豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及莢膜血清分型

林星宇，胡　凌，王　印，*，楊澤曉，姚學(xué)萍，肖　璐，任梅滲，曾相杰

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

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豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及莢膜血清分型

林星宇1，2，胡凌1，王印1，2，*，楊澤曉1，姚學(xué)萍1，肖璐1，任梅滲1，曾相杰1

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

為了解各血清型的多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)在四川、重慶、云南的流行情況，對2013—2014年間四川、重慶、云南等地8個規(guī)?；B(yǎng)殖場的125份病死豬肺炎樣品進(jìn)行細(xì)菌分離，并用PCR方法對分離的多殺性巴氏桿菌進(jìn)行鑒定及莢膜血清分型。結(jié)果表明：從有肺炎癥狀病死豬的肺臟樣品中共分離出11株多殺性巴氏桿菌，其中有7株為A血清型(63.6%)，3株為D血清型(27.3%)，1株為F血清型(9.1%)，沒有發(fā)現(xiàn)B和E血清型。表明在該區(qū)域內(nèi)，豬肺疫主要是由A型Pm感染引起。另外，此次還分離出了1株較少見的F型多殺性巴氏桿菌。該結(jié)果可為上述地區(qū)巴氏桿菌病的防治提供科學(xué)材料。

豬；多殺性巴氏桿菌；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；血清分型

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)是引起多種畜禽巴氏桿菌病的病原體，主要引起動物出血性敗血癥或傳染性肺炎。該菌廣泛分布于世界各地，在同種或不同動物間可相互傳染，也可感染人[1]。豬巴氏桿菌病又稱豬肺疫或豬出血性敗血癥，是豬的一種急性、熱性傳染病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，我國將其劃分為二類動物疫病[2]。有研究報道多殺性巴氏桿菌的莢膜具有保護(hù)細(xì)菌的功能，可以抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬及中和抗體，對宿主具有侵襲力，從而被視為多殺性巴氏桿菌重要的毒力因子[3]。Carter等[4]根據(jù)莢膜抗原的不同將多殺性巴氏桿菌分為A，B，D，E和F等5個血清型。以往，在我國主要流行的豬源多殺性巴氏桿菌為A，B和D型，沒有E型和F型的報道[5-7]。由于巴氏桿菌的莢膜血清型決定其免疫原性，而各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低，導(dǎo)致疫苗免疫效果不理想[8]，因此疫苗的研發(fā)需要以多殺性巴氏桿菌的流行情況為依據(jù)。本研究從四川及周邊重慶、云南等地8個規(guī)?；B(yǎng)豬場采集病死豬肺臟樣本，對豬源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行分離鑒定及莢膜血清分型，以期為巴氏桿菌病的防治提供科學(xué)材料。

1　材料與方法

1.1樣品來源

125份樣本來自四川省(103份)及其周邊重慶(15份)、云南(7份)的8個規(guī)模化養(yǎng)殖場送檢的表現(xiàn)有疑似呼吸系統(tǒng)疾病癥狀的病死豬肺組織樣品。

1.2主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，抗菌藥物藥敏紙片及微量生化反應(yīng)管購自杭州微生物試劑有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、DNA純化回收試劑盒等購自天根生化科技(北京)有限公司；T-Vector pMD19(Simple)載體購自寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3Pm的分離及初步鑒定

無菌采取疑似多殺性巴氏桿菌病料肺臟組織，畫線接種于胰蛋白大豆瓊脂(tryptic soy agar， TSA)平板，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察，對在平板上長有灰白色、光滑、濕潤的菌落進(jìn)行革蘭氏及瑞氏染色。革蘭氏染色呈陰性細(xì)小桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染的細(xì)菌為可疑菌落，將可疑菌株純化后接種于麥康凱瓊脂平板，并采用微量生化反應(yīng)管對其做生化鑒定。

1.4PCR鑒定

PCR引物參考Townsend等[9]鑒定Pm種的特異性基因Kmt，設(shè)計引物Kmt-1，Kmt-2對疑似為Pm的菌落進(jìn)行PCR鑒定。Kmt-1：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′；Kmt-2： 5′-CTGTAAACGAACTCGCCACTT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為456 bp，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.1PCR模板

用接種環(huán)挑取單菌落，懸浮于含50 μL無菌雙蒸水的離心管中，100 ℃水浴5～10 min后，迅速置于冰上冷卻5 min，12 000g離心3 min，上清即為PCR模板。

1.4.2PCR反應(yīng)體系

2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·μL-1)各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，加雙蒸水補(bǔ)足25 μL。

1.4.3PCR反應(yīng)條件

PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物4 ℃短暫保存。

1.4.4PCR結(jié)果觀察

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.4.5PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

任意挑選一株P(guān)CR陽性產(chǎn)物回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，搖床培養(yǎng)，將鑒定陽性的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.5PCR分型

