抵擋湯早期干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠腺苷酸活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

任單單　李晶　常柏

摘要：目的 觀察不同時(shí)期給予抵擋湯干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號(hào)通路相關(guān)因子的變化，探討其調(diào)控AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)的線粒體能量代謝對(duì)糖尿病大血管病變防御功能的作用機(jī)制。方法 采用尾靜脈注射鏈脲佐菌素配合高脂飼料喂養(yǎng)制作糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、二甲雙胍組、辛伐他汀組和抵擋湯早、中、晚期組，Western blot檢測(cè)胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞AMPKα1、過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）的蛋白表達(dá)，ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)一磷酸腺苷（AMP）、三磷酸腺苷（ATP）水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)胸主動(dòng)脈組織Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、Bcl-2的基因表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組大鼠胸主動(dòng)脈AMPKα1、PGC-1α蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）；抵擋湯早期組和辛伐他汀組Bcl-2、eNOS基因表達(dá)明顯升高（P<0.05），Caspase-3基因表達(dá)明顯降低（P<0.05）；抵擋湯早期組和辛伐他汀組ATP水平明顯升高（P<0.05），AMP水平明顯降低（P<0.05），其中以抵擋湯早期組效果最顯著。結(jié)論 抵擋湯早期干預(yù)可通過調(diào)控AMPK信號(hào)通路，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞線粒體的能量代謝，從而加強(qiáng)血管內(nèi)皮的防御功能。

關(guān)鍵詞：抵擋湯；腺苷酸活化蛋白激酶；Caspase-3；能量代謝；早期干預(yù)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.10.017

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）10-0072-06

Abstract： Objective To observe the effects of the intervention of Didang Decoction at different times on changes of AMPK signaling pathway related factors in macrovascular endotheliocytes of diabetic rats； To discuss the mechanism of mitochondria energy metabolism regulating the AMPK signaling pathway for macrovascular endothelial defense function. Methods Injection of STZ into the caudal vein and administration of high fat diet wer used to generate diabetic rat model. All rats were randomly divided into the following 7 groups： control， model， metformin， simvastatin， early-， middle-， and late-stage Didang Decoction group. Western blot was used to detect the expressions of APMKα1 and PGC-1α in rat aortic endothelial cells. Changes in the intracellular AMP and ATP levels were detected by ELISA. Real time fluorescence quantitative PCR was used to detected mRNA expressions of Caspase-3， eNOS， and Bcl-2 in tissue of thoracic aorta. Results Compared with the model group， the expressions of AMPKα1 and PGC-1α in the early-stage and middle-stage Didang Decoction group and simvastatin group increased （P<0.05）； the gene expressions of Bcl-2， and eNOS significantly increased in the early-stage Didang Decoction group and simvastatin group （P<0.05）， while the expressions of Caspase-3 decreased significantly （P<0.05）. The expression of ATP increased significantly and the expression of AMP decreased significantly in the early-stage Didang Decoction group and simvastatin group （P<0.05）， and the best effects were shown in the early-stage Didang Decoction group. Conclusion Early intervention of Didang Decoction can enhance energy metabolism in the mitochondria of macrovascular endothelial cells by regulating the AMPK signaling pathway， and then plays a role in strengthening the defense function of macrovascular endothelial cells.

Key words： Didang Decoction； AMP-activated protein kinase； Caspase-3； energy metabolism； early intervention； rats

大血管病變是2型糖尿病患者常見的動(dòng)脈病變，但臨床觀察部分患者在血糖控制理想的情況下，仍發(fā)生嚴(yán)重的大血管病變[1]。抵擋湯在《傷寒論》《金匱要略》中均有記載，具有破血逐瘀的功效。本研究組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，早期應(yīng)用抵擋湯能降低單核細(xì)胞趨化蛋白-l、巨噬細(xì)胞CD68、E-選擇素的表達(dá)，影響單核/巨噬細(xì)胞活化、遷移、黏附，且能降低細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和蛋白激酶C-β2的mRNA在視網(wǎng)膜組織的表達(dá)，抑制糖尿病微血管病變的炎癥反應(yīng)[2-3]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）為能量變化感受器，在糖尿病患者體內(nèi)可觀察到內(nèi)皮祖細(xì)胞活性功能受損并伴有AMPK磷酸化減少[4]。本實(shí)驗(yàn)從調(diào)節(jié)AMPK信號(hào)通路介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞能量代謝的角度，在給予干預(yù)的不同時(shí)期觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK信號(hào)通路相關(guān)因子的變化，探討其調(diào)控AMPK通路介導(dǎo)的線粒體能量代謝對(duì)糖尿病大血管病變防御功能的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠150只，普通級(jí)，4周齡，體質(zhì)量（200.4±2.2）g，天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK（津）2014-0001。飼養(yǎng)環(huán)境干燥、通風(fēng)，室溫25 ℃，相對(duì)濕度60%，自然晝夜光線照明，自由進(jìn)食飲水。

