農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的影響因素及應(yīng)用研究進(jìn)展

趙小強(qiáng)，牛曉偉，范 敏

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

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農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的影響因素及應(yīng)用研究進(jìn)展

趙小強(qiáng)，牛曉偉，范 敏

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是西瓜基因工程的常用方法。在介紹農(nóng)桿菌介導(dǎo)西瓜遺傳轉(zhuǎn)化影響因素和西瓜轉(zhuǎn)基因應(yīng)用的基礎(chǔ)上，主要分析了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)西瓜轉(zhuǎn)化效率的重要因素，包括農(nóng)桿菌菌株和載體類型、無菌苗苗齡、外植體類型、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、農(nóng)桿菌侵染濃度和時(shí)間、抗生素的種類和濃度及乙酰丁香酮等，同時(shí)總結(jié)了西瓜轉(zhuǎn)基因研究的多種應(yīng)用價(jià)值及研究成果。

西瓜；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；遺傳轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化效率

西瓜[Citrulluslanatus(Thunb.) Matsum & Nakai]是重要的世界性水果，其食用價(jià)值及保健價(jià)值較高，在全球十大果品中位居第5位。2013年，中國西瓜種植面積約為1.83×106hm2，總產(chǎn)量約為7.29×107t，面積和產(chǎn)量分別占世界的54%和60%以上，均居世界第一位[1]。雖然目前市場(chǎng)上西瓜品種類型較多，但兼顧品質(zhì)優(yōu)、抗性好和產(chǎn)量高等特性的優(yōu)質(zhì)品種較少。因此，培育優(yōu)質(zhì)西瓜品種是提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的前提。由于西瓜種質(zhì)資源缺乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，利用常規(guī)育種選育新品種較為困難，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有投入成本低、轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)低、插入片段確定性好、轉(zhuǎn)基因表達(dá)和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。因此，利用基因工程技術(shù)手段進(jìn)行種質(zhì)創(chuàng)新，培育優(yōu)質(zhì)和高產(chǎn)的新品種已成為當(dāng)前西瓜遺傳育種研究的熱點(diǎn)。

西瓜轉(zhuǎn)基因研究中常用的遺傳轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但由于影響因素較多，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低，到目前為止還沒有一套高效適用的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系。本文在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上，總結(jié)并分析了影響西瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要因素，以及西瓜轉(zhuǎn)化研究的應(yīng)用，為建立并獲得高效的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系提供參考。

1 影響西瓜遺傳轉(zhuǎn)化率的因素

1.1 農(nóng)桿菌菌株與載體的類型

菌株和載體的選擇與組合在西瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究中較為重要，對(duì)同一植物而言，不同菌株的敏感性也不同，選擇受體植物敏感的菌株是轉(zhuǎn)化成功的重要因素之一。常用于西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株有LBA4404，EHA101，EHA105，AGL1，A208SE，GV3111SE和EHA101等，實(shí)際操作中不同的研究者采用的菌株有所不同，大部分研究者選用LBA4404[2-9]。張志忠等[10]研究表明，農(nóng)桿菌菌株EHA105的侵染能力明顯優(yōu)于LBA4404和AGL-1。Cho等[11]研究表明，農(nóng)桿菌菌株EHA101的侵染能力高于GV3101和LBA4404。

常用于西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的植物表達(dá)載體有pBI121，pBin19和pPM7等。Ellul等[4]研究表明，植物表達(dá)載體pBI121和pPM7對(duì)西瓜品種Dulce Maravilla的遺傳轉(zhuǎn)化效率較低，分別為5.3%和4.7%。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來看，LBA4404和pBI121是適宜西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株和載體。

1.2 西瓜基因型

西瓜的再生和轉(zhuǎn)化均受基因型的影響，不同基因型西瓜在相同濃度激素條件下，再生率和轉(zhuǎn)化率差異較大。Ellul等[4]研究表明，Sugar Baby，Crimson Sweet和Dulce Maravilla三個(gè)品種在相同的培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)化效率分別為0.6%，3.1%和5.3%。Yu等[8]研究了在相同培養(yǎng)條件下，F(xiàn)eeling，China baby和Quality這3個(gè)不同基因型的西瓜轉(zhuǎn)化效率的差異，結(jié)果表明，F(xiàn)eeling轉(zhuǎn)化效率最高為10%，China baby轉(zhuǎn)化率為2.1%，而Quality僅為1.0%。同樣，Huang等[7]也研究了Feeling，China baby和Quality轉(zhuǎn)基因后代PCR陽性率，分別為7.03%，2.2%和1.25%。因此，在具體研究過程中要根據(jù)基因型的不同選擇不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及轉(zhuǎn)化條件，以獲得最佳的轉(zhuǎn)化體系。