參考Townsend等[9]關(guān)于A，B，D，E，F(xiàn)莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC，bcbD，dcbF，ecbJ，fcbD設(shè)計引物Pm A，Pm B，Pm D，Pm E，Pm F。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表1)。

表1不同引物的核苷酸序列

Table 1Nucleotide sequences of primers

引物引物序列(5’—3’)擴(kuò)增片段大小/bpPmA1TGCCAAAATCGCAGTCAG1044PmA2TTGCCATCATTGTCAGTGPmB1CATTTATCCAAGCTCCACC760PmB2GCCCGAGAGTTTCAATCCPmD1TTACAAAAGAAAGACTAG-GAGCCCC657PmD2CATCTACCCACTCAACCATAT-CAGPmE1TCCGCAGAAAATTATTGACTC511PmE2GCTTGCTGCTTGATTTTGTCPmF1AATCGGAGAACGCAGAAATCAG852PmF2TTCCGCCGTCAATTACTCTG

用接種環(huán)挑取單菌落，懸浮于含50 μL無菌ddH2O的離心管中，100 ℃水浴5～10 min后，迅速置于冰上冷卻5 min，12 000g離心3 min，上清即為PCR模板。莢膜血清分型采用多重PCR，反應(yīng)體系(25 μL)為2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，DNA模板2.0 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s， 55 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min，30個循環(huán)； 72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g·L-1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1Pm的初步鑒定

凡是在麥康凱瓊脂平板上不生長，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖，不能發(fā)酵乳糖、阿拉伯糖、吲哚，硝酸鹽還原試驗陽性，甲基紅、石蕊、枸櫞酸鹽利用試驗陰性者，初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。結(jié)果顯示：從125份肺臟樣品中共分離出11株多殺性巴氏桿菌，分離率為8.8%。

2.2PCR鑒定

以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用鑒定引物Kmt進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在250～500 bp之間有一特異性片段，與預(yù)期的長度456 bp相符(圖1)。

2.3PCR分型結(jié)果

以細(xì)菌基因組DNA為模板，經(jīng)多重PCR進(jìn)行莢膜血清分型，結(jié)果顯示，有1株為F血清型，占9.1%；7株為A血清型，占63.6%；3株為D血清型，占27.3%(圖2)；本試驗沒有發(fā)現(xiàn)B和E血清型菌株。

M: DNA分子量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-11： 分離菌株；12： 陰性對照。圖1　分離菌株P(guān)CR種屬鑒定Fig.1　PCR identification of the isolated strains

M: DNA分子量質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1: F型多殺性巴氏桿菌；2-8: A型多殺性巴氏桿菌；9-11: D型多殺性巴氏桿菌；12：陰性對照。圖2　分離菌株P(guān)CR分型Fig.2　PCR typing of the isolated strains

2.4基因克隆的測序分析

將F型巴氏桿菌的PCR陽性產(chǎn)物回收，連接到pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，將鑒定陽性的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序?？寺〉腒mt基因片段測序結(jié)果表明，其全長為456 bp。Blast結(jié)果顯示其與GenBank中的多殺性巴氏桿菌特異性基因Kmt核酸序列(登錄號為CP004392.1)同源性為99.3%(GenBank中的登錄號為KP222299)。對克隆的fcbD基因片段測序結(jié)果表明，它與F型特異性基因fcbD序列(登錄號為AY604234.1)的同源性為99.9%(GenBank中的登錄號為KP205386)。基因序列比對結(jié)果顯示其在第577位有1個堿基發(fā)生突變，由A→G(圖3)。

3　討論

多殺性巴氏桿菌廣泛存在于正常豬的上呼吸道、扁桃體等器官和組織中，因而豬群多殺性巴氏桿菌的帶菌率與豬群是否發(fā)生豬巴氏桿菌病并無直接關(guān)系[10]。一般認(rèn)為動物在發(fā)病前已經(jīng)帶菌，當(dāng)各種誘因使畜禽機(jī)體抵抗力降低時，病原菌即可乘虛侵入體內(nèi)，經(jīng)淋巴液而入血流，發(fā)生內(nèi)源性感染[2]。因此，本研究以發(fā)病豬的肺臟為主要病料，這在一定程度上代表了導(dǎo)致豬發(fā)生巴氏桿菌病的病原情況。本研究對四川及周邊省份送檢的125份肺組織樣本進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，并采用了Townsend等[9]建立的PCR方法對多殺性巴氏桿菌進(jìn)行鑒定及莢膜血清分型，該PCR方法是一種快速、可靠和準(zhǔn)確的鑒定多殺性巴氏桿菌及莢膜血清的方法，且已得到國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)同，可以保證分離的準(zhǔn)確性。

