP5002型雙柱塞中壓恒流泵上海同田生物技術(shù)有限公司;UV2000D逆流色譜專用紫外檢測(cè)器上海三為科學(xué)儀器有限公司;1260型高效液相色譜儀,Zorbax Eclipse XDB C-18分析柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)美國(guó)安捷倫科技公司;LX-300型冷卻水循環(huán)機(jī)北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司;R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士步琪公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;Bruker 600 MHz核磁共振儀美國(guó)布魯克科技有限公司。

高速逆流色譜用分析純乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正己烷等成都科龍化試有限公司;高效液相色譜用色譜純甲醇美國(guó)Fisher公司。高效薄層色譜GF254硅膠板煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司;過(guò)氧麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(純度96.0%)云南西力生物技術(shù)股份有限公司;水為實(shí)驗(yàn)室制超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)樣及樣品制備對(duì)照品溶液制備:精密稱取過(guò)氧麥角甾醇對(duì)照品5.0 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容即得對(duì)照品溶液(0.5 mg/mL),置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆?可穩(wěn)定放置2周。

樣品制備:38 g子實(shí)體粉末,按固液比5∶1加入無(wú)水乙醇避光冷浸提取5次,每次24 h,濾液合并后經(jīng)55 ℃減壓旋干得黑色醇提浸膏1.71 g。

1.2.2分配系數(shù)測(cè)定及分離條件篩選將各種備選溶劑按比例配好,靜止分層后,用已經(jīng)分配平衡的下相溶解少量樣品,過(guò)濾除去不溶物,加入等體積的上相,劇烈振搖后靜置,待上相與下相分層后,對(duì)兩相溶劑中的過(guò)氧麥角甾醇含量進(jìn)行測(cè)定,即可計(jì)算分配系數(shù)K=CS/CM(CS-目標(biāo)成分在固定相中的濃度,CM-目標(biāo)成分在流動(dòng)相中的濃度)。

實(shí)驗(yàn)中采用高效薄層色譜(HPTLC)和高效液相色譜(HPLC)兩種方式進(jìn)行含量測(cè)定。HPTLC方法:微量進(jìn)樣針定量點(diǎn)樣,展開劑為石油醚∶乙酸乙酯=5∶1,凝鉬酸顯色并拍照,使用ImageJ比色軟件進(jìn)行色度比較,色度深淺代表濃度;HPLC方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[17]中麥角甾醇的方法且略作修改:色譜柱為Zorbax Eclipse XDB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為純甲醇,流速1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm,柱溫25 ℃。

1.2.3固相保留率的測(cè)定對(duì)篩選出的分離體系還需進(jìn)行固相保留率評(píng)價(jià),方法是以850 r/min的轉(zhuǎn)速正向旋轉(zhuǎn)已被上相充滿管路的主機(jī),同時(shí)以10 mL/min的流速往分離管路內(nèi)泵入流動(dòng)相,當(dāng)主機(jī)出柱口管路流出流動(dòng)相后,螺旋柱內(nèi)固定相和流動(dòng)相達(dá)到動(dòng)力學(xué)平衡,此時(shí)量出被流動(dòng)相推出的上相體積(V出),按以下公式計(jì)算固相保留率,保留率≥50%的溶劑體系方可在分離中使用。

式中:V總-管路總體積,V出-流動(dòng)相推出上相體積,V環(huán)-進(jìn)樣環(huán)的體積。

1.2.4高速逆流色譜分離樣品確定優(yōu)選體系后,首先按體積比配制溶劑,分液漏斗中低溫(4 ℃)靜止過(guò)夜后分離上下相。上相(固定相)和下相(流動(dòng)相)均超聲波脫氣處理20 min。高速逆流色譜儀開機(jī)恒溫預(yù)熱15min后，先將固定相以10mL/min恒速度泵滿螺旋管柱，開啟速度控制器，使高速逆流色譜儀螺旋管柱按順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)并達(dá)到800 r /min，再以2 mL/min 泵入流動(dòng)相，待流動(dòng)相流出分離柱時(shí)，六通閥進(jìn)樣品(樣品需由固定相∶流動(dòng)相=1∶1比例溶液超聲溶解并經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾),同時(shí)開啟檢測(cè)器,以220 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)出峰情況進(jìn)行收集。