1.3 無菌苗苗齡

苗齡是影響誘導(dǎo)不定芽高頻再生的重要因素之一。苗齡決定著西瓜的生理狀態(tài)，苗齡太大會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)化程度增強(qiáng)，太小則易受農(nóng)桿菌的毒害，因此苗齡過大或過小都會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。大多數(shù)研究表明，苗齡5 d的西瓜子葉是誘導(dǎo)不定芽的最佳外植體[2，6，12-15]，然而，也有其他研究認(rèn)為苗齡2[3，16]，3[4，8，17-19]，7[7，20]和7～10 d[11，21]的西瓜子葉是誘導(dǎo)不定芽的最佳外植體。張志忠等[22]認(rèn)為，培養(yǎng)條件和基因型等差異會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)育快慢不同，因此不宜以天數(shù)來確定苗齡，而以子葉顏色判斷更有效，無菌苗子葉淺綠色時(shí)不定芽誘導(dǎo)率最高，深綠色時(shí)不定芽誘導(dǎo)率明顯下降，因此，作者認(rèn)為子葉生長(zhǎng)發(fā)育的生理狀態(tài)是造成上述現(xiàn)象的關(guān)鍵因素，而影響子葉發(fā)育的可能因素有種子貯藏時(shí)間、消毒劑的類型和工作濃度、消毒時(shí)間和培養(yǎng)基類型等。

1.4 外植體類型

外植體的類型對(duì)再生率和轉(zhuǎn)化率也有很大的影響。西瓜的多種組織都可作為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，常用的外植體有莖尖[22-25]、頂芽[26]、幼胚[27-28]、成熟胚子葉[15-17，29-33]、下胚軸[27，34]和原生質(zhì)體[35]等。成熟胚取材不受季節(jié)的制約，并且其子葉再生率高于其他外植體，因此，成熟胚子葉被認(rèn)為是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的最佳外植體[3，6-8，10，15，21，36-37]。

1.5 子葉的部位

子葉部位也是影響誘導(dǎo)不定芽的關(guān)鍵因素之一，它包括完整子葉、子葉基端部分和子葉頂端部分。

Tabei等[17]和Monacelli等[38]試驗(yàn)表明，子葉基端部分不定芽的誘導(dǎo)能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子葉頂端部分。Compton等[39]僅從子葉基端部分誘導(dǎo)獲得不定芽，而從相同子葉頂端切取的外植體則不能誘導(dǎo)出芽，表明西瓜子葉不定芽的誘導(dǎo)受葉片空間位置的限制，而且子葉基端部分具有極性，這與王春霞等[40]、王果萍[14]和Cho等[41]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。切碎的子葉由于傷口的增多，與培養(yǎng)基的緊密接觸而容易吸收養(yǎng)分，誘導(dǎo)時(shí)間短，誘導(dǎo)率較高。

萬勇等[42]研究表明，帶完整子葉的頂芽誘導(dǎo)不定芽的效果最好；Li等[37]認(rèn)為，利用整個(gè)子葉誘導(dǎo)不定芽誘導(dǎo)效率高于其他外植體，誘導(dǎo)率為89.67%；而林友豪等[43]研究表明，西瓜帶全子葉、帶半片子葉和不帶子葉上胚軸培養(yǎng)對(duì)不定芽的發(fā)生有影響，并且前二者形成的不定芽數(shù)量顯著多于后者。然而，Choi等[2]研究發(fā)現(xiàn)，光照條件下，西瓜子葉頂端部分比子葉基端部分更有利于不定芽的分化，同時(shí)他們認(rèn)為子葉是否能誘導(dǎo)出再生芽取決于有無光源，而非取決于子葉的位置，他們研究發(fā)現(xiàn)在黑暗培養(yǎng)條件下，測(cè)試品種Sweet Gem和Gold Medal子葉不能誘導(dǎo)出不定芽。

對(duì)于不同基因型西瓜子葉外植體最佳位置的選取，要結(jié)合選用的激素、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，并通過預(yù)試驗(yàn)來確定。