圖3　同源性比對結(jié)果Fig.3　Result of homology alignment

多殺性巴氏桿菌是豬的一種主要細(xì)菌性病原之一， 該菌各血清型菌株的流行性存在較大差異， 具有明顯的地方性特征。2005年唐先春等[6]報道從肺炎癥狀豬分離的Pm有16.7%(4/24)為A型，75%(18/24)為D型，4.2%(1/24)為B型。2003年Davies等[11]報道從肺炎癥狀豬分離的Pm有81%(101/125)為A型，16%(20/125)為D型，1%(2/125)為F型。2011年Garcia等[12]報道從肺炎癥狀豬分離的Pm有83.5%(122/146)為A型，15.7%(23/146)為D型，0.7%(1/146)為F型。本研究在2013—2014年從四川及周邊地區(qū)125份肺炎病料中，共分離出11株多殺性巴氏桿菌，其中7株為A血清型(63.6%)，3株為D血清型(27.3%)，1株為F血清型(9.1%)，沒有發(fā)現(xiàn)B和E血清型。結(jié)果表明，在該區(qū)域引起肺炎癥狀的Pm主要由A型Pm感染引起。值得一提的是，以往國內(nèi)畜禽流行的多殺性巴氏桿菌莢膜血清型主要是A，B和D型，而本研究分離鑒定了1株極少見的豬源F型多殺性巴氏桿菌。關(guān)于該F型巴氏桿菌分離株導(dǎo)致仔豬發(fā)病死亡的原因，有以下3種可能：第1種可能是這批仔豬未接種疫苗。因為有研究表明莢膜血清A型與莢膜血清F型有緊密的聯(lián)系，推測其可能有相似的外膜蛋白，導(dǎo)致這兩個血清型之間有一定程度上的交叉免疫保護(hù)作用[9]，因此以往接種了A型巴氏桿菌疫苗的仔豬產(chǎn)生的抗體，可能在抵御A型巴氏桿菌感染同時，也抵御了一些F型巴氏桿菌的感染。因而很少有F型巴氏桿菌引起仔豬發(fā)病病例的報道。第2種可能是由于基因突變引起該菌株毒力的改變，我們對這株F型巴氏桿菌fcbD基因的測序分析，顯示其在第577位有1個堿基發(fā)生突變，由A→G，氨基酸序列由H→R。第3種可能是F型巴氏桿菌是由其他動物宿主傳染給仔豬，并導(dǎo)致其發(fā)病的[13]。至于該F型多殺性巴氏桿菌引起仔豬發(fā)病的具體原因，還需進(jìn)一步研究。

目前，疫苗免疫仍是控制巴氏桿菌病的最重要措施之一，且已有多種多殺性巴氏桿菌疫苗商品化。由于莢膜血清型決定多殺性巴氏桿菌的免疫原性，而各血清型之間交叉免疫保護(hù)性較低，因此疫苗免疫后取得的預(yù)防效果并不理想[8]。本研究通過常規(guī)方法對豬源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了分離鑒定和莢膜血清分型，為豬巴氏桿菌病防治及相關(guān)研究提供了科學(xué)材料。

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(責(zé)任編輯盧福莊)

Isolation， identification and capsule serotyping of Pasteurella multocida originated from swine

LIN Xing-yu1，2， HU Ling1， WANG Yin1，2，*， YANG Ze-xiao1， YAO Xue-ping1， XIAO-Lu1， REN Mei-shen1， ZENG Xiang-jie1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China; 2.KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince，Chengdu611130，China)

To investigate the serotypes ofPasteurellamultocidain Sichuan， Chongqing and Yunnan， a total of 125 tissue samples were collected from intensive piggery during 2013 to 2014. PCR was performed to identify the isolatedPasteurellamultocidaand separate their capsular serotyping. It was shown that 11 strains ofPasteurellamultocidawere isolated from the lung tissues of swine. PCR typing assay indicated that 7 strains were serotype A (63.6%)， 3 strains were serotype D (27.3%)， 1 strain was serotype F (9.1%)， the serotype B and serotype E were not found. It suggested that swine lung plague was mainly caused by serotype APasteurellamultocidain these areas. In addition， a rare serotype F was isolated from the collected swine lung tissues. These results would provide scientific basis for the prevention and treatment ofPasteurellamultocida in above areas.

swine;Pasteurellamultocida; PCR; serotyping

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.03

2015-09-22

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2013BAD12B04)

林星宇(1990—)，男，四川自貢人，碩士研究生，研究方向為動物傳染病病原分子生物學(xué)。E-mail：yaanlinxingyu@163.com

，王印，E-mail：yaanwangyin@tom.com

S855.1

A

1004-1524(2016)04-0558-05

林星宇，胡凌，王印，等. 豬源多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及莢膜血清分型[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2016，28(4): 558-562.