表1　HSCCC分離過(guò)氧麥角甾醇的5種溶劑系統(tǒng)

1.2.5過(guò)氧麥角甾醇DPPH自由基清除測(cè)定現(xiàn)有體外抗氧活性評(píng)測(cè)方法中,DPPH法穩(wěn)定性好,靈敏度高且簡(jiǎn)便快捷[18],因此本文采用DPPH自由基清除法評(píng)價(jià)過(guò)氧麥角甾醇抗氧化活性。參照Marsdens Blois的文獻(xiàn)[19],以無(wú)水乙醇為溶劑,將過(guò)氧麥角甾醇單體化合物配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的樣品溶液。分別取2 mL樣品溶液,加入2.0 mL 0.05 mg/mL的DPPH無(wú)水乙醇溶液?；靹蚝笫覝乇芄夥胖?0 min,以無(wú)水乙醇為參比,分別測(cè)定其在517 nm處的吸光度值,抗壞血酸(維生素C)作為陽(yáng)性對(duì)照,計(jì)算過(guò)氧麥角甾醇對(duì)DPPH自由基的清除能力,計(jì)算公式為DPPH自由基清除率(%)=(A空白-A樣品)/A空白×100,式中A空白代表未加樣品的DPPH溶液的吸光度值,A樣品代表加入樣品反應(yīng)后的樣品的DPPH溶液的吸光度值,實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次,取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1HSCCC分離體系的篩選

樣品成分的分配系數(shù)K值和螺旋管柱中固定相的保留值是分離系統(tǒng)篩選的兩個(gè)關(guān)鍵因素。K值應(yīng)該在0.5～2,固定相保留率需大于50%。文獻(xiàn)[20]曾報(bào)道分離麥角甾醇使用含水體系正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(體積比為6∶1.7∶6∶0.3)體系獲得滿意效果,因過(guò)氧麥角甾醇在HPLC反相色譜上早于麥角甾醇出峰,極性大于麥角甾醇,因此推測(cè)使用含水體系應(yīng)該可行?；谝陨项A(yù)實(shí)驗(yàn)和推斷,筆者考察了表1中5種溶劑體系。

由上表可知,溶劑體系①分配系數(shù)太大,分離將非常耗時(shí)。溶劑體系②分配系數(shù)適宜,但保留率較低(45%),且分離時(shí)過(guò)氧麥角甾醇與其他雜質(zhì)的分離度較低,該法雖與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致,但卻無(wú)法適用本研究所述樣品,說(shuō)明不同的樣品中化合物種類不同,相同分離條件可能不適用。溶劑體系③分配系數(shù)合適,分離效果也不錯(cuò),固定相保留率達(dá)到了63%,是個(gè)不錯(cuò)的候選體系。通過(guò)將溶劑體系③中的甲醇換為乙醇后,在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)溶劑體系④和⑤均有較高的固定相保留率(≥75%),且隨著體系中乙酸乙酯含量的減少,分配系數(shù)逐漸增大。對(duì)于溶劑體系⑤,HPLC測(cè)定分配系數(shù)為1.28,固定相保留率達(dá)到82%,且分離度較好,最終確定采用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(體積比為3∶1∶2∶0.8)溶劑體系分離樣品。實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)比了HPLC和HPTLC測(cè)定的分配系數(shù)K值,發(fā)現(xiàn)兩者相關(guān)性很好,說(shuō)明在分配系數(shù)測(cè)試時(shí),HPTLC可替代HPLC。