1.2 藥物

抵擋湯（桃仁10 g，大黃6 g，水蛭10 g，虻蟲10 g），飲片購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，按傳統(tǒng)工藝制備成水煎劑，減壓濃縮至含原藥材1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩｛}酸二甲雙胍片，上海施貴寶公司，0.5 g/片，批號(hào)20140509；辛伐他汀片，西安楊森制藥有限公司，20 mg/片，批號(hào)20140902。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ），美國(guó)Sigma公司；PCR試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。血糖儀（拜耳公司），胰島素放免測(cè)定試劑盒（天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司），顯微鏡、全自動(dòng)圖像分析儀（日本奧林巴斯公司），切片機(jī)（德國(guó)徠卡Microststems Mussloch公司），熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司），臺(tái)式低俗高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），電泳儀（北京六一儀器廠），HPIAS-2000型圖像分析軟件（同濟(jì)千屏影像工程公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組和造模

大鼠正常適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取15只作為正常組，其余為造模組。采用高脂飼料（20%蔗糖、1%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、63.8%普通飼料）喂養(yǎng)8周，內(nèi)眥靜脈取血，檢測(cè)空腹血糖和血清胰島素，任選胰島素抵抗大鼠（HOMA-IR指數(shù)判斷大鼠胰島素抵抗）20只為抵擋湯早期組；其余大鼠至12周后，空腹24 h，尾靜脈注射STZ，1周后隨機(jī)血糖值>16.9 mmol/L為2型糖尿病模型制備成功（成模率約80%），按體質(zhì)量、血糖分層隨機(jī)分為抵擋湯早期組、抵擋湯中期組、抵擋湯晚期組、二甲雙胍組、辛伐他汀組和模型組。

2.2 干預(yù)及標(biāo)本采集

正常組、模型組予等量無菌飲用水灌胃，抵擋湯早期組于成模前4周予抵當(dāng)湯原藥材3.24 g/kg灌胃，抵擋湯中期組（3.24 g/kg）、二甲雙胍組（0.36 mg/kg）、辛伐他汀組（2.67 mg/kg）均于成模時(shí)（即第12周）灌胃給藥，抵擋湯晚期組（3.24 g/kg）于成模后4周灌胃給藥，每日1次，給藥體積均為1 mL/100 g。至實(shí)驗(yàn)24周結(jié)束，脫頸處死大鼠，迅速剖取大鼠胸主動(dòng)脈組織，一部分以4%多聚甲醛溶液4 ℃固定，用于普通光學(xué)顯微鏡和透射電鏡檢查，另一部分分別放于不同的凍存管中，置于液氮1 d后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于Western blot、PCR和ELISA檢測(cè)。

2.3 基本指標(biāo)檢測(cè)

觀察大鼠一般狀況，如精神狀態(tài)、皮毛、自由飲食、飲水情況，記錄各組大鼠的體質(zhì)量，并尾靜脈取血檢測(cè)隨機(jī)血糖。

2.4 Western blot檢測(cè)腺苷酸活化蛋白激酶α1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α蛋白表達(dá)

用SDS堿裂解法裂解大鼠主動(dòng)脈組織，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定各細(xì)胞樣本蛋白含量；加入相應(yīng)體積的總蛋白樣品與5×蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，將樣品至于凝膠孔中，接通電源進(jìn)行電泳；將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，半干轉(zhuǎn)膜后封閉；加1∶200稀釋的AMPKα1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（PGC-1α）一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（稀釋度為1∶3000）進(jìn)行結(jié)合，洗膜，放入暗盒曝光顯影，用Image J軟件分析灰度值。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和Bcl-2基因表達(dá)

取約100 mg主動(dòng)脈組織，超純RNA提取試劑盒提取組織總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。引物序列：Caspase-3上游5'-TACTGCCGGAGTCTGACTG-3'，下游5'-CTC CAGGAATAGTAACCAGG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度142 bp；內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）上游5'-ACCTACGTGCA AGACCTCC-3'，下游5'-GCTTCATCCAGCTCCATG-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度133 bp；Bcl-2上游5'-TGCCACCTGTGGT CCATCTG-3'，下游5'-TGAAGAGTTCCTCCACCA-3'，引物長(zhǎng)度112 bp。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完畢后，60～95 ℃進(jìn)行融解曲線分析，熒光定量分析儀自動(dòng)采集給出目的基因和對(duì)照基因的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因表達(dá)量。

