一種新型的大鼠血漿中硫酸軟骨素含量測(cè)定方法

陳娜娜　王　建　房玉瀟　肖玉良　李玉琴

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安　271016)

?

一種新型的大鼠血漿中硫酸軟骨素含量測(cè)定方法

陳娜娜*王建*房玉瀟肖玉良李玉琴

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安271016)

目的建立血液中硫酸軟骨素含量測(cè)定的新方法。方法采用鏈霉蛋白酶E和水飽和酚處理血漿，然后采用改良的1,9-二甲基亞甲基藍(lán)法測(cè)定血漿中硫酸軟骨素的含量。結(jié)果在0～10 μg/ml的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y = 0.014x + 0.245,R2= 0.998。該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度的 RSD均小于4%，回收率在102.0%～105.0%之間，CS提取回收率在80%以上(n=5)。結(jié)論所建方法成本低、快速、簡(jiǎn)便、靈敏，適用于血液中硫酸軟骨素的含量測(cè)定。

硫酸軟骨素；1,9-二甲基亞甲基藍(lán)；血漿；測(cè)定

硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)是一類硫酸化的糖胺聚糖，存在于細(xì)胞表面和哺乳動(dòng)物的細(xì)胞外基質(zhì)中，主要分布于軟骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中。CS具有多種藥理活性，如抗炎[1-2]、抗氧化[3-4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、抗腫瘤[7]、神經(jīng)保護(hù)[8]、黏附調(diào)節(jié)[9]、抑制血管生成[10]、抗粘連[11]、抗病毒[12]、治療角膜損傷[13]及保護(hù)角膜[14]等，是一種重要的多糖類藥物。在美國(guó)、歐洲、日本等國(guó)家，CS主要作為膳食補(bǔ)充劑或藥品，用于心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎等疾病的預(yù)防與治療。

隨著人們對(duì)多糖類藥物的研究，多糖類藥物在動(dòng)物或人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究成為多糖類藥物研究的瓶頸，其中多糖類藥物的體內(nèi)外的檢測(cè)成為目前此類藥物研究領(lǐng)域面臨的首要難題之一。不同的動(dòng)物來(lái)源、不同提取工藝得到的CS在硫酸化程度、分子量、組成成分方面差異較大，這些差異在某種程度都會(huì)對(duì)CS含量的測(cè)定造成一定的影響，此外動(dòng)物各種組織本身所含有的內(nèi)源性CS也會(huì)影響血液、組織中外源性CS的檢測(cè)，因此如何建立一種能夠快速且準(zhǔn)確的測(cè)定CS含量的方法是本研究考察修飾后CS進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)及細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵所在。本研究對(duì)1,9-二甲基亞甲基藍(lán)測(cè)定糖胺聚糖的方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的定量測(cè)定大鼠血液中CS含量的方法。

1　材料與方法

1.1試劑與材料豬CS(華懋雙匯實(shí)業(yè)有限公司生物化學(xué)制藥廠)；低分子量豬CS(自制)；鯊魚(yú)CS(山東益寶生物制品有限公司)；豬CS標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich公司)；1,9-二甲基亞甲藍(lán)(95%，Sigma-Aldrich公司)；鏈霉蛋白酶E(Merck Millipore公司)；水飽和酚、甘氨酸(上海生工生物工程股份有限公司)；大鼠血漿(取自SD大鼠，北京華阜康生物科技股份有限公司)；其它試劑均為分析純。Varian Cary 100 Scan紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Varian公司)；Legend Micro 17微量臺(tái)式離心機(jī)(Thermo Scientific公司)；Alpha1-2冷凍干燥機(jī)(Martin Christ公司)。