2.2過(guò)氧麥角甾醇的HSCCC的分離

根據(jù)2.1中篩選出的溶劑體系,按照1.2.4所述方法進(jìn)行分離。將500 mg樣品超聲溶解于20 mL等體積上下相中,進(jìn)樣進(jìn)行HSCCC分離,得到高速逆流色譜分離圖2a,根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果收集流份A(保留時(shí)間為134 min),旋干回收再次用旋干品重復(fù)該分離流程,得到高速逆流色譜分離圖2b,截取流份B部分合并旋干,最終得到過(guò)氧麥角甾醇34 mg。

圖2　HSCCC分離色譜圖Fig.2　The separation chromatogram of HSCCC注：a為第一次分離,b為A流份回收后第二次分離。

2.3HSCCC分離成分的純度檢測(cè)及鑒定

參照1.2.2中HPLC法對(duì)制備得到的樣品進(jìn)行純度分析,出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致,采用峰面積歸一化法,計(jì)算分離得到的過(guò)氧麥角甾醇純度為96.05%(圖3)。并通過(guò)13C-NMR和1H-NMR檢測(cè)得到數(shù)據(jù)如下:13C-NMR(CDCl3,125 MHz):δ135.5(CH,C-6),135.3(CH,C-22),132.3(CH,C-23),130.8(CH,C-7),82.3(C,COOC),79.5(C,COOC),66.4(CH,C-3),56.3(CH,C-17),51.6(CH,C-14),51.2(CH,C-9),44.7(C,C-13),42.7(CH,C-24),39.7(CH,C-20),39.3(CH2,C-12),36.9(C,C-10,and CH2,C-4),34.7(CH2,C-1),33.0(CH,C-25),30.1(CH2,C-2),28.6(CH2,C-16),23.3(CH2,C-15),20.8(CH3,C-21),20.6(CH2,C-11),19.9(CH3,C-26),19.6(CH3,C-27),18.1(CH3,C-19),17.5(CH3,C-28),12.8(CH3,C-18)。1H-NMR(CDCl3,600 MHz):δ0.72(3H,s,H-18),0.78(3H,d,J=6.5 Hz,H-26),0.82(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.85(3H,s,H-19),0.87(3H,d,J=6.7 Hz,H-28),0.96(3H,d,J=6.7Hz,H-21),3.94(1H,m,H-3),5.12(1H,dd,J=8.1,15.1 Hz,H-22),5.17(1H,dd,J=7.7,15.1 Hz,H-23),6.22(1H,d,J=8.1 Hz,H-7),6.47(1H,d,J=8.3 Hz,H-6)。數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致,確定該化合物為過(guò)氧麥角甾醇。

表2　過(guò)氧麥角甾醇,抗壞血酸的DPPH自由基抗氧化能力

注:±代表三次實(shí)驗(yàn)平均值范圍。

圖3　過(guò)氧麥角甾醇HPLC檢測(cè)結(jié)果圖Fig.3　The chromatogram of ergosterol peroxide

2.4過(guò)氧麥角甾醇DPPH自由基清除能力

由表2可知,相比抗壞血酸,過(guò)氧麥角甾醇的自由基清除能力不強(qiáng),伴隨著溶液濃度的增加,其對(duì) DPPH 自由基的清除能力并未見(jiàn)明顯提高,量效關(guān)系也不明顯,這可能和它整體結(jié)構(gòu)中羥基占比較少有關(guān),因此,基本可判斷該化合物DPPH自由基清除能力較弱。

3　結(jié)論與討論

高速逆流色譜法已廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離,其設(shè)備模塊包括高速逆流色譜主機(jī),分配系數(shù)K值測(cè)定用高效液相色譜兩個(gè)主要設(shè)備。本文嘗試了HPTLC+拍照+ImageJ比色軟件比對(duì)計(jì)算分配系數(shù)的方案,發(fā)現(xiàn)其與HPLC測(cè)定數(shù)值非常相近,鑒于薄層色譜的展開劑、檢測(cè)方法多樣性,以及快捷和廉價(jià)性的特點(diǎn),利用薄層掃描搭配HSCCC不失為一種重要的替代方案,只要規(guī)范操作細(xì)節(jié),一定有較大的應(yīng)用空間。