2.6 ELISA檢測(cè)一磷酸腺苷、三磷酸腺苷

將加入一定量PBS（pH 7.4）的標(biāo)本，棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，胰酶消化后吹打成單細(xì)胞懸液，按試劑說明進(jìn)行操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本的濃度值，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。每組取6個(gè)樣本，取其平均值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，兩組樣本均數(shù)間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnet's T3法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 一般狀況結(jié)果

正常組大鼠靈敏、活潑，皮膚有彈性，毛發(fā)光亮柔順；模型組大鼠精神萎靡，倦怠懶惰，反應(yīng)遲鈍，皮膚松弛，毛發(fā)無光澤，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食等表現(xiàn)；其他組一般狀況較模型組好轉(zhuǎn)。

4.2 抵擋湯對(duì)模型大鼠血糖的影響

與正常組比較，模型組大鼠血糖明顯升高（P<0.01），并出現(xiàn)糖尿病“三多一少”癥狀，提示造模成功；與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血糖明顯降低（P<0.05），其他各組血糖變化不明顯，提示抵擋湯和辛伐他汀對(duì)血糖影響不大。

4.3 抵擋湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈病理形態(tài)的影響

光鏡觀察結(jié)果顯示，正常組動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)光滑、完整，內(nèi)皮下有少量脂質(zhì)沉積，中膜平滑肌細(xì)胞排列相對(duì)整齊，極少量平滑肌細(xì)胞變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組動(dòng)脈內(nèi)膜不完整，內(nèi)皮細(xì)胞大部分缺失，脂質(zhì)沉積，中膜排列紊亂，大量平滑肌細(xì)胞變性、壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；抵擋湯早期組和辛伐他汀組動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)光滑，內(nèi)皮細(xì)胞局部缺失，其下有脂質(zhì)沉積，中膜排列整齊，平滑肌變性、壞死少見；抵擋湯中、晚期組和二甲雙胍組動(dòng)脈內(nèi)膜相對(duì)完整，有不同程度的內(nèi)皮細(xì)胞缺失及中膜排列稍紊亂，少量平滑肌細(xì)胞變性、壞死。結(jié)果見圖1。

4.4 抵擋湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞病理形態(tài)的影響

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，正常組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，彈力膜均勻，平滑肌細(xì)胞正常，線粒體結(jié)構(gòu)無異常；模型組可見細(xì)胞質(zhì)碎片和空泡，甚至內(nèi)皮細(xì)胞溶解消失，彈力膜界限不清排列混亂，平滑肌細(xì)胞核不清晰；除二甲雙胍組較模型組改善不明顯，其余各干預(yù)組電鏡下呈現(xiàn)細(xì)胞的溶解、彈力膜增厚斷裂得到不同程度的改善，線粒體的結(jié)構(gòu)得到不同程度的恢復(fù)，其中辛伐他汀組和抵擋湯早期組改善最明顯。結(jié)果見圖2。

4.5 抵擋湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈一磷酸腺苷活化蛋白激酶α1和過氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠AMPKα1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組AMPKα1和PGC-1α蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P<0.05）。

4.6 抵擋湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈Caspase-3、內(nèi)皮型一氧化氮合酶和Bcl-2基因表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠eNOS和Bcl-2基因表達(dá)明顯降低（P<0.01），Caspase-3基因表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組eNOS和Bcl-2基因表達(dá)明顯升高（P<0.05），Caspase-3基因表達(dá)明顯降低（P<0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P<0.05），見表3。各基因?qū)崟r(shí)擴(kuò)增曲線及產(chǎn)物融解曲線見圖4～圖7。

4.7 抵擋湯對(duì)模型大鼠胸主動(dòng)脈一磷酸腺苷、三磷酸腺苷水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠胸主動(dòng)脈AMP水平明顯升高（P<0.01），ATP水平明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，抵擋湯早、中期組和辛伐他汀組AMP水平明顯降低（P<0.05），ATP水平明顯升高（P<0.05），抵擋湯早期組變化較明顯（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管張力、改善炎癥狀態(tài)和平滑肌細(xì)胞增殖方面起著關(guān)鍵作用，糖尿病相關(guān)的代謝綜合征導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙是大血管病變發(fā)展的重要原因。