1.6 外植體預(yù)培養(yǎng)時(shí)間

預(yù)培養(yǎng)可以調(diào)節(jié)外植體的生理狀態(tài)，使組織代謝活躍進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂，從而使細(xì)胞處于“轉(zhuǎn)化感受態(tài)”狀態(tài)，易整合外源DNA從而提高轉(zhuǎn)化率。但預(yù)培養(yǎng)時(shí)間不能過長(zhǎng)或者過短。未經(jīng)預(yù)培養(yǎng)或預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過短，幼嫩柔弱的外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后容易受農(nóng)桿菌的毒害作用，從而褐化并萎蔫，導(dǎo)致不能進(jìn)一步分化；反之，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，外植體的傷口處于愈合狀態(tài)，不利于農(nóng)桿菌的侵染。張志忠等[10]研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)可以避免子葉卷曲和變形而導(dǎo)致的切口邊緣無法接觸培養(yǎng)基等缺點(diǎn)，從而提高轉(zhuǎn)化效率。秦新民等[44]研究發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)1～2 d可提高潮霉素(Hyg)抗性芽的分化，隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)抗性芽分化率隨之下降。陳銀華等[21]、李建勇等[45]、孫玉宏等[6]和趙爽[33]研究均表明，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為2 d 時(shí)，西瓜子葉轉(zhuǎn)化效率最高；Huang等[7]和Yu等[8]研究表明，外植體暗培養(yǎng)3 d有利于轉(zhuǎn)化效率的提高；而王春霞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，子葉預(yù)培養(yǎng)3～4 d可以顯著提高抗卡那霉素(Kan)芽的分化。結(jié)合作者的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，適宜的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)為黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d。

1.7 農(nóng)桿菌侵染濃度和時(shí)間

農(nóng)桿菌菌液濃度和侵染時(shí)間均是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。在侵染過程中農(nóng)桿菌會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生毒害從而導(dǎo)致植物細(xì)胞產(chǎn)生過敏反應(yīng)，如果菌液濃度過高，既會(huì)對(duì)外植體造成傷害，又因菌體相互聚結(jié)而影響其在外植體上的附著，從而降低轉(zhuǎn)化效率；濃度過低不利于外源基因的導(dǎo)入。同樣，侵染時(shí)間也要嚴(yán)格控制，外植體在菌液中浸泡時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)受農(nóng)桿菌毒害缺氧而軟腐；浸泡時(shí)間太短則農(nóng)桿菌尚未附著到傷口面，在共培養(yǎng)時(shí)無農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，不能完成轉(zhuǎn)化。Park等[19]認(rèn)為，將子葉置于D600為0.7～0.9的農(nóng)桿菌菌液中侵染30 min可達(dá)到較好的侵染效果；秦新民等[44]研究發(fā)現(xiàn)，西瓜子葉侵染時(shí)間在10～15 min效果較好；而張志忠等[10]研究表明，子葉在農(nóng)桿菌菌液D600為0.3的菌液中侵染10 min效果較佳，侵染效率較高，這與李建勇等[45]和孫玉宏等[6]的研究結(jié)果一致。因此，應(yīng)在前人的研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)不同梯度試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果分析并選擇最佳的菌液濃度和侵染時(shí)間。

1.8 乙酰丁香酮

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物時(shí)常需要誘導(dǎo)物來提高轉(zhuǎn)化效率，常用的誘導(dǎo)物為乙酰丁香酮(AS)和羥基乙酰丁香酮(HO-AS)，試驗(yàn)證明AS效果優(yōu)于HO-AS。張志忠等[10]研究表明，共培養(yǎng)基中添加100 μmol·L-1的AS可以提高GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)，瞬時(shí)表達(dá)率可達(dá)到74.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不加AS的瞬時(shí)表達(dá)率(46.6%)；李建勇等[45]認(rèn)為，共培養(yǎng)基中添加100 μmol·L-1的AS，可使GUS的瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到70%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于沒有添加AS的瞬時(shí)表達(dá)率(20%)；而Lin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌懸液中添加200 μmol·L-1的AS可明顯提高轉(zhuǎn)化效率。

