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    重組人激活素A調(diào)節(jié)人脂肪干細(xì)胞中內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的機(jī)制

    2016-10-29 05:23:52黃潔瓊郭昕悅李衛(wèi)紅張海燕
    關(guān)鍵詞:限定性細(xì)胞核特異性

    黃潔瓊, 郭昕悅, 侯 棟, 李衛(wèi)紅, 張海燕

    (1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系,北京 100069; 2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心; *通訊作者,E-mail:culture@ccmu.edu.cn)

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    重組人激活素A調(diào)節(jié)人脂肪干細(xì)胞中內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的機(jī)制

    黃潔瓊, 郭昕悅, 侯 棟, 李衛(wèi)紅, 張海燕

    (1首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系,北京 100069;2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心;*通訊作者,E-mail:culture@ccmu.edu.cn)

    目的 研究重組人激活素A(activin A)調(diào)節(jié)人脂肪干細(xì)胞(human adipose stem cells, hASCs)中內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2表達(dá)的機(jī)制。 方法 將hASCs分為對(duì)照組、activin A組和activin A+SIS3組,分別給予相應(yīng)處理。用免疫細(xì)胞化學(xué)法和高內(nèi)涵分析系統(tǒng)測(cè)定各組細(xì)胞中磷酸化smad3蛋白(p-smad3)、限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2的蛋白水平表達(dá)情況,用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定GATA4和FOXA2的mRNA水平表達(dá)情況。 結(jié)果 分組處理細(xì)胞30 min,activin A組細(xì)胞細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá)顯著高于對(duì)照組和activin A+SIS3組(P<0.05);分組處理細(xì)胞72 h,activin A組細(xì)胞中GATA4和FOXA2的mRNA和蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組和activin A+SIS3組(P<0.05)。 結(jié)論 activin A可活化hASCs細(xì)胞內(nèi)的p-smad3信號(hào),并促進(jìn)限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2的表達(dá);p-smad3的特異性抑制劑SIS3可阻斷activin A對(duì)hASCs中p-smad3、GATA4和FOXA2的調(diào)節(jié)作用。activin A調(diào)節(jié)hASCs中限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2的表達(dá)依賴于p-smad3信號(hào)。

    人脂肪干細(xì)胞; 重組人激活素A; SIS3; 磷酸化smad3蛋白; 內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子

    在機(jī)體發(fā)育過程中,限定性內(nèi)胚層前體細(xì)胞在多種信號(hào)的調(diào)控下分化為肝臟前體細(xì)胞,繼而形成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。因此,明確人多潛能干細(xì)胞定向限定性內(nèi)胚層前體細(xì)胞的分化機(jī)制,對(duì)于探究肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的成熟分化具有重要意義。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠與特異DNA序列結(jié)合并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的基因調(diào)控蛋白,在調(diào)節(jié)基因表達(dá)、決定細(xì)胞屬性和誘導(dǎo)細(xì)胞分化的過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在細(xì)胞分化過程中,不同的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子特異地結(jié)合到組織或細(xì)胞特異性基因的調(diào)控元件上,從而啟動(dòng)基因的表達(dá)。其中,GATA4和FOXA2是限定性內(nèi)胚層特異性的轉(zhuǎn)錄因子[1]。轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2作為先鋒轉(zhuǎn)錄因子的身份,首先與靶基因特定區(qū)域結(jié)合,重新配置一個(gè)封閉染色體的活化狀態(tài)[2,3],使得其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到調(diào)節(jié)區(qū)域。研究表明,在FOXA2與GATA4協(xié)同作用下,可通過調(diào)節(jié)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子如HNF4,CEBP等,促使內(nèi)胚層細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化[4]。

    本實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果證實(shí),高濃度重組人激活素A(activin A)的作用可上調(diào)人脂肪干細(xì)胞(human adipose stem cells,hASCs)中限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2的表達(dá),這些細(xì)胞可在多種因子的繼續(xù)誘導(dǎo)作用下分化為具有功能的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞[5],但activin A是通過何種信號(hào)途徑發(fā)揮作用尚不明確。本研究旨在探討activin A誘導(dǎo)hASCs中GATA4和FOXA2表達(dá)上調(diào)的作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 試劑及儀器