AMPK是細(xì)胞的能量變化感受器，包括、、亞基，亞基起催化作用，主要受AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)，AMP/ATP升高，蘇氨酸-172（Thr-172）被上游蛋白磷酸化，同時(shí)抑制Thr-172被絲氨酸磷酸酶PP2C去磷酸化，導(dǎo)致AMPK變構(gòu)激活[5-6]。有研究表明，AMPK2缺失或活性降低對(duì)于血管損傷后新生內(nèi)膜的形成發(fā)揮著關(guān)鍵作用，這有利于血管平滑肌細(xì)胞增殖[7-8]。而AMPK1占總AMPK活性的大部分，是血管平滑肌細(xì)胞主要的亞型，可導(dǎo)致eNOS減少，降低與抗氧化防御相關(guān)基因的表達(dá)，增加內(nèi)皮細(xì)胞活性氧[9]。其使內(nèi)皮細(xì)胞存活的機(jī)制為增加細(xì)胞內(nèi)ATP含量，從而參與內(nèi)皮細(xì)胞屏障修復(fù)和血管內(nèi)皮形成[10]。

一氧化氮（NO）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要遞質(zhì)，主要受eNOS調(diào)節(jié)，eNOS生物活性降低會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血管收縮、舒張失衡，促使內(nèi)皮細(xì)胞滲透性增加、血小板聚集等，引起動(dòng)脈粥樣硬化病變[11]。eNOS位于AMPK的下游，是AMPK參與介導(dǎo)血管內(nèi)皮功能改善過程的又一個(gè)重要靶點(diǎn)[12-13]。AMPK通過調(diào)節(jié)PGC-1-核呼吸因子1通路，激活編碼線粒體蛋白的核基因和線粒體DNA的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，從而線粒體得以表達(dá)，修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞[14]。線粒體通路和死亡受體通路是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這兩條通路最終末端都需激活Caspase-3才能引起凋亡，表現(xiàn)為經(jīng)典的染色質(zhì)凝結(jié)和DNA裂解。在線粒體通路中，累積活性氧、活化的促凋亡蛋白等導(dǎo)致線粒體膜滲透功能改變，引起釋放的細(xì)胞色素C（Cyt c）與凋亡蛋白酶活化因子1、ATP/dATP結(jié)合，活化的Caspase-9再激活下游Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡[15]。

AMPK激活可抑制高糖引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞中Caspase-3的活性，減少細(xì)胞凋亡[16]。而Bcl-2家族通過與其他凋亡因子相互作用而控制線粒體結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)揮細(xì)胞凋亡的主開關(guān)作用，其中Bcl-2保持線粒體外膜完整性，增加線粒體質(zhì)子的外流，阻止Cyt c穿過線粒體膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，也發(fā)揮抗凋亡的作用[17]。

由此可見，AMPK信號(hào)通路的作用較為復(fù)雜，涉及大量因子的調(diào)控作用，而AMP、ATP、AMPK1、Caspase-3、eNOS、PGC-1和Bcl-2則在通路中作為多個(gè)關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)發(fā)揮著重要作用。

抵擋湯主要用于太陽病之下焦蓄血證，《注解傷寒論》載“苦走血，咸勝血，虻蟲、水蛭之咸苦以除蓄血；甘緩結(jié)，苦泄熱，桃仁、大黃之苦以下結(jié)熱”。本研究采用久煎大黃法，以減輕其瀉下作用而增加活血化瘀的功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，水蛭和虻蟲具有抗凝血、抗血栓和抗炎的作用；大黃具有很強(qiáng)的抗感染、調(diào)節(jié)免疫、降脂抗炎、止血等多種作用；桃仁可降低血管阻力、改善血流動(dòng)力學(xué)，抗血栓形成，其抗炎鎮(zhèn)痛作用顯著[18]。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，其發(fā)病過程以陰虛為本，燥熱為標(biāo)。陰虛內(nèi)熱，損津耗液，則血脈為之虛澀而成血瘀，瘀血阻絡(luò)，導(dǎo)致臟腑氣機(jī)失調(diào)，其引起的心血管并發(fā)癥以動(dòng)脈粥樣硬化最為常見，這是糖尿病患者致死致殘的主要原因，源自糖尿病的心血管事件導(dǎo)致的死亡率是非糖尿病患者的2～4倍[19]。血管內(nèi)皮參與構(gòu)成血管壁選擇通透性的屏障，還可分泌多種血管活性物質(zhì)，調(diào)節(jié)血管功能[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抵擋湯早期干預(yù)可通過調(diào)控AMP/ATP比值，增加AMPKα1活性，從而開啟AMPK激酶系統(tǒng)，引起eNOS磷酸化，PGC-1α級(jí)聯(lián)反應(yīng)，同時(shí)抑制Caspase-3活性，升高Bcl-2活性。這可能是抵擋湯調(diào)節(jié)大血管內(nèi)皮細(xì)胞的能量代謝，減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)線粒體生成，增強(qiáng)大血管內(nèi)皮防御功能的作用，延緩糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制。然而，由于AMPK信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，涉及大量因子在其中發(fā)揮多方面的作用，抵擋湯是否會(huì)通過調(diào)節(jié)其他關(guān)鍵因子而影響糖尿病血管功能改變，則需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] EMOFSSON M， SIEGBANN A. Platelet-derived growth factor-BB and monocyte chemotactic protein-1 induce human peripheral blood monocytes to express tissue factor[J]. Thromb Res，1996，83（4）：307-320.