1.9 外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時(shí)間

共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌侵染外植體傷口細(xì)胞、實(shí)現(xiàn)目的基因轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。研究表明，農(nóng)桿菌在傷口部位附著16 h后，T-DNA才會(huì)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞DNA，實(shí)現(xiàn)與植物基因組的整合。共培養(yǎng)時(shí)間太短，T-DNA轉(zhuǎn)移不能完成，外源基因很難整合到植物基因組，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低；時(shí)間太長(zhǎng)，農(nóng)桿菌大量增殖導(dǎo)致外植體過度感染而褐化死亡。大多數(shù)研究表明，共培養(yǎng)2～3 d可以提高T-DNA的轉(zhuǎn)移率，從而提高轉(zhuǎn)化效率。李建勇等[45]研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)3 d時(shí)外植體轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高，這與張志忠等[10]、Park等[19]、秦新民等[44]和孫玉宏等[6]的試驗(yàn)結(jié)果一致。而趙爽[33]研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)4 d有利于抗性芽的分化。王春霞等[3]研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)4 d，Kan抗性芽分化率迅速提高到35%～37%。

1.10 抗生素的選用

共培養(yǎng)之后，為了防止農(nóng)桿菌過度增殖對(duì)植物組織細(xì)胞造成傷害和影響植株的再生，在保證不傷害或少傷害外植體的基礎(chǔ)上，選擇最佳濃度的抗生素來完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。在西瓜遺傳轉(zhuǎn)化中常用的抗生素有羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、氨芐青霉素(Amp)和特美汀(Timentin)等。張志忠等[10]試驗(yàn)表明，為了防止高濃度的Carb造成外植體水漬化，可采用500 mg·L-1的Cef來抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。李文蘭等[46]研究結(jié)果表明，Amp，Carb和Cef濃度低于600 mg·L-1，對(duì)西瓜子葉芽分化沒有明顯的影響，高于600 mg·L-1對(duì)西瓜子葉芽分化有明顯的抑制作用。3種抗生素中，西瓜子葉對(duì)Cef的耐受性更強(qiáng)，250 mg·L-1的Cef有良好的抑制效果。李建勇等[45]認(rèn)為，Cef最佳的抑菌濃度為300 mg·L-1；孫玉宏等[6]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，300 mg·L-1的Carb適合用于外植體篩選培養(yǎng)；Huang等[7]和Yu等[8]在轉(zhuǎn)基因植株篩選的過程中發(fā)現(xiàn)，100～200 mg·L-1的Carb能較好地抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)；而?ürük等[47]研究表明，在西瓜遺傳轉(zhuǎn)化中添加400 mg·L-1的特美汀，可以在不影響轉(zhuǎn)化體正常生長(zhǎng)的條件下抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。

1.11 篩選劑

對(duì)獲得的不定芽進(jìn)行篩選是獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵。不同基因型植株對(duì)篩選劑的濃度要求不一致，所以在遺傳轉(zhuǎn)化之前必須通過預(yù)試驗(yàn)來確定篩選劑的最佳濃度。由于大多數(shù)研究者選用的植物雙元表達(dá)載體為pBI121，其T-DNA區(qū)帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTII表達(dá)盒，其轉(zhuǎn)化子具有Kan抗性。不同的基因型在篩選其轉(zhuǎn)基因后代時(shí)所用Kan濃度不同，如75[48]，100[2-3，5，7-8，49]，125[6]和125～175mg·L-1[4]。

此外，一些表達(dá)載體中含有HPT基因，使轉(zhuǎn)化子具有潮霉素(Hyg)抗性。李文蘭等[46]發(fā)現(xiàn)，低濃度Hyg能嚴(yán)重抑制根和芽的形成，20 mg·L-1的Hyg為不定芽分化的適宜篩選濃度，6 mg·L-1的Hyg可抑制根的分化。Park等[19]認(rèn)為，7.5 mg·L-1Hyg篩選效果比40 mg·L-1Kan好。同樣，張志忠等[10]和李建勇等[45]研究表明，西瓜子葉對(duì)Hyg較為敏感，15 mg·L-1Hyg可明顯抑制非轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)。

2 西瓜轉(zhuǎn)基因研究的應(yīng)用

2.1 優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系

Choi等[2]、張志忠等[10]、孫玉宏等[6]和李建勇等[45]把GUS基因?qū)氩煌鞴掀贩N，通過分析GUS基因的表達(dá)來研究影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)西瓜遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素。這為探索并建立西瓜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)。