    DMEM/F12培養(yǎng)基,青霉素-鏈霉素儲(chǔ)存液,胰蛋白酶,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒,熒光定量96孔PCR板,ABI光學(xué)貼膜購自美國(guó)Thermo公司;RNA提取試劑盒購自德國(guó)Qiagen公司;Ⅰ型鼠尾膠原購自美國(guó)Invitrogen公司;胎牛血清購自美國(guó)Hyclone公司;牛血清白蛋白、SIS3、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;重組人激活素A(activin A)購自美國(guó)PeproTech公司;兔抗人p-smad3抗體,兔抗人GATA4抗體購自美國(guó)Millipore公司;兔抗人FOXA2抗體購自美國(guó)ABGENT公司;Alexa Fluor?488標(biāo)記羊抗兔IgG購自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;薄壁管,Tips購自美國(guó)Axygen公司;焦碳酸二乙酯處理水購自北京賽百盛公司;PCR引物合成購自北京奧科鼎盛公司;直徑60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,6孔板購自美國(guó)BD公司;Galaxy恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱購自英國(guó)RS Biotech公司;ND-1000分光光度計(jì)購自美國(guó)Nanodrop公司;Cellomics自動(dòng)成像顯微鏡及高內(nèi)涵圖像分析軟件購自美國(guó)Thermo公司;GeneAmp PCR System 2400 PCR儀,7300 real-time PCR儀購自新加坡ABI公司。

    1.2 hASCs的來源與特征

    hASC由本實(shí)驗(yàn)室建立[5],體外培養(yǎng)hASCs呈細(xì)長(zhǎng)、梭形、成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng);高表達(dá)CD90、CD105及CD73抗原;同時(shí)表達(dá)中胚層特異性基因MEOX1和TBX6及多潛能轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG和SALL4;具有成脂、成骨及成軟骨譜系分化的能力。本實(shí)驗(yàn)取冷凍保存的第7-9代hASCs經(jīng)復(fù)蘇、擴(kuò)增以及鑒定特征后進(jìn)行后續(xù)研究。

    1.3 hASCs的分組及處理

    將6孔板用濃度為0.5 mg/ml Ⅰ型鼠尾膠原進(jìn)行包被,37 ℃靜置1 h,吸棄膠原,將培養(yǎng)皿用PBS液漂洗3次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期hASCs,經(jīng)0.05%胰蛋白酶消化后制備成單細(xì)胞懸液,按照1.5×104/cm2的密度接種于已包被膠原的6孔板中,分為3組:對(duì)照組、activin A組和activin A+SIS3組,每組每孔加入3 ml增殖培養(yǎng)基,置于37 ℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%匯合時(shí),吸棄舊培養(yǎng)基,用PBS浸洗細(xì)胞2次;加入無血清DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。吸棄舊培養(yǎng)基,用PBS浸洗細(xì)胞2次,對(duì)照組加入3 ml基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含5 mg/ml牛血清白蛋白的DMEM/F12培養(yǎng)基),activin A組加入3 ml含100 ng/ml activin A的基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基,activin A+SIS3組先加入3 ml含10 μmol/L SIS3的基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用30 min,再換成3 ml含10 μmol/L SIS3及100 ng/ml activin A的基礎(chǔ)誘導(dǎo)培養(yǎng)基,培養(yǎng)30 min時(shí)檢測(cè)p-smad3蛋白的表達(dá),72 h時(shí)檢測(cè)GATA4和FOXA2 mRNA及蛋白的表達(dá)。

    1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)

    hASC細(xì)胞經(jīng)上述處理后,吸棄舊液,分別加入4%多聚甲醛液,室溫固定20 min;吸棄固定液,加入PBS浸洗細(xì)胞3次;加入0.3% Triton X-100破膜劑,室溫孵育10 min;吸棄上清液,加入封閉用山羊血清,室溫孵育60 min;吸棄封閉液,分別加入兔抗人p-smad3(1∶100倍稀釋),兔抗人GATA4(1∶100倍稀釋),兔抗人FOXA2(1∶50倍稀釋),4 ℃孵育過夜;吸棄一抗,加入500 μl PBS浸洗細(xì)胞3次;分別加入Alexa Fluro 488標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶500倍稀釋),37 ℃,避光孵育60 min;吸棄二抗,加入PBS浸洗細(xì)胞3次;加入DAPI工作液(1 μg/ml ,室溫孵育15 min,復(fù)染細(xì)胞核;棄去染液,PBS浸洗細(xì)胞3次;使用Cellomics?自動(dòng)成像顯微鏡獲取圖像信息,利用高內(nèi)涵圖像分析軟件模塊分析數(shù)據(jù)。