[2] 常柏，潘從清，孟東，等.抵擋湯對(duì)2型糖尿病患者血管內(nèi)皮功能影響的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥，2011，28（6）：457-458.

[3] 李春深，常柏，苗戎，等.抵擋湯早期干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜ICAM-1和VCAM-1表達(dá)的影響[J].北京中醫(yī)藥，2013，32（2）：129-134.

[4] WANG X R， ZHANG M W， CHEN D D， et al. AMP-activated protein kinase rescues the angiogenic functions of endothelial progenitor cells via manganese superoxide dismutase induction in type 1 diabetes[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2011，300（6）：E1135- E1145.

[5] HATTORI Y， NAKANO Y， HATTORI S， et al. High molecular weight adiponectin activates AMPK and suppresses cytokine-induced NF-B activation in vascular endothelial cells[J]. FEBS Letters，2008， 582（12）：1719-1724.

[6] LAGE R. AMPK：a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis[J]. Trends Mol Med，2008，14（12）：539-549.

[7] SONG P， WANG S， HE C， et al. AMPKα2 deletion exacerbates neointima formation by upregulating skp2 in vascular smooth muscle cells[J]. Circ Res，2011，109（11）：1230-1239.

[8] HAN D， YANG B， OLSON L K， et al. Activation of autophagy through modulation of 5'-AMP-activated protein kinase protects pancreatic beta-cells from high glucose[J]. Biochem J，2010，425（3）：541-551.

[9] MA X， ZHANG J， DENG R， et al. Synergistic effect of smoking with genetic variants in the AMPKα1 gene on the risk of coronary artery disease in type 2 diabetes[J]. Diabetes Metab Res Rev，2014，30（6）：483-488.

[10] CREIGHTON J， JIAN M， SAYNER S， et al. Adenosine mono- phosphate activated kinaseα1 promotes endothelial barrier repair[J]. FASEB J，2011，25（10）：3356-3365.

[11] DUDZINSKI D M， MICHEL T. Michel Life history of eNOS：partners and pathways[J]. Cardiovasc Res，2007，75（2）：247-260.

[12] CHEN Z， PENG I C， SUN W， et al. AMP-activated protein kinase functionally phosphorylates endothelial nitric oxide synthase ser633[J]. Circ Res，2009，104（4）：496-505.

[13] CHEN Z P， MITCHELHILL K I， MICHELL B J， et al. AMP-activated protein kinase phosphorylation of endothelial NO synthase[J]. FEBS Lett，1999，443（3）：285-289.

[14] BERGERON R， REN J M， CADMAN K S， et al. Chronic activation of AMP kinase results in NRF-1 activation and mitochondrial biogenesis[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2001，281（6）：1340- 1346.

[15] SNIGDHA S， SMITE D H， PRIETO G A， et al. Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J]. Neurosci Bull，2012，28（1）：14-24.

[16] SUKRITI S， TAUSEEF M， YAZBECK P， et al. Mechanisms regulating endothelial permeability[J]. Pulmonary Circulation，2014，4（4）：535-551.

[17] HAYASHI T， SAKURAI M， ABE K， et al. Apoptosis of motorneurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia[J]. Stroke，1998，29（5）：1007-1013.

[18] 沈丕安.中藥藥理與臨床運(yùn)用[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：407- 669.

[19] DEVEREUX R B， ROMAN M J， PARANICAS M， et al. Impact of diabetes on cardiac structure and function：the strong heart study[J]. Circulation，2000，101（19）：2271-2276.

[20] RUBANYI G M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases[J]. J Cardiovasc Pharmacol，1993， 22（Suppl 4）：S1-14.

（收稿日期：2015-12-19）

（修回日期：2016-01-05；編輯：華強(qiáng)）