2.2 提高西瓜非生物脅迫抗性

Ellul等[4]在優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，將酵母耐鹽基因(HAL1)成功導(dǎo)入不同西瓜品種，獲得高耐鹽的轉(zhuǎn)基因西瓜株系。孫治圖[50]將滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的甜菜堿基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入西瓜，但僅利用PCR證實(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，還沒有進(jìn)行抗逆性分析。這為利用基因工程技術(shù)獲得抗逆西瓜新材料奠定了基礎(chǔ)。

2.3 研究外源基因作用機(jī)制

王慧中等[51]將西瓜花葉病毒2號(hào)外殼蛋白(WMV-2 CP)基因轉(zhuǎn)化西瓜，并分析了后代植株抗病性、WMV-2CP基因表達(dá)水平和農(nóng)藝性狀，為進(jìn)一步明確花葉病毒2號(hào)外殼蛋白在西瓜抗病毒病中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

2.4 用于改善西瓜品質(zhì)

王春霞等[3]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功將番茄的ACC合成酶基因及其反義基因?qū)胛鞴?，檢測(cè)乙烯釋放指標(biāo)，結(jié)果表明，正反義轉(zhuǎn)基因植株的ACC氧化酶均有不同程度的表達(dá)；常尚連[52]將甜瓜反義酸性轉(zhuǎn)化酶基因?qū)胛鞴希@得陽性植株。這為培育耐貯藏和高品質(zhì)西瓜奠定了基礎(chǔ)。

2.5 用于提高西瓜抗病性

將抗病基因整合到西瓜基因組，有望獲得抗病新品種或新的育種材料，目前這類研究主要集中在抗病毒、真菌和細(xì)菌的研究。

Jaynes等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在西瓜中轉(zhuǎn)入抗菌肽編碼基因可以有效地抑制西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)生。Park等[19]將編碼黃瓜綠葉斑駁病毒外殼蛋白基因(CGMMC-CP)的cDNA轉(zhuǎn)化到西瓜中，轉(zhuǎn)化率只有0.1%～0.3%，經(jīng)抗性鑒定，140株轉(zhuǎn)基因植株中有10株抗黃瓜綠葉斑駁病毒。王慧中等[48，54]將WMV-1-cp基因?qū)胛鞴虾?，又將CMV-2cp基因?qū)胝忝?號(hào)，并培育成高抗WMV-2的轉(zhuǎn)基因高代純合株系。牛勝鳥等[55]利用西瓜花葉病毒(WMV)外殼蛋白(CP)基因、西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)復(fù)制酶基因(Nib)和黃瓜花葉病毒(CMV)復(fù)制酶基因構(gòu)建三價(jià)植物表達(dá)載體并成功導(dǎo)入西瓜品系H-1，對(duì)后代進(jìn)行病毒接種試驗(yàn)和抗病性篩選鑒定，獲得感病、抗病、免疫和癥狀恢復(fù)等轉(zhuǎn)基因株系，這為獲得抗病毒病新材料奠定了良好的基礎(chǔ)。Yu等[8]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將小西葫蘆黃化花葉病毒殼蛋白基因(ZYMVCP)和木瓜輪點(diǎn)病毒殼蛋白基因(PRSVWCP)成功導(dǎo)入西瓜并獲得抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。Huang等[7]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有西瓜銀色斑駁病毒的核蛋白基因(WSMoVN)轉(zhuǎn)入西瓜，獲得了抗病毒的轉(zhuǎn)基因植株。Lin等[9]將4個(gè)病毒外殼蛋白基因片段導(dǎo)入西瓜，經(jīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株可以抵抗多種病毒。以上這些研究為西瓜抗病毒病育種奠定了基礎(chǔ)。

張明方等[5]將葡聚糖酶基因和幾丁質(zhì)酶基因成功導(dǎo)入浙蜜2號(hào)，為獲得抗枯萎病植株奠定了基礎(chǔ)。張志忠等[36]構(gòu)建了同時(shí)含有番茄幾丁質(zhì)酶基因(Chi3)和β-1， 3-葡聚糖酶基因(Glu-Ac)的雙價(jià)抗真菌基因植物表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將Chi3和Glu-Ac同時(shí)導(dǎo)入西瓜栽培種中育一號(hào)，并獲得抗病性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株。肖守華[56]成功獲得含有煙草幾丁質(zhì)酶基因(CHI)、煙草β-1，3-葡聚糖酶基因(GLU)和小麥硫堇蛋白基因(THI)的三價(jià)抗真菌融合基因的高抗轉(zhuǎn)基因植株，抗病檢測(cè)表明幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性比對(duì)照高出5～6倍。高寧寧[57]將銀杏抗菌肽基因Gnk2-1成功轉(zhuǎn)入到西瓜，獲得的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)枯萎病抗性有所增強(qiáng)。這些研究結(jié)果為西瓜抗真菌病害育種奠定了基礎(chǔ)。