    1.5 Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞mRNA的水平

    利用RNeasy Mini Kit試劑盒,按照說明書提取上述各組細(xì)胞總RNA。利用Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,按照說明書的步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)水平。使用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物,F(xiàn)OXA2上游引物:5′-CGCCCACTTCCAACTACCGC-3′,F(xiàn)OXA2下游引物:5′-GGCTCGTGCCCTTCCATCTT-3′;GATA4上游引物:5′-CCACAAGGCTATGCGTCTC-3′,GATA4下游引物:5′-CTTCTTTGCTATCCTCCAAGTC-3′。引物由北京奧科生物公司合成。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 activin A上調(diào)hASCs中p-smad3的蛋白表達(dá)

    免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示,與對(duì)照組相比,100 ng/ml activin A與hASC作用30 min,細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá)明顯增加(見圖1A);高內(nèi)涵分析系統(tǒng)分析每組隨機(jī)200個(gè)細(xì)胞的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,activin A可顯著上調(diào)細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá),且這種上調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖1B)。

    2.2 SIS3抑制hASCs中p-smad3的蛋白表達(dá)

    免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果顯示,與activin A組相比,經(jīng)10 μmol/L SIS3預(yù)處理30 min,再加入100 ng/ml activin A作用30 min,細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá)明顯被抑制(見圖2A);高內(nèi)涵統(tǒng)計(jì)分析分析每組隨機(jī)200個(gè)細(xì)胞的結(jié)果顯示,SIS3預(yù)處理組細(xì)胞中p-smad3的相對(duì)熒光密度明顯低于activin A組,二組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖2B)。

    圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)分析activin A處理后細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá)Figure 1 Immunocytochemistry analysis of the p-smad3 expression after treated with activin A

    圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)分析SIS3處理后細(xì)胞核中p-smad3的表達(dá)Figure 2 Immunocytochemistry analysis of the p-smad3 expression after treated with SIS3

    2.3 activin A上調(diào)hASCs中限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

    實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明,activin A作用72 h,hASCs中GATA4和FOXA2的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào),與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖3A,3B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果顯示,activin A作用72 h,hASCs細(xì)胞核中GATA4的表達(dá)明顯增強(qiáng)(見圖3C)。高內(nèi)涵分析系統(tǒng)分析每組200個(gè)細(xì)胞的結(jié)果證實(shí),activin A作用72 h,hASCs細(xì)胞核中GATA4的表達(dá)與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖3D)。

    圖3 Activin A處理后hASCs中轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2表達(dá)的變化Figure 3 Expression of GATA4 and FOXA2 in hASCs after treated with activin A

    2.4 SIS3降低activin A對(duì)hASCs中限定性內(nèi)胚層特異性轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)作用

    實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明,加入SIS3后,activin A對(duì)hASCs中GATA4和FOXA2 mRNA水平的上調(diào)作用被抑制(P<0.05,見圖4A,4B)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色的結(jié)果顯示,加入SIS3后,hASCs細(xì)胞核中GATA4的表達(dá)明顯減弱(見圖4C)。高內(nèi)涵分析系統(tǒng)分析每組200個(gè)細(xì)胞的結(jié)果證實(shí),加入SIS3后,hASCs細(xì)胞核中GATA4的表達(dá)與activin A組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05,見圖4D)。

    3 討論

    本實(shí)驗(yàn)室前期的研究表明,體外培養(yǎng)的同質(zhì)性hASCs表達(dá)多潛能轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、NANOG和SALL4,100 ng/ml activin A作用72 h可促使hASCs向限定性內(nèi)胚層及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化[5]。已有的研究顯示,高濃度的Nodal信號(hào)可促使限定性內(nèi)胚層的發(fā)生,而activin A可模擬體內(nèi)的Nodal信號(hào)誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞分化為限定性內(nèi)胚層前體細(xì)胞[6]。activin A是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族中的成員,當(dāng)其與特異性靶細(xì)胞受體ALK4/5結(jié)合后,可引起細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子smad2和smad3磷酸化,磷酸化的smad2和smad3可與smad4結(jié)合形成復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)入到細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。本研究結(jié)果表明,activin A可促進(jìn)hASCs細(xì)胞核中p-smad3表達(dá)量增加。在培養(yǎng)體系中加入p-smad3的特異性抑制劑SIS3之后,可降低activin A對(duì)hASCs細(xì)胞核中p-smad3表達(dá)的促進(jìn)作用。由此說明,在hASC中,activin A可通過磷酸化smad3,促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn),磷酸化的p-smad3可結(jié)合至FOXA2的啟動(dòng)子區(qū),調(diào)控FOXA2的表達(dá)[8],這一研究也支持了這一假設(shè),activin A可能通過p-smad3調(diào)控hASCs中GATA4和FOXA2的表達(dá)上調(diào),從而促使hASCs向限定性內(nèi)胚層系細(xì)胞的活動(dòng)。