1.2溶液配制 (1)DMMB溶液的配制：DMMB 16 mg、甘氨酸3.04 g、NaCl 2.37 g、去離子水900 ml，攪拌溶解后，鹽酸調(diào)pH至3.0，定容至1 L，室溫儲(chǔ)存，2個(gè)月內(nèi)使用。(2)2%蛋白酶E溶液：蛋白酶E 200 mg、50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH 8.0)9.5 ml，輕輕搖動(dòng)至蛋白酶E完全溶解(禁止渦旋混合)，定容至10 ml，分裝后-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?3)CS標(biāo)準(zhǔn)液的配制：稱取豬CS標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，溶于水中定容至100 ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?4)CS樣品溶液的配制：稱取豬CS樣品(豬CS、低分子量豬CS、鯊魚(yú)CS)10 mg，溶于水中定容至100 ml，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 量取0、1、2、3、4、5 ml 濃度為100 μg/ml CS標(biāo)準(zhǔn)液定容至50 ml，得到0、2、4、6、8、10 μg/ml系列稀釋液。25℃下，取稀釋液200 μl，加DMMB溶液1 ml，搖勻后，30 s內(nèi)分光光度計(jì)下測(cè)定波長(zhǎng)525 nm處的吸光度A525。吸光度值做縱坐標(biāo)，濃度做橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.3.2DMMB法測(cè)定血漿中CS的含量 含CS的大鼠血漿100 μl、2%鏈酶蛋白酶E溶液50 μl，混合均勻后50 ℃下孵育20 h，加水飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1 )溶液200 μl變性蛋白質(zhì)，12000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，蛋白質(zhì)變性兩次后，用200 μl氯仿萃取兩次，取上層溶液，凍干，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?jīng)去蛋白處理后的樣品用去離子水100 μl溶解后，加入DMMB溶液1 ml，搖勻后，30 s內(nèi)分光光度計(jì)下測(cè)定525 nm處的吸光度A525，用后的比色皿，95%乙醇洗滌3次，去離子水洗滌2次后，擦干后用于下次測(cè)定[15]。

1.3.3精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為2.0、6.0、10.0 μg/ml的CS標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，1天測(cè)定5次，計(jì)算日內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算日間精密度。

1.3.4回收率實(shí)驗(yàn) 取濃度為2.0、6.0、10.0 μg/ml的CS標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl各5份，測(cè)定CS的濃度，計(jì)算回收率。

1.3.5提取回收率實(shí)驗(yàn) 取濃度為2.0、6.0、10.0 μg/ml的CS標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，分別加入大鼠血清100 μl、2%鏈酶蛋白酶E溶液50 μl，混合均勻后50 ℃下孵育20 h，用水飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)溶液200 μl變性蛋白質(zhì)，12000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，蛋白質(zhì)變性兩次后，用200 μl氯仿萃取兩次，取上層溶液，凍干，100 μl去離子水溶解后，DMMB法測(cè)定CS的含量，計(jì)算回收率。

1.3.6不同來(lái)源CS樣品的提取回收率實(shí)驗(yàn) 取濃度為6.0 μg/ml的CS樣品溶液(豬CS、低分子量豬CS、鯊魚(yú)CS)100 μl，分別加入大鼠血清100 μl、2%鏈酶蛋白酶E溶液50 μl，混合均勻后50 ℃下孵育20 h，加水飽和酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)溶液200 μl變性蛋白質(zhì)，12000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清，蛋白質(zhì)變性兩次后，用200 μl氯仿萃取兩次，取上層溶液，凍干，100 μl去離子水溶解后，DMMB法測(cè)定CS的含量，計(jì)算回收率。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于525 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值A(chǔ)525作縱坐標(biāo)、濃度C作做橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y= 0.014x+ 0.245 (R2= 0.998)。結(jié)果表明，CS在0～10.0 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，吸光度A525與CS濃度線性關(guān)系良好。

2.2精密度 CS的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，2。2.0、6.0、10.0 μg/ml三種濃度日內(nèi)、日間精密度RSD均小于4.0%，此方法精密度良好。

表1　日內(nèi)精密度結(jié)果(n=5)

表2　日間精密度結(jié)果(n=5)

2.3回收率 CS的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，2.0、6.0、10.0 μg/ml三種濃度的方法回收率在102%～105%之間，RSD小于4.0%，此法的回收率符合要求。

表3　CS的回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

2.4提取回收率 CS提取回收率結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，2.0、6.0、10.0 μg/ml三種濃度的方法提取回收率均大于80%，RSD小于3.0%，此法的提取回收率符合檢測(cè)要求。

2.5不同來(lái)源 CS樣品的提取回收率不同來(lái)源 CS的提取回收率結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，6.0 μg/ml濃度下豬CS、低分子量豬CS、鯊魚(yú)CS的提取回收率均大于83%，RSD小于2.0%，此法的回收率符合檢測(cè)要求。