2.6 雄性不育基因的轉(zhuǎn)入及其他方面的研究

陳銀華等[21]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將帶有雄性不育基因、除草劑基因及卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒pBI-TBSbar成功導(dǎo)入京欣一號(hào)及親本自交系，獲得轉(zhuǎn)基因植株。這為開展西瓜雄性不育基因工程研究奠定了基礎(chǔ)。

Kato等[58]在干旱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子CLMYB1功能基因篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)西瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而研究其對(duì)野生西瓜根系生長(zhǎng)的影響。此外，Youk等[59]以轉(zhuǎn)CGMMV-CP西瓜為材料，通過研究轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)、整合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄元件表達(dá)水平，建立西瓜轉(zhuǎn)基因砧木分子遺傳評(píng)估的科學(xué)體系。

3 西瓜遺傳轉(zhuǎn)化涉及的主要問題及展望

3.1 轉(zhuǎn)化植株水漬化現(xiàn)象

3.2 西瓜自身優(yōu)良基因的挖掘及克隆

雖然已經(jīng)獲得抗病毒病、枯萎病和抗逆等優(yōu)良性狀的西瓜轉(zhuǎn)基因株系，但是這些基因幾乎都來源于其他物種，從西瓜自身獲得優(yōu)良基因的研究鮮有報(bào)道。野生種質(zhì)PI296341是抗枯萎病的優(yōu)質(zhì)資源，從中獲得抗病基因并轉(zhuǎn)入栽培品種顯得尤為重要。相信隨著分子標(biāo)記的深入研究和西瓜基因組測(cè)序技術(shù)的完成，西瓜優(yōu)良基因的克隆也將會(huì)迎來新的轉(zhuǎn)機(jī)。

3.3 功能基因的多樣化

目前，大多研究者把注意力集中在西瓜抗病毒病和枯萎病的研究上，而對(duì)改良西瓜品質(zhì)、抗逆和控制生長(zhǎng)發(fā)育等方面的研究較少，因此下一步應(yīng)加強(qiáng)關(guān)于品質(zhì)改良、抗逆和控制生長(zhǎng)發(fā)育基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究。與此同時(shí)，多基因替代單基因的轉(zhuǎn)化也是西瓜轉(zhuǎn)基因發(fā)展的主要方向。

3.4 轉(zhuǎn)基因西瓜的安全性

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在蔬菜品種改良中的廣泛應(yīng)用，其安全性問題日益受到重視。Kim等[65]試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因西瓜的外源基因會(huì)漂移到非轉(zhuǎn)基因西瓜中。而應(yīng)奇才等[66]在研究抗病毒轉(zhuǎn)基因西瓜時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因西瓜抗病毒能力顯著提高，而生物學(xué)性狀、含糖量和越冬能力等沒有顯著差異；并且毒性試驗(yàn)、突變?cè)囼?yàn)和飼喂小鼠試驗(yàn)均表明，該轉(zhuǎn)基因西瓜屬于安全食品[67]。為了避免不安全因素，研究者可通過無標(biāo)記轉(zhuǎn)化、西瓜內(nèi)源基因挖掘及轉(zhuǎn)化、加強(qiáng)安全性評(píng)價(jià)等工作來有效地解決安全問題。

4 結(jié)論

總之，西瓜遺傳轉(zhuǎn)化受多因素的影響，其中基因型、外植體類型及無菌苗苗齡對(duì)轉(zhuǎn)化率的提高至關(guān)重要，選擇適宜的試驗(yàn)材料是西瓜轉(zhuǎn)基因研究的基礎(chǔ)。遺傳轉(zhuǎn)化過程中，預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、侵染時(shí)間和菌液濃度、抗生素等均會(huì)影響到轉(zhuǎn)化效率，對(duì)這些因素進(jìn)行探索有利于建立一套高效適用的西瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，對(duì)提高西瓜抗病性、抗逆性和改良品質(zhì)并獲得新的種質(zhì)具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 侯春曉)