    圖4 SIS3處理后hASCs中轉(zhuǎn)錄因子GATA4和FOXA2表達(dá)的測(cè)定Figure 4 Expression of GATA4 and FOXA2 in hASCs after treated with SIS3

    [1] Gordillo M,Evans T,Gouon-Evans V.Orchestrating liver development[J]. Development,2015,142(12):2094-108.

    [2] Iwafuchi-Doi M,Donahue G,Kakumanu A,etal.The pioneer transcription factor FoxA maintains an accessible nucleosome configuration at enhancers for tissue-specific gene activation[J].Mol Cell,2016,62(1):79-91.

    [3] Cirillo LA,Lin FR,Cuesta I,etal.Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3(FoxA) and GATA-4[J].Mol Cell,2002,9(2):279-89.

    [4] Alder O,Cullum R,Lee S,etal.Hippo signaling influences HNF4A and FOXA2 enhancer switching during hepatocyte differentiation[J].Cell Rep,2014,9(1):261-271.

    [5] Li X,Yuan J,Li W,etal.Direct differentiation of homogeneous human adipose stem cells into functional hepatocytes by mimicking liver embryogenesis[J].J Cell Physiol,2014,229(6):801-812.

    [6] Filby CE,Williamson R,van Kooy P,etal.Stimulation of activin A/Nodal signaling is insufficient to induce definitive endoderm formation of cord blood-derived unrestricted somatic stem cells[J].Stem Cell Res Ther,2011,2(2):16.

    [7] Xia Y,Schneyer AL.The biology of activin: recent advances in structure,regulation and function[J].J Endocrinol,2009,202(1):1-12.

    [8] Zhang Y,Handley D,Kaplan T,etal.High throughput determination of TGFβ1/SMAD3 targets in A549 lung epithelial cells[J].PLoS One,2011,6:e20319.

    Mechanisms of the expression of endoderm specific transcription factors in human adipose stem cells regulated by activin A

    HUANG Jieqiong1, GUO Xinyue1, HOU Dong1, LI Weihong2, ZHANG Haiyan1*

    (1DepartmentofCellBiology,SchoolofBasicMedicalScience,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China;2ExperimentalCenterforBasicMedicalTeaching,SchoolofBasicMedicalScience,CapitalMedicalUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:culture@ccmu.edu.cn)

    ObjectiveTo investigate the mechanisms of endoderm specific transcription factors GATA4 and FOXA2 induction in human adipose stem cells regulated by activin A.MethodsHuman adipose stem cells(hASCs) were divided into control group, activin A group and activin A+p-smad3 specific inhibitor SIS3 group. Real time PCR, immunofluorescence and high content screening were used to analyze the mRNA expression of GATA4 and FOXA2, and the protein expression of p-smad3, GATA4 and FOXA2, respectively.ResultsThe expression of p-smad3 increased at 30 min in activin A group compared to control group and activin A+SIS3 group(P<0.05). The mRNA and protein expression of GATA4 and FOXA2 significantly increased at 72 h in activin A group compared to control group and activin A+SIS3 group(P<0.05).ConclusionActivin A can activate the p-smad3 signaling in hASCs, and promote the expression of endoderm specific transcription factors, while p-smad3 specific inhibitor SIS3 can block the effect of activin A. The expression of endoderm specific transcription factors GATA4 and FOXA2 in hASCs induced by activin A depends on p-smad3 signaling.

    human adipose stem cells; activin A; SIS3; p-smad3; endoderm specific transcription factors

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171310)

    黃潔瓊,女,1989-05生,碩士, E-mail:13552309907@163.com

    2016-06-14

    R392.32

    A

    1007-6611(2016)09-0803-05

    10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.005

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