表4　CS的提取回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

表5　不同來(lái)源CS樣品回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

3　討　論

目前CS的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[16-17]、毛細(xì)管電泳法[18-20]、光譜法[21-22]等幾種。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高效液相色譜法耗時(shí)短、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單，是中國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，但對(duì)儀器和試劑要求高，需要將CS酶解成CS二糖。毛細(xì)管電泳法耗時(shí)短、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單，但也需將CS降解呈CS二糖，且成熟度不及高效液相色譜法，直接測(cè)定則缺少相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品。光譜法中的Elson-Morgan法、硫酸咔唑法、間苯三酚法、天青A法在對(duì)大鼠血漿中CS的樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于血漿蛋白等種種因素影響提取回收率低，均不能滿足實(shí)驗(yàn)需求。本研究對(duì)1,9-二甲基亞甲基藍(lán)(DMMB)測(cè)定糖胺聚糖的方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用酶解、水飽和酚沉淀、冷凍干燥等方法消除了血漿中血紅蛋白及其他成分的影響，提高了CS的提取回收率，所建立的大鼠血液中CS含量的測(cè)定方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏能夠滿足實(shí)驗(yàn)的需求。

本實(shí)驗(yàn)所建立的大鼠血漿中CS的生物分析法，經(jīng)過(guò)方法學(xué)確證，在0～10 μg/ml的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998(n=5)，該方法的日內(nèi)精密度和日間精密度的 RSD均小于4%，回收率在102.0%～105.0%之間，提取回收率在80%以上。經(jīng)處理后血紅蛋白及血液中其他成分對(duì)測(cè)定的影響小，本基本滿足CS大鼠血漿藥物濃度檢測(cè)的需要，同時(shí)為CS大鼠藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了可靠的分析方法。

[1]Martin MS, Van Sell S, Danter J. Glucosamine and chondroitin: an appropriate adjunct treatment of symptomatic osteoarthritis of the knee[J].Orthop Nurs, 2012,31:160-166.

[2]Reginster JY. In people with hand osteoarthritis, chondroitin sulphate therapy for 6 months improves pain and function compared with placebo[J]. Evid Based Med, 2012.

[3]Campo GM, Avenoso A, Campo S, et al. Chondroitin-4-sulphate reduced oxidative injury in caerulein-induced pancreatitis in mice: the involvement of NF-kappaB translocation and apoptosis activation[J]. Exp Biol Med (Maywood), 2008,233:741-752.

[4]Campo GM, Avenoso A, Campo S, et al. The antioxidant activity of chondroitin-4-sulphate, in carbon tetrachloride-induced acute hepatitis in mice, involves NF-kappaB and caspase activation[J]. Br J Pharmacol, 2008,155:945-956.

[5]Herrero-Beaumont G, Marcos ME, Sanchez-Pernaute O, et al. Effect of chondroitin sulphate in a rabbit model of atherosclerosis aggravated by chronic arthritis[J].Br J Pharmacol, 2008,154:843-851.

[6]Moller I, Perez M, Monfort J, et al. Effectiveness of chondroitin sulphate in patients with concomitant knee osteoarthritis and psoriasis: a randomized, double-blind, placebo-controlled study[J].Osteoarthritis Cartilage, 2010,18 Suppl 1:S32-40.

[7]劉克為, 依荷巴麗遲, 呂靜. 鯊魚(yú)軟骨素聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌療效觀察[J].中國(guó)腫瘤臨床與康復(fù), 2009,30(3):167-169.

[8]Lin R, Rosahl TW, Whiting PJ, et al. 6-Sulphated chondroitins have a positive influence on axonal regeneration[J].PLoS One, 2011,6:e21499.

[9]Beeson JG, Andrews KT, Boyle M, et al. Structural basis for binding of Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 to chondroitin sulfate and placental tissue and the influence of protein polymorphisms on binding specificity[J].J Biol Chem, 2007,282:22426-22436.

[10]Monfort J, Nacher M, Montell E, et al. Chondroitin sulfate and hyaluronic acid (500-730 kda) inhibit stromelysin-1 synthesis in human osteoarthritic chondrocytes[H].Drugs Under Experimental and Clinical Research, 2005,31:71-76.