實(shí)驗(yàn)中還調(diào)查了轉(zhuǎn)速,流動(dòng)相流速和柱溫對(duì)分離效果的影響,得出最優(yōu)分離條件是 2 mL/min 流速,800 r/min 轉(zhuǎn)速,柱溫為 25 ℃。在正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水(3∶1∶2∶0.8)四元溶劑體系系統(tǒng)上,通過(guò)兩次操作可實(shí)現(xiàn)縱條紋炭角菌乙醇提物中過(guò)氧麥角甾醇的快速分離,方法相比柱色譜法簡(jiǎn)便且無(wú)樣品吸附損失,效率更高,可以作為一種新的分離純化方法,在真菌及其代謝產(chǎn)物的生物活性物質(zhì)制備中推廣應(yīng)用。

由于真菌種類及生活環(huán)境分布廣泛,其次生代謝產(chǎn)物非常多樣,其中不乏價(jià)值巨大的化合物。且相對(duì)于植物,真菌因其可發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn),實(shí)際開發(fā)應(yīng)用價(jià)值可能更巨大。因此真菌發(fā)酵搭配HSCCC可能成為高價(jià)值次生代謝產(chǎn)物的重要工業(yè)化生產(chǎn)手段。伴隨著HSCCC的大型化設(shè)備和配套的逐漸成熟,該方向可能成為天然產(chǎn)物生產(chǎn)的重要途徑。

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Isolation and purification of ergosterol peroxide fromXylariaStriataby high-speed counter-current chromatography

HUANG Yi1,2,LEI Chuan-wen1,SONG Hang2,YANG Zhi-qin1,YUAN Xiao-hong1,HE Xin-sheng1

(1.School of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010,China; 2.Department of Pharmaceutical and Biological Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

Due to the various bio-activities,Ergosterol peroxide presents great application value. The column chromatography is the most commonly methods used in separation of this compound. However,sample loss caused by irreversible adsorption is very uneconomical and biggest challenges in industrial application. In present work,an effective and rapid high-speed counter-current chromatography(HSCCC)method for isolating and purifying ergosterol peroxide fromXylariaStriatahas been developed. After using HPTLC and HPLC to determinate the partition coefficient,the isolation efficiency of different solvent systems was observed. The result showed that the solvent system composed of n-hexane,ethyl acetate,ethanol and water(3∶1∶2∶0.8,v∶v∶v∶v)was the best,the lower phase was used as the mobile phase and performed at a flow rate of 2 mL/min,while the apparatus rotated at 800 r/min,and detected at 220 nm. The prepared ergosterol peroxide was identified by13C-NMR and1H-NMR. Its purity was 96.05% analyzed by high performance liquid chromatography. And the antioxidant potential of ergosterol peroxide was also investigated by the method of DPPH radical scavenging activity. Results revealed that ergosterol peroxide showed weaker DPPH radical scavenging activity(28.36%)at the concentration of 0.2 mg/mL compared with standard compound ascorbic acid(93.41%). The dose dependent was not observed also explained its weak DPPH radical scavenging activity. The established method was quite simple,fast,and suitable for the large-scale isolation and separation of ergosterol peroxide fromXylariaStriata.

Ergosterol peroxide;high-speed counter-current chromatography;XylariaStriata;antioxidant potential

2016-03-18

黃毅(1979-)，男，博士，講師，研究方向：真菌天然產(chǎn)物開發(fā)，E-mail:huangyi@swust.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21272189)；四川省苗子工程項(xiàng)目(2015RZ0015)；西南科技大學(xué)創(chuàng)新基金(CX14-041)；西南科技大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(15ycx090)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)17-0262-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.17.043