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文章題目務(wù)求簡(jiǎn)明，準(zhǔn)確涵蓋文章內(nèi)容，標(biāo)題長(zhǎng)度一般不應(yīng)超過20個(gè)字。中英文題目須一致。文章內(nèi)容可采用分級(jí)標(biāo)題，但各級(jí)標(biāo)題一般不超過3個(gè)層次，用阿拉伯?dāng)?shù)字連續(xù)編號(hào)，分別以如1，1.1，1.1.1的方式表示。

4.3 作者與單位

署名應(yīng)僅限于參加本工作并能解答論文中有關(guān)問題者，中國作者英文姓名用漢語拼音拼寫，姓氏大寫，名字的首字母大寫，雙名間用連字符隔開，如CHEN Jian-ping，ZHENG Tao；外國作者按其習(xí)慣書寫，姓前名后，名可用縮寫，字母間不加縮略點(diǎn)。多位作者的署名之間應(yīng)用逗號(hào)隔開，對(duì)于不同單位的作者，應(yīng)在姓名右上角加注不同的阿拉伯?dāng)?shù)字序號(hào)，并在其工作單位名稱之前加與作者姓名序號(hào)相同的數(shù)字。作者單位須至系、所一級(jí)，并注明工作單位所在省份、城市名及郵政編碼，各工作單位之間以“；”隔開。中英文姓名與單位須保持一致。

4.4 摘要和關(guān)鍵詞

摘要應(yīng)用簡(jiǎn)明的語言對(duì)文章的實(shí)質(zhì)內(nèi)容進(jìn)行全面而具體的概述、提煉，使摘要的信息與論文等價(jià)，并具有獨(dú)立性和自明性。研究類論文的摘要一般應(yīng)主要闡明研究目的(或擬解決的主要問題)、研究方法、主要結(jié)果與結(jié)論，重點(diǎn)突出研究的創(chuàng)新之處。建議選擇如“采用…方法對(duì)…進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：……”等類似句式進(jìn)行表述。綜述類論文的摘要主要闡明概況性的論述內(nèi)容，盡量應(yīng)包括文章的主要論點(diǎn)與重要的論證、數(shù)據(jù)等內(nèi)容。摘要中請(qǐng)使用第三人稱，盡量避免使用“我們”“作者”“本文”等作為主語。英文摘要?jiǎng)?wù)必與中文摘要保持核心內(nèi)容的一致性，并請(qǐng)注意語言的連貫性，避免使用中式英語或點(diǎn)對(duì)點(diǎn)的中英對(duì)譯。在寫作時(shí)，用過去時(shí)態(tài)敘述作者的研究工作和試驗(yàn)結(jié)果。

關(guān)鍵詞應(yīng)選用能反映文章特征內(nèi)容并較為通用的規(guī)范性詞匯和專業(yè)術(shù)語，一般每篇3～8個(gè)，文章的中、英文關(guān)鍵詞須一致。

4.5 首頁腳注

主要包括收稿日期、基金項(xiàng)目、作者簡(jiǎn)介與通信作者。其中，收稿日期由編輯部填寫；基金項(xiàng)目主要標(biāo)注產(chǎn)生論文的科研資助項(xiàng)目類別和項(xiàng)目編號(hào)，無須給出詳細(xì)的課題名稱，多項(xiàng)基金項(xiàng)目并列時(shí)依次羅列，以“；”隔開；作者簡(jiǎn)介只需給出第一作者的個(gè)人信息，包括姓名、出生年份、性別、籍貫、民族(漢族可不標(biāo)注)、學(xué)位、職稱、研究方向、E-mail、辦公電話與手機(jī))；通信作者，只需給出通信作者的E-mail、辦公電話與手機(jī)。若有兩名通信作者并列時(shí)，請(qǐng)分別給出每位通信作者的聯(lián)系方式。

4.6 物理量和計(jì)量單位

請(qǐng)使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)和國際規(guī)范的物理量與計(jì)量單位，不可使用M(物質(zhì)的量濃度)、畝、rmp(轉(zhuǎn)速)等已廢棄的單位。在正文和圖表中，計(jì)量單位一律使用規(guī)定的單位字母符號(hào)書寫，而不使用中文。表示體積單位升的符號(hào)為“L”，字母大寫，不使用“l(fā)”。由多個(gè)單位組合而成的單位，使用“·”連接，如r·min-1(轉(zhuǎn)速)、mol·L-1(物質(zhì)的量濃度)。數(shù)字與單位之間統(tǒng)一空一英文字符，百分號(hào)除外，如“3 L，37 ℃，4 000 r·min-1，25%，4 mol·m-2·s-1”。

凡在文章中出現(xiàn)的外文字母和文種、正斜體、黑體等易混淆的地方務(wù)必書寫清楚。對(duì)于公式中出現(xiàn)的變量，應(yīng)使用斜體。計(jì)量單位、化學(xué)元素符合等為正體，矩陣、矢量、張量符號(hào)為黑斜體。生物學(xué)名中的屬以下分類單元名的有關(guān)部分，如OryzasativaL.subsp.indicaKato；基因名，如actin等；限制性內(nèi)切酶，如EcoRⅠ等(前3個(gè)字母用斜體，序號(hào)用正體)，耐熱性DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶等；期刊名，如Science，Genetics，JournalofAgricultureandFoodChemistry等需排斜體。

4.7 數(shù)字

文章中出現(xiàn)的公元世紀(jì)、年代、年、月、日、時(shí)刻等各種數(shù)字，一律用阿拉伯?dāng)?shù)字表示。年份不得簡(jiǎn)寫，如“1993—1994”不能寫成“1993—94”；圖表中表示時(shí)間的年、月、日之間用英文連字符，如1999年5月8日應(yīng)寫成1999-05-08。4位以上數(shù)字及小數(shù)點(diǎn)后含多位的數(shù)字每3位空半格(不用逗號(hào)隔開)，如：19367寫成19 367。

4.8 外文縮略語

采用國際上慣用的縮略語。如名詞術(shù)語DNA(脫氧核糖核酸)、ATP(三磷酸腺苷)、ABA(脫落酸)、LSD(最小顯著差)等，機(jī)構(gòu)名縮略語FAO(聯(lián)合國糧農(nóng)組織)等。對(duì)于文中有些需要臨時(shí)寫成縮寫的詞，需在第一次出現(xiàn)處寫出全稱，表及圖中則用注解形式在下方注明，以便讀者理解。

4.9 圖和表

文稿中，凡能用文字簡(jiǎn)述清楚的問題，盡量不用圖、表。如使用圖、表，則在正文中請(qǐng)勿重復(fù)其數(shù)據(jù)，僅說明主要結(jié)果和趨勢(shì)即可。圖、表的設(shè)計(jì)應(yīng)科學(xué)美觀，具有自明性。所有表格均使用“三線表”，線圖盡量用Excel制作，圖表均需給出中英文圖題和表題，表內(nèi)各欄、圖的標(biāo)目(物理量的符號(hào)和計(jì)量單位)、圖注和表注均需中英對(duì)照，圖表插入文中適當(dāng)?shù)奈恢谩１韮?nèi)各欄以及圖的標(biāo)目均須表示成“量名稱或指標(biāo)名稱/單位符號(hào)”，如“質(zhì)量/g”；對(duì)于組合單位，則加括號(hào)，如“產(chǎn)量/(t·hm-2)”。

Influencing factors and research progress on transformation of watermelon by Agrobacterium

ZHAO Xiao-qiang， NIU Xiao-wei， FAN Min*

(InstituteofVegetables，AcademyofZhejiangAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Agrobacterium-mediated genetic transformation was the commonly used method in the watermelon genetic engineering. On the basis of an introduction about the influencing factors ofAgrobacterium-mediated transformation of watermelon and the application of transgenic watermelon， this study summarized the major influencing factors in genetic transformation process of watermelon， such as the strain ofAgrobacterium， the type of vector， the age of seedling， the type of explants， pre-culture time， co-culture time， the concentration and time of infection， the type and concentration of antibiotics and the concentration of acetosyringone. The application value and achievement of transgenic watermelon were also reviewed.

watermelon;Agrobacterium-mediated; genetic transformation; transformation efficiency

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.01.28

2015-06-11

浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2012C12903)；浙江省自然科學(xué)基金(LQ13C150004)

趙小強(qiáng)(1985—)，男，甘肅天水人，博士，主要從事西瓜遺傳育種與生物技術(shù)研究。E-mail: wushan2002zxq@163.com

*通信作者，范敏，E-mail: fanminfm@sina.com

S651

A

1004-1524(2016)01-0171-08

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2016，28(1):171-178

趙小強(qiáng)，牛曉偉，范敏. 農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的影響因素及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2016， 28(1): 171-178.