[11]Bergefall K, Trybala E, Johansson M, et al. Chondroitin sulfate characterized by the E-disaccharide unit is a potent inhibitor of herpes simplex virus infectivity and provides the virus binding sites on gro2C cells[J]. J Biol Chem, 2005,280:32193-32199.

[12]Kobayashi F, Yamada S, Taguwa S, et al. Specific interaction of the envelope glycoproteins E1 and E2 with liver heparan sulfate involved in the tissue tropismatic infection by hepatitis C virus[J]. Glycoconj J, 2012,29:211-220.

[13]Lai JY, Li YT, Cho CH, et al. Nanoscale modification of porous gelatin scaffolds with chondroitin sulfate for corneal stromal tissue engineering[J]. Int J Nanomedicine, 2012,7:1101-1114.

[14]Fan WX, Ma XH, Ge D, et al. Cryoprotectants for the vitrification of corneal endothelial cells[J].Cryobiology, 2009,58:28-36.

[15]Sim JS, Zhao HL, Li DW, et al. Effects of saponins from the root bark of Aralia elata on the transport of chondroitin sulfate in Caco-2 cell monolayers and rats[J].Biol Pharm Bull, 2005,28:1043-1048.

[16]Ji D, Roman M, Zhou J, et al. Determination of chondroitin sulfate content in raw materials and dietary supplements by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection after enzymatic hydrolysis: single-laboratory validation[J].Journal of AOAC International, 2006,90:659-669.

[17]Volpi N. High-performance liquid chromatography and on-line mass spectrometry detection for the analysis of chondroitin sulfates/hyaluronan disaccharides derivatized with 2-aminoacridone[J]. Analytical Biochemistry, 2010,397:12-23.

[18]Malavaki CJ, Asimakopoulou AP, Lamari FN, et al. Capillary electrophoresis for the quality control of chondroitin sulfates in raw materials and formulations[J].Analytical Biochemistry, 2008,374:213-220.

[19]Bendazzoli C, Liverani L, Spelta F, et al. Determination of dermatan sulfate and chondroitin sulfate as related substances in heparin by capillary electrophoresis[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010,53:1193-1200.

[20]Volpi N, Maccari F, Linhardt RJ. Quantitative capillary electrophoresis determination of oversulfated chondroitin sulfate as a contaminant in heparin preparations[J].Analytical Biochemistry, 2009,388:140-155.

[21]高貴珍, 焦慶才, 丁一磊, 等. 天青 A 分光光度法測(cè)定硫酸軟骨素含量的研究[J].光譜學(xué)與光譜分析,2003,23:600-602.

[22]傅應(yīng)華. 咔唑法測(cè)定鯊魚(yú)硫酸軟骨素含量的方法學(xué)研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2007,28:54-55.

A new quantitative assay for chondroitin sulfate in plasma

CHEN Na-na WANG Jian FANG Yu-xiao XIAO Yu-liang LI Yu-qin

(Pharmaceutical Sciences of Taishan Medical University, Taian 271000，China)

Objective: To establish a new method to determine the content of chondroitin sulfate in plasma. Methods: The plasma proteins were removed by the use of actinase E and water-lsaturated phenol, and the determination of plasma levels of chondroitin sulfate was determined with a modified 1,9-ldimethyl methylene blue method. Results: A good positive linear relationship was shown in the mass concentration range of chondroitin sulfate 0～10 μg/ml. The regression equation was y = 0.014x + 0.245,R2= 0.998. The RSDs of CS within-lday and between-lday were less than 4%, and the recovery of CS was in the range of 102.0%～105.0%. The extraction recovery of CS was greater than 80% (n=5). Conclusion: The assay is inexpensive, simple, precise, sensitive and suitable for the determination of chondroitin sulfate in plasma.

chondroitin sulfate; 1,9-ldimethylmethylene blue; plasma; determination

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃項(xiàng)目(J15LM08)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510439087)；山東省安全生產(chǎn)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2015-60)。

陳娜娜(1989—)，女，山東泰安人，碩士。

肖玉良(1977—)，男，山東青州人，副教授，博士，主要從事多糖類藥物研究，E-mail：111925wj@163.com。*為共同第一作者。

R914

A

1004-7115(2016)09-0975-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.09.004

2016